NF-κB熒光素酶報告基因系統(tǒng)的構(gòu)建及驗證

郭志蘭，車路陽，李晶哲，孫震曉，劉長振

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NF-κB熒光素酶報告基因系統(tǒng)的構(gòu)建及驗證

郭志蘭1,2，車路陽3，李晶哲2，孫震曉1，劉長振2

1 北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100102;2 中國中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗中心北京市重點實驗室，北京 100700;3 中國人民解放軍總醫(yī)院骨科，北京 100853

為了定量檢測NF-κB的活化效果及篩選與NF-κB活化調(diào)控相關(guān)的藥物，通過去除逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pQCXIP原有的CMV啟動子，并分別插入NF-κB增強子序列及熒光素酶NanoLuc報告基因序列，構(gòu)建了一種新的含有NF-κB增強子序列和NanoLuc (NLuc) 報告基因序列的表達載體，并進一步建立受NF-κB調(diào)控的穩(wěn)定表達NLuc熒光素酶的細(xì)胞系。酶切鑒定及測序結(jié)果表明成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pQCXIP-NF-κB-NLuc；NF-κB信號通路的刺激物腫瘤壞死因子TNF-α作用于構(gòu)建的穩(wěn)定表達NLuc的細(xì)胞系后出現(xiàn)特異性的熒光素酶反應(yīng)，且該酶反應(yīng)與TNF-α的刺激呈良好的時間、劑量依賴性，該結(jié)果表明受NF-κB調(diào)控的穩(wěn)定表達NLuc熒光素酶的細(xì)胞系構(gòu)建成功。實例驗證中，NF-κB抑制劑雷公藤甲素對此細(xì)胞系NLuc熒光素酶表達的抑制呈劑量效應(yīng)。綜上，本實驗構(gòu)建的受NF-κB調(diào)控的穩(wěn)定表達NLuc熒光素酶的報告基因系統(tǒng)可用于NF-κB的活化效果的定量檢測及篩選與NF-κB活化調(diào)控相關(guān)的藥物，具有研究和應(yīng)用價值。

NF-κB，熒光素酶NanoLuc，報告基因系統(tǒng)

NF-κB (Nuclear factor-κB) 作為一種核轉(zhuǎn)錄因子能夠與多種基因啟動子區(qū)的特定核苷酸序列結(jié)合從而啟動下游基因轉(zhuǎn)錄，在免疫、炎癥、氧化應(yīng)激、細(xì)胞增殖與凋亡等生理病理過程中起重要調(diào)控作用[1]。NF-κB蛋白家族包括p50、p52、p65 (RelA)、RelB、c-Rel 五個亞基，其功能狀態(tài)通常為這些亞基形成的同源或異源二聚體，其中最常見的NF-κB二聚體為p65與p50組成的異二聚體。在胞漿中，這些NF-κB二聚體常常以與IκB結(jié)合的形式存在，處于非活性狀態(tài)，在上游信號促使IκB降解后進入細(xì)胞核參與下游基因的表達調(diào)控。另外胞漿中還存在一些非活性的NF-κB前體蛋白二聚體。這些前體蛋白通過非經(jīng)典途徑剪切成相應(yīng)有活性的NF-κB二聚體，進而入核參與下游基因的表達調(diào)控[2-3]。研究表明，人體許多疾病如阿爾茲海默癥、糖尿病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、哮喘及一些癌癥等均與NF-κB的失調(diào)相關(guān)[4-10]，因此，NF-κB蛋白家族及其在人類疾病的發(fā)生發(fā)展與預(yù)防治療中所扮演的角色等一直是研究的熱點。

報告基因 (Reporter gene) 是一種編碼易于被檢測的蛋白質(zhì)或酶的基因。該基因序列可以插入到基因表達調(diào)節(jié)序列 (如啟動子、增強子) 之后形成嵌合基因，或與其他目的基因序列相連接形成融合蛋白的基因序列，進而通過檢測該報告基因的表達來定性或定量測定目的基因的表達情況。常用的報告基因有氯霉素轉(zhuǎn)乙酰酶、β-半乳糖苷酶、熒光素酶以及熒光蛋白等[11]。本實驗室選用的NanoLuc (NLuc) 是一種人工改造的熒光素酶，其分子量小 (19.1 kDa，171個氨基酸)，熱穩(wěn)定性高，沒有翻譯后修飾或二硫鍵；其發(fā)光強度與螢火蟲熒光素酶或海腎螢光素酶相比強100倍，且其反應(yīng)不依賴ATP[12]。這些優(yōu)點使得NLuc成為目前較理想的報告基因之一。

