地中海貧血產(chǎn)前遺傳篩查流程簡(jiǎn)化的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

肖奇志 李戀湘 謝建紅 李磊 王格 張婧惟 龍若庭 周玉球

·論著·

地中海貧血產(chǎn)前遺傳篩查流程簡(jiǎn)化的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

肖奇志 李戀湘 謝建紅 李磊 王格 張婧惟 龍若庭 周玉球★

目的評(píng)估全血細(xì)胞分析（fullblood count，F(xiàn)BC）結(jié)合常見地中海貧血（簡(jiǎn)稱地貧）基因檢測(cè)（簡(jiǎn)稱兩步法）取代傳統(tǒng)的FBC結(jié)合血紅蛋白（hemoglobin，Hb）分析和地貧基因檢測(cè)（簡(jiǎn)稱三步法）用于地貧產(chǎn)前遺傳篩查的可行性。方法采用回顧性分析的方法，對(duì)近2年（2014年1月1日至2015年12月31日）珠海市產(chǎn)前門診6 291名孕婦及其配偶FBC、Hb分析和地貧基因檢測(cè)的結(jié)果采用x2檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，比較兩步法和三步法在產(chǎn)前地貧遺傳篩查中的可靠性及經(jīng)濟(jì)性。結(jié)果以經(jīng)典的三步法作為標(biāo)準(zhǔn)，兩步法對(duì)孕婦及其配偶地貧檢測(cè)的靈敏度、特異性、陰性預(yù)測(cè)值和陽(yáng)性預(yù)測(cè)值以及總的診斷效率分別為98.25％、99.52％、85.98％、88.12％、91.23％，兩步法對(duì)血紅蛋白H（hemoglobin H，Hb H）病、輕型β-地貧、異常Hb和δβ-地貧/遺傳性持續(xù)性胎兒血紅蛋白綜合征（hereditary persistence of fetal hemoglobin，HPFH）的漏檢率分別為2.59％（2/77）、0.01％（2/1 695）、8.78％（13/148）和48.30％（43/89）。結(jié)論產(chǎn)前地貧遺傳篩查流程中采用三步法有其科學(xué)性，既可避免Hb H、異常Hb以及δβ-地貧/HPFH等個(gè)體的漏檢，還可為地貧DNA診斷指明方向。在未建立覆蓋中國(guó)人異常Hb病基因譜的分子篩查技術(shù)之前，兩步法暫不能取而代之。

地中海貧血；遺傳篩查；表型-基因型；血紅蛋白變異體

地中海貧血（簡(jiǎn)稱地貧）是一組由于珠蛋白基因缺失或功能障礙導(dǎo)致珠蛋白鏈缺失或合成不足所引起的遺傳性溶血性血液病，為中國(guó)南方各區(qū)的常見病和多發(fā)?。?］，嚴(yán)重類型地貧可致死或致殘，該病易防難治，目前已成為熱帶和亞熱帶地區(qū)一個(gè)重大的公共衛(wèi)生問(wèn)題。為此，2013年2月珠海市啟動(dòng)了免費(fèi)地貧干預(yù)項(xiàng)目并在具有地貧研究基礎(chǔ)和大人群預(yù)防控制經(jīng)驗(yàn)［2］的珠海市婦幼保健院建立了市級(jí)地貧篩查管理辦公室和市級(jí)地貧診斷中心，負(fù)責(zé)協(xié)調(diào)、管理、督導(dǎo)全市產(chǎn)前地貧的遺傳篩查、接收和檢測(cè)珠海市其他36家醫(yī)療保健機(jī)構(gòu)轉(zhuǎn)送的初篩陽(yáng)性標(biāo)本［平均紅細(xì)胞血紅蛋白（mean corpuscular hemoglobin，MCH）小于27 pg或/和平均紅細(xì)胞體積（mean corpuscular volume，MCV）小于82 fL］并負(fù)責(zé)嚴(yán)重類型地貧高風(fēng)險(xiǎn)胎兒的產(chǎn)前診斷和跟蹤隨訪。由于地貧遺傳篩查的網(wǎng)點(diǎn)多且分散，臨床實(shí)驗(yàn)室的水平又參差不齊，加之標(biāo)本轉(zhuǎn)運(yùn)的環(huán)節(jié)多和時(shí)間長(zhǎng)，經(jīng)常出現(xiàn)送檢標(biāo)本發(fā)生溶血現(xiàn)象，嚴(yán)重影響血紅蛋白（hemoglobin，Hb）分析的準(zhǔn)確度。為此，本研究擬采用全血細(xì)胞計(jì)數(shù)（fullblood count，F(xiàn)BC）結(jié)合地貧基因診斷（簡(jiǎn)稱“二步法”）替代世界地貧聯(lián)合會(huì)推薦的FBC結(jié)合Hb分析和地貧基因診斷［3-4］（簡(jiǎn)稱“三步法”）以簡(jiǎn)化地貧遺傳篩查技術(shù)流程，并以三步法作為標(biāo)準(zhǔn)，以評(píng)估其可行性和可能存在的技術(shù)風(fēng)險(xiǎn)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源