本實驗室期望通過對現(xiàn)有逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的改造，構(gòu)建一種新的含有NF-κB增強子序列和NLuc報告基因序列的表達載體，并進一步構(gòu)建受NF-κB調(diào)控的穩(wěn)定表達NLuc熒光素酶的細(xì)胞系。該細(xì)胞系可被用于NF-κB活化狀態(tài)定量檢測和與NF-κB活化調(diào)控相關(guān)的藥物的篩選之中。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、細(xì)胞株和質(zhì)粒

感受態(tài)大腸桿菌DH5α購自天根生化科技 (北京) 有限公司；人胚腎上皮包裝細(xì)胞GP2-293、人宮頸癌細(xì)胞系HeLa由本實驗室保存；pQCXIP載體購自Clontech公司；NF-κB增強子序列、NLuc序列及TATA box序列由北京普爾普樂生物科技有限公司合成。

1.1.2 主要試劑

限制性內(nèi)切酶、連接酶購自Fermentas 公司；腫瘤壞死因子TNF-α購自Peprotech公司；雷公藤甲素(Triptolide) 購自南通飛宇生物科技有限公司；腔腸素購自Sigma公司；質(zhì)粒小提試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒均購自天根生化科技 (北京) 有限公司；DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司、胎牛血清購自HyClone公司。

1.2 方法

1.2.1 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pQCXIP-NF-κB-NLuc的構(gòu)建及其鑒定

逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pQCXIP原有CMV啟動子的去除、NF-κB增強子和TATA box序列的裝入，以及熒光素酶NLuc基因序列的裝入如圖1所示。首先將pQCXIP利用Ⅱ、Ⅰ進行雙酶切，去除pQCXIP原有CMV啟動子，然后將合成的含有轉(zhuǎn)錄因子NF-κB增強子和TATA box序列 (序列如表1所示，兩端含有Ⅱ和Ⅰ的酶切位點) 的DNA片段經(jīng)Ⅱ、Ⅰ雙酶切裝載入改造后的pQCXIP質(zhì)粒上。NanoLuc (序列如表1所示，兩端含有Ⅰ和R Ⅰ的酶切位點) 與上述得到的pQCXIP-NF-κB質(zhì)粒分別用Ⅰ、R Ⅰ進行雙酶切，連接并轉(zhuǎn)化獲得重組的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pQCXIP-NF-κB- NLuc。本實驗合成的NanoLuc序列的N端部分含有分泌信號肽，可幫助蛋白分泌到細(xì)胞外的培養(yǎng)基中。同時，我們構(gòu)建了去除NF-κB增強子 (保留TATA box) 的質(zhì)粒pQCXIP-TATA- NLuc作為對照載體。構(gòu)建的質(zhì)粒經(jīng)華大基因測序表明序列正確。

1.2.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染與病毒制備

人胚腎上皮包裝細(xì)胞GP2-293用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)、傳代。構(gòu)建的pQCXIP-NF-κB-NLuc質(zhì)粒及對照質(zhì)粒pQCXIP-TATA-NLuc與pVSV-G病毒包裝質(zhì)粒利用lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑按操作說明共轉(zhuǎn)染入GP2-293細(xì)胞，其中質(zhì)粒與lipofectamine 2000質(zhì)量體積比在預(yù)實驗后選用轉(zhuǎn)染效果較好的1∶2。轉(zhuǎn)染5 h后培養(yǎng)基更換成新鮮DMEM+10% FBS完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，48 h后收集含病毒上清，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，分裝。

圖1 pQCXIP-NF-κB-NLuc的構(gòu)建示意圖

表1 NF-κB-TATA box和NanoLuc序列

1.2.3 病毒侵染

人宮頸癌細(xì)胞HeLa以2×105/孔接種于6孔板中，在DMEM+10% FBS培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。24 h后，將上述制備的含病毒上清1 mL與2 mL新鮮完全培養(yǎng)基及polybrene (8 μg/mL) 加至HeLa細(xì)胞，并于32 ℃、1 800×(Beckman Allegra X15R) 水平離心機中離心 90 min，37 ℃靜置5 h，再更換成新鮮DMEM+10% FBS培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.4 穩(wěn)定表達單克隆的篩選