收集2014年1月1日至2015年12月31日珠海市37家產(chǎn)科服務(wù)機(jī)構(gòu)送檢的地中海貧血篩查標(biāo)本共6 291對(duì)，排除了僅檢測(cè)孕婦或配偶一方的未配對(duì)標(biāo)本。所有標(biāo)本均于抽血當(dāng)天在全市37家產(chǎn)科服務(wù)醫(yī)療機(jī)構(gòu)進(jìn)行血細(xì)胞分析。夫妻雙方中只要一方紅細(xì)胞指數(shù)異常（MCV＜82 fL或/和MCH＜27 pg）即納入地貧初篩陽(yáng)性夫妻，填寫相關(guān)資料并將夫妻雙方標(biāo)本轉(zhuǎn)運(yùn)至珠海市地貧診斷中心進(jìn)行統(tǒng)一檢測(cè)。

1.2 血紅蛋白分析

采用美國(guó)Bio-Rad生產(chǎn)的儀器、配套試劑和質(zhì)控品，按照說(shuō)明書進(jìn)行操作，并按照Hb各組分的洗脫時(shí)間初步進(jìn)行異常血紅蛋白的鑒定。

1.3 常見α-地貧突變的檢測(cè)

所有標(biāo)本采用單管多重PCR法和反向點(diǎn)雜交法［5］分別檢測(cè)中國(guó)人4種常見的缺失型（--SEA，-α4.2，-α3.7，--THAI）和3種非缺失型（αCS、αQS和αWS）α-地貧突變。α-地貧基因檢測(cè)試劑盒分別由深圳益生堂生物企業(yè)有限公司和亞能生物技術(shù)（深圳）有限公司生產(chǎn)，嚴(yán)格按照其提供的使用說(shuō)明書進(jìn)行操作、質(zhì)量控制和結(jié)果判斷。PCR儀為Bio-Rad CFX96產(chǎn)品，分子雜交儀則由美國(guó)Robbin Scientific公司生產(chǎn)。

1.4 常見β-地貧點(diǎn)突變的檢測(cè)

采用反向點(diǎn)雜交法和探針熔解曲線法分別檢測(cè)中國(guó)人常見的17種和23種β-地貧突變［6］，試劑盒分別由深圳益生堂生物企業(yè)有限公司和廈門致善生物科技有限公司生產(chǎn)。所用設(shè)備同上。

1.5 少見類型地貧和異常血紅蛋白基因檢測(cè)

對(duì)于地貧表型陽(yáng)性和/或有異常血紅蛋白表型但未檢出常見地貧型，δβ-地貧和遺傳性持續(xù)性胎兒血紅蛋白（hereditary persistence of fetal hemoglobin，HPFH）綜合征的孕婦及其配偶，則將其標(biāo)本送至深圳華大基因公司做進(jìn)一步DNA測(cè)序法以明確診斷。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。對(duì)于試驗(yàn)診斷評(píng)價(jià)指標(biāo)，以三步法作為標(biāo)準(zhǔn)，分別計(jì)算二步法的靈感度、特異度、陰性預(yù)測(cè)值和陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和總的診斷效率，并采用x2檢驗(yàn)比較兩組間各診斷指標(biāo)之差異，以α=0.05為水準(zhǔn)，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Hb分析的結(jié)果

從上述所送檢的標(biāo)本中，Hb分析檢測(cè)陽(yáng)性特征性結(jié)果中有：快泳帶；慢泳帶；血紅蛋白A2（Hb A2）≥3.5％（β-地貧特征）；血紅蛋白F（Hb F）升高（≥2.0％）等，分類詳見表1。

表1 Hb分析的結(jié)果Table 1 The results of hemoglobin analysis

2.2 兩步法與三步法檢測(cè)結(jié)果的比較

由于檢測(cè)和內(nèi)容方式一樣，二步法和三步法對(duì)于疑為α-地貧特征和紅細(xì)胞指數(shù)正常個(gè)體的診斷效率均完全相同，但在檢測(cè)如下3類標(biāo)本時(shí)，則容易出現(xiàn)漏檢：Hb變異體時(shí)（包括Hb快泳帶和慢泳帶）；（Hb F≥2.0％但Hb A2＜3.5％）即表型為δβ-地貧/HPFH和少見類型β-地貧特征，具體結(jié)果詳見表2。

表2 二步與三步檢測(cè)法結(jié)果的比較Table 2 The results of two-step method compared with that of three-step method

2.3 兩步法與三步法檢測(cè)結(jié)果對(duì)篩出嚴(yán)重類型高風(fēng)險(xiǎn)胎兒的影響

在上述6 291對(duì)孕婦及配偶中，二步法和三步法均篩出146個(gè)α-地貧高風(fēng)險(xiǎn)胎兒，但二步法只檢出47個(gè)高風(fēng)險(xiǎn)重型β-地貧胎兒中的46個(gè)（97.87％）（χ2=1.01，P=0.314），二步法漏檢了其中一對(duì)夫妻，其中一方為輕型β-地貧，另一方為HbQ病，為穩(wěn)妥起見，建議進(jìn)行產(chǎn)前診斷。

2.4 兩步法與三步檢測(cè)法的成本和時(shí)間分析

兩步法與三步法相比，省略了Hb分析這一步驟，需要對(duì)所有小紅細(xì)胞癥進(jìn)行α-和β-地貧基因診斷，增加β-地貧基因診斷數(shù)量，整體費(fèi)用和耗費(fèi)時(shí)間詳見表3。

3 討論

產(chǎn)前篩查地貧一般遵循三步法原則：FBC是地貧初篩的第一關(guān)，Hb分析用于地貧表型初步分類和檢測(cè)異常Hb區(qū)帶［包括血紅蛋白H（Hb H）］，而地貧基因診斷是對(duì)Hb分析后的標(biāo)本進(jìn)行有針對(duì)性地確定診斷或排除診斷，這也是經(jīng)典的遺傳病診斷模式。地貧僅屬于血紅蛋白病的一種，還包括異常Hb病和δβ-地貧及HPFH等，這些突變也影響血紅蛋白的合成速率或質(zhì)量，其某些類型與地貧復(fù)合也可能造成比較嚴(yán)重的影響，在臨床實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)引起廣泛關(guān)注［1，7］。

表3 兩步法與三步法篩查的總費(fèi)用與耗費(fèi)時(shí)間比較Table 3 The total costand time of two-stepmethod compared with thatof three-stepmethod