病毒侵染48 h后，HeLa細(xì)胞中加入3 μg/mL嘌呤霉素 (Puromycin) 進行篩選。24 h后將嘌呤霉素濃度降低到1 μg/mL維持抗性。4 d后，將存活細(xì)胞計數(shù)并按１個細(xì)胞/孔分配至96孔板中。兩周后，將其中的單克隆細(xì)胞株繼續(xù)放大培養(yǎng)。所獲得的細(xì)胞株記為PP-NF-κB- NLuc-HeLa以及PP-TATA-NLuc-HeLa。

1.2.5 穩(wěn)定表達細(xì)胞系有效性驗證

將上述獲得的穩(wěn)定表達細(xì)胞分別進行細(xì)胞計數(shù)，以2×104/孔加入96孔板中。24 h后加入NF-κB信號通路的刺激物腫瘤壞死因子TNF-α，濃度分別為0、5和10 ng/mL，每組設(shè)5個復(fù)孔。加藥24 h后，取培養(yǎng)基上清，加入3 μmol/L底物腔腸素(Coelenterazine)，使用化學(xué)發(fā)光儀 (BioTek Synergy 2) 檢測發(fā)光值。此外，針對PP-NF-κB-NLuc-HeLa細(xì)胞系進行了0.1、0.5和2.5 ng/mL三個濃度的TNF-α分別刺激3、6、9、12和24 h的效果檢測。

1.2.6 陽性藥物雷公藤甲素的抑制

穩(wěn)定表達的PP-NF-κB-NLuc-HeLa細(xì)胞系計數(shù)，以2×104/孔加入96孔板中。24 h后加入2.5 ng/mL TNF-α (除空白組) 刺激8 h，再分別加入0、0.25、1、4 ng/mL雷公藤甲素共刺激12 h，取培養(yǎng)基上清檢測發(fā)光值。

2 結(jié)果與分析

2.1 pQCXIP-NF-κB-NLuc質(zhì)粒的構(gòu)建

理論上逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pQCXIP的CMV啟動子部分的長度為 (680 bp)。在本研究中，pQCXIP經(jīng)Ⅱ、Ⅰ雙酶切后，瓊脂糖電泳結(jié)果表明 (圖2A)，680 bp位置處出現(xiàn)一條明顯的核酸條帶，而其上的核酸條帶位置與理論去除CMV啟動子部分的pQCXIP位置 (6.5 kb) 相近，因此可以判斷獲得了去除CMV啟動子的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pQCXIP。接下來我們將Ⅱ、Ⅰ雙酶切后的NF-κB增強子/TATA box序列與改造的pQCXIP進行連接和轉(zhuǎn)化。利用Ⅱ、Ⅰ雙酶切鑒定表明 (圖2B)，雙酶切得到的核酸條帶與理論插入的NF-κB增強子/TATA box序列條帶 (242 bp) 大小吻合，說明已構(gòu)建獲得重組質(zhì)粒pQCXIP-NF-κB。隨后將NLuc與重組質(zhì)粒pQCXIP-NF-κB經(jīng)Ⅰ、R Ⅰ雙酶切、連接和轉(zhuǎn)化，并經(jīng)Ⅱ、R Ⅰ雙酶切鑒定(圖2C)，結(jié)果表明NLuc序列被成功插入pQCXIP-NF-κB中，獲得了目標(biāo)質(zhì)粒pQCXIP- NF-κB-NLuc。該質(zhì)粒經(jīng)測序證明序列完全正確。