在產(chǎn)前地貧篩查中三步法與兩步法的區(qū)別在于是否進(jìn)行Hb分析，它能定量分析Hb A2，Hb F，Hb H和異常Hb等成分，對(duì)進(jìn)一步明確基因診斷方法，確定表型有指示作用。從12 582份標(biāo)本來(lái)看，有陽(yáng)性表征（FBC+Hb分析）的占58.89％（7 410/12 582），Hb分析有特征性陽(yáng)性表征占16.04％（2 019/12 582），它能鑒定的主要特征性有：β-地貧、Hb H病、中間型β-地貧、異常Hb病和δβ-地貧/HPFH特征，各占比為13.49％、0.67％、0.01％、1.18％和0.70％。按兩步法不進(jìn)行Hb分析，漏檢HbH病中的一種少見或罕見突變，漏檢率為2.44％；漏檢全部異常Hb?。ò▎渭冃訦b和合并地貧的異常Hb）；漏檢全部HPFH及δβ-地貧；上述3種表型漏檢總和占比為1.90％，總漏檢率較低。由于地貧基因型檢測(cè)為相同方法和技術(shù)，所以兩步法與三步法差別在于漏檢了2例HbH病中的一種少見或罕見突變和2例β-地貧特征者，導(dǎo)致最終判斷不同。

在地貧遺傳中夫妻雙方同等重要，所以漏檢分情況來(lái)看：如果漏檢個(gè)體其配偶FBC正常，也排除攜帶常見地貧突變類型，即使有漏檢情況發(fā)生，不產(chǎn)生嚴(yán)重后果，無(wú)需產(chǎn)前診斷，在地貧防控中不影響效果，本研究中占比為93.33％；如果漏檢個(gè)體其配偶為地貧，特別是β-地貧，考慮到胎兒有機(jī)會(huì)攜帶β-地貧復(fù)合異常Hb病或復(fù)合HPFH及δβ-地貧，進(jìn)行產(chǎn)前診斷較為穩(wěn)妥，在本次研究中占6.67％。，當(dāng)然除血紅蛋白E（Hb E）外的其它異常血紅蛋白病，在中國(guó)人群中的攜帶率很低，絕大多數(shù)合并地貧后很少加重臨床表現(xiàn)，僅有一些個(gè)案報(bào)道［8-9］。總的來(lái)說(shuō)2種方式的防控效果基本一致。

需要注意的是：無(wú)論是三步法還是二步法，均無(wú)法對(duì)表2中的146例疑似α-地貧標(biāo)本進(jìn)行突變的有效檢出，在排除缺鐵性貧血等其它導(dǎo)致小細(xì)胞低色素疾病的情況下，對(duì)存在地貧表型的標(biāo)本進(jìn)行更進(jìn)一步檢測(cè)，特別是夫妻一方為已知地貧，另一方有小細(xì)胞低色素癥但未檢測(cè)出已知突變，更要特別留意。

地貧防控作為公共衛(wèi)生問(wèn)題，財(cái)政的支付能力也需要考慮，如果三步法改為兩步法，減少了Hb分析，但需對(duì)所有小細(xì)胞低色素的個(gè)體需要進(jìn)行常見β-地貧基因突變檢測(cè)，一方面增加了基因檢測(cè)量，另一方也能最大限度避免β-地貧合并α-地貧個(gè)體的漏檢。改變后整個(gè)預(yù)防控制費(fèi)用下降10.54％，從李兵等［10-11］比較篩查的不同組合形式看，無(wú)論對(duì)α-地貧還是β-地貧地貧的篩查方案，傳統(tǒng)三步法的費(fèi)用都處于較高水平。另嚴(yán)重溶血標(biāo)本對(duì)Hb分析有影響，而對(duì)基因檢測(cè)沒(méi)有影響。減少Hb分析，整個(gè)操作流程更暢通，預(yù)計(jì)整個(gè)檢測(cè)時(shí)長(zhǎng)下降25％，這對(duì)臨床檢測(cè)也工作非常重要。