圖2 pQCXIP-NF-κB-NLuc重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

2.2 NF-κB-NLuc穩(wěn)定表達細(xì)胞系的構(gòu)建

隨后，將構(gòu)建的pQCXIP-NF-κB-NLuc質(zhì)粒與pVSV-G病毒包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染GP2-293細(xì)胞獲得逆轉(zhuǎn)錄病毒，并將該病毒侵染HeLa細(xì)胞。經(jīng)過嘌呤霉素篩選及單克隆分離，成功地獲得了NF-κB-NLuc單克隆穩(wěn)定表達細(xì)胞系。按同樣方案也成功地獲得了對照組細(xì)胞TATA-NLuc單克隆穩(wěn)定表達細(xì)胞系。兩組細(xì)胞系在加入NF-κB信號通路的刺激物TNF-α刺激24 h后進行了NLuc酶活性檢測。結(jié)果表明 (圖3)，在5 ng/mL和10 ng/mL TNF-α作用下，NF-κB-NLuc組細(xì)胞上清中的酶活性上升，分別為0 ng/mL TNF-α組細(xì)胞酶活性的6和11倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (*<0.05；**<0.01)。而在5 ng/mL和10 ng/mL TNF-α作用下，對照組TATA-NLuc細(xì)胞上清中的酶活性與0 ng/mL TNF-α組細(xì)胞酶活性相比無顯著差異。此外，NF-κB-NLuc組細(xì)胞在0.5及2.5 ng/mL濃度的TNF-α刺激不同時間段下呈良好的線性增長趨勢 (圖4)。這些結(jié)果說明，我們成功地構(gòu)建獲得針對NF-κB活化檢測的NLuc熒光素酶報告基因系統(tǒng)。

圖3 TNF-α對PP-NF-κB-NLuc-HeLa及PP-TATA- NLuc-HeLa細(xì)胞系的刺激作用

2.3 NF-κB熒光素酶報告基因系統(tǒng)對藥物檢測能力的驗證

進一步嘗試?yán)靡阎种芅F-κB活化的藥物雷公藤甲素來驗證NF-κB熒光素酶報告基因系統(tǒng)對藥物的檢測能力。CCK-8檢測實驗表明 (圖5)，2.5 ng/mL TNF-α 以及0.25-1 ng/mL雷公藤甲素都未對細(xì)胞活力產(chǎn)生明顯影響，在雷公藤甲素濃度為4 ng/mL時僅有少量影響。隨后熒光素酶活性檢測表明 (圖6)，2.5 ng/mL TNF-α使得細(xì)胞上清的酶活性上升了4.3倍，而加入不同濃度的雷公藤甲素均能抑制TNF-α促使的熒光素酶活性增加，在4 ng/mL濃度時對TNF-α誘導(dǎo)活化的NF-κB抑制率為53%，且抑制作用呈劑量效應(yīng)。

圖4 各種濃度TNF-α在不同時間段刺激PP-NF- κB-NLuc-HeLa細(xì)胞系的結(jié)果

圖5 CCK-8法檢測TNF-α與各種濃度雷公藤甲素對細(xì)胞活力的影響

圖6 雷公藤甲素抑制TNF-α誘導(dǎo)的PP-NF-κB- NLuc-HeLa細(xì)胞系中NLuc的表達

3 討論

在本研究中，我們通過對逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pQCXIP的改造，去除了原有的CMV啟動子，并且裝載入NF-κB增強子序列和NLuc報告基因序列，成功構(gòu)建了重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pQCXIP-NF-κB-NLuc。利用該載體包裝獲得了逆轉(zhuǎn)錄病毒，使其侵染HeLa細(xì)胞，再經(jīng)過藥物篩選最終獲得了NF-κB-NLuc穩(wěn)定表達細(xì)胞系。NF-κB信號通路刺激物TNF-α和NF-κB活化抑制藥物雷公藤甲素檢測構(gòu)建細(xì)胞的熒光素酶活性變化表明，我們成功地構(gòu)建獲得針對NF-κB活化檢測的NLuc熒光素酶報告基因系統(tǒng)。

當(dāng)前，包括NF-κB信號通路在內(nèi)的多種信號通路報告基因檢測系統(tǒng)主要來源于Promega和Invitrogen等商業(yè)公司。這些公司提供的相關(guān)質(zhì)粒、病毒所構(gòu)建的報告基因系統(tǒng)雖然成熟、穩(wěn)定，但也因其序列固定限制了研究者對構(gòu)建的報告基因系統(tǒng)的調(diào)整和完善，以及在特定情況下的使用。本研究提供了一套可行的針對NF-κB活化檢測的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的改造和重組方案，并成功地獲得了相應(yīng)的熒光素酶報告基因系統(tǒng)。研究中對所用的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pQCXIP的改造和重組尚無相關(guān)報道，具有一定的科研價值。同時本研究中所構(gòu)建的載體還可根據(jù)后續(xù)的科研要求對NF-κB反應(yīng)元件序列、TATA box序列和報告基因NLuc序列進行自由改造，并可引入其他轉(zhuǎn)錄因子的反應(yīng)元件，因此可為后續(xù)科研工作提供研究基礎(chǔ)，以及為其他研究者的相關(guān)載體改造工作提供一定的借鑒。