臨床上常見類型地貧基因檢測(cè)技術(shù)經(jīng)過(guò)多年的發(fā)展，在方法、技術(shù)、儀器和流程上都取得長(zhǎng)足進(jìn)步的時(shí)候，建立了許多高通量、全自動(dòng)、快速、準(zhǔn)確的實(shí)用臨床應(yīng)用技術(shù)，將異常Hb病和δβ地貧及HPFH相關(guān)基因整合到地貧相關(guān)基因突變譜中進(jìn)行檢測(cè)是可行的［12-13］。自動(dòng)化核酸提取儀的應(yīng)用助推分子診斷朝快速、高通量、高效的方向發(fā)展。

隨著對(duì)地貧的認(rèn)識(shí)進(jìn)一步深入、地貧基因檢測(cè)技術(shù)發(fā)展和覆蓋突變譜的提升、核酸提取儀的廣泛使用、高通量基因分析儀的推廣和分子診斷試劑價(jià)格下降，為在地貧預(yù)防控制與診斷中全面采用分子診斷技術(shù)創(chuàng)造了有利條件。中山地區(qū)也采用了兩步法進(jìn)行試驗(yàn)［14］，香港地區(qū)的經(jīng)驗(yàn)也驗(yàn)證了這一模式的有效性［15-16］。所以未來(lái)在大人群防控體系中采用二步法代替三步法是一種節(jié)約資源、加快速度、不影響效果的做法。

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The risk assessment of prenatal genetic screening procedure simplified for thalassemias

XIAO Qizhi，LI Lianxiang，XIE Jianhong，LI Lei，WANG Ge，ZHANG Jingwei，LONG Ruoting，ZHOU Yuqiu★
（Zhuhai Institute of Medical Genetics＆amp;Department of Clinical Laboratory，Zhuhai Municipal Maternity and Child Healthc are Hospital，Zhuhai，Guangdong，China，519001）

Objectives To evaluate the feasibility of prenatal genetic screening for thalassemias by full blood cell analysis（full blood count，F(xiàn)BC）combined with thalassemia gene detection（hereinafter referred to as the two-step method）instead of the FBC combined with hemoglobin（Hb）analysis and thalassemia gene detection（hereinafter referred to as the three-step method）.Methods The results of FBC and Hb analysis as well as molecular diagnosis of thalassemias of 6 291 pregnant women and their spouses from January 1，2014 to December 31，2015，atantenatal clinics of ZhuhaiCity were analyzed retrospectively byχ2test.The reliability and economic viability of the two-step method were compared with the three-step method of prenatal genetic screening for thalassemias.Results Taking the classic three-step method as a standard，the sensitivity，specificity，negative predictive value and positive predictive value，and accuracy of the two-step method were 98.25％，99.52％，85.98％，88.12％，91.23％，respectively.The rate of missed diagnosis of the two-step method to HbH disease，β-thalassemia trait，Hb variants and δβ thalassemia/hereditary persistence of fetal hemoglobin（HPFH）were 2.59％（2/77），0.01％（2/1 695），8.78％（13/148），and 48.30％（43/89）respectively.Conclusions Prenatal genetic screening process of thalassemia with three-step method has its adavantages.It can avoidfailure of detection of not just HbH disease and Hb variants but alsoδβ-thalassemias/HPFH，and what's more point to clear direction for DNA diagnosis of thalassemias.The three-step method tentatively can't be replaced by the two-step method.

Thalassemia；Genetic screening；Phenotype-genotype；Hemoglobin（Hb）variants

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2009A030301002）；珠海市衛(wèi)生和計(jì)劃生育局醫(yī)學(xué)科研項(xiàng)目（2014062）

珠海市婦幼保健院檢驗(yàn)科＆amp;珠海市醫(yī)學(xué)遺傳研究所，廣東，珠海519001

★通迅作者：周玉球，E-mail：zhzhouyq@126.com