在發(fā)現(xiàn)了RelA/p65與c-Rel以及它的致癌性衍生物v-Rel之間存在同源性后，NF-κB與癌癥之間存在關(guān)聯(lián)性的設(shè)想就被提出[13]。流行病學(xué)研究的大量數(shù)據(jù)證實了這一設(shè)想，并進一步促使研究者們?nèi)ヌ骄縉F-κB與癌癥之間的作用機制?；贜F-κB與癌癥之間的關(guān)聯(lián)性，以NF-κB及其信號通路為靶標(biāo)的藥物被研制以用于腫瘤的預(yù)防與治療。如DHMEQ (Dehydroxymethylepoxyquinomicin)，一種新型的NF-κB抑制劑，在乳腺癌[14-15]、肝癌[16-17]、多發(fā)性骨髓瘤[18]的體內(nèi)外實驗中均展現(xiàn)出較好的抑制腫瘤生長及促凋亡效果，并可有效協(xié)同化療藥物或放射療法起到抗腫瘤的作用[19-22]。此外，針對NF-κB設(shè)計的一些小分子、單克隆抗體及激動劑等在治療或預(yù)防2型糖尿病、代謝綜合征、心血管疾病以及HIV潛伏感染[23-24]等均取得了一定進展。如上所述，研制和篩選新型NF-κB信號通路抑制劑在多種重大疾病的治療和預(yù)防上都具有重要的價值和廣闊的應(yīng)用前景。已有報道表明，NF-κB-NLuc報告基因系統(tǒng)是篩選調(diào)節(jié)NF-κB活性的藥物植物單體或提取物的有力的、便捷的工具。Orlando 等[25]利用Panomics公司的293T/NF-κB-luc細(xì)胞系對西班牙國家常用的20種草藥抗炎活性進行了初步判斷。Ajit等[26]利用DI TNC1 (永生化大鼠星型膠質(zhì)瘤細(xì)胞)/NF-κB-luc細(xì)胞系對一系列植物單體或提取物進行了抗炎活性檢測。我國中醫(yī)藥文化博大精深，中藥等藥物植物資源極為豐富。本研究構(gòu)建的NF-κB-NLuc報告基因系統(tǒng)在提供了一套可行的針對NF-κB活化檢測的載體改造、重組方案的同時，還可用于快速、高通量地篩選中藥資源庫，以便捷的方式獲得NF-κB信號通路抑制劑，因此具有一定的研究和應(yīng)用價值。

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(本文責(zé)編 陳宏宇)

Construction and verification of NF-κB luciferase reporter gene system

Zhilan Guo1,2, Luyang Che3, Jingzhe Li2, Zhenxiao Sun1, and Changzhen Liu2

1,,100102,2,,,100700,3,,100853,

To quantify the transcriptional activity of NF-κB and to screen drugs related to the regulation of NF-κB activation, we constructed a recombinant plasmid through deleting the original CMV promoter of retrovirus vector pQCXIP and inserting the NF-κB enhancer and NanoLuc luciferase sequence into the vector. Then, using the recombinant plasmid we constructed a cell line in which the expression of NanoLuc luciferase (NLuc) was regulated by NF-κB. The inserted sequences were verified by restriction endonuclease digestion and sequencing. Tumor necrosis factor-α (TNF-α), an NF-κB activator, acted on the constructed NLuc cell line and leaded to the specific luciferase reaction. The luciferase reaction showed a fine time and dose dependence to the TNF-α stimulation, indicating the successful construction of the NF-κB regulated NLuc-expressing cell line. Besides, the NF-κB inhibitor, triptolide, reduced the expression of NLuc in a dose-dependent way. The constructed reporter system in this study could be applied in the quantification of the NF-κB transcriptional activity and in the NF-κB regulation-related drug screening.

NF-κB, NanoLuc luciferase, reporter gene system

May 5, 2016; Accepted:June 20, 2016

s:Changzhen Liu. Tel: +86-10-64089526; E-mail: lcz0220@163.com

Zhenxiao Sun. Tel: +86-10-84738646; E-mail: sunzxcn@hotmail.com

Supported by:National Natural Science Foundation of China (Nos. 31170829, 81171762, 81550017, 81473418), Research Project of CACMS (No. zz2015015).

國家自然科學(xué)基金 (Nos. 31170829，81171762，81550017，81473418)，中國中醫(yī)科學(xué)院自主選題項目 (No. zz2015015) 資助。