表達(dá)耐輻射異常球菌IrrE蛋白對產(chǎn)丁二酸大腸桿菌耐滲透壓的影響

朱興貴，吳明科，馬江鋒，高有軍，陳美麗，姜岷

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表達(dá)耐輻射異常球菌IrrE蛋白對產(chǎn)丁二酸大腸桿菌耐滲透壓的影響

朱興貴1，吳明科1，馬江鋒1，高有軍2，陳美麗1，姜岷1

1 南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院材料化學(xué)工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京 211816;2 常茂生物化學(xué)工程股份有限公司，江蘇常州 213034

高滲透壓脅迫是降低生物法制備丁二酸生產(chǎn)效率的關(guān)鍵因素之一。為提高丁二酸生產(chǎn)菌株對高滲透壓脅迫的耐受性能，本研究考察了外源引入全局調(diào)控蛋白IrrE提高大腸桿菌耐高滲透壓脅迫性能的可行性。試驗(yàn)結(jié)果表明，在不同濃度Na+脅迫下，重組菌生長和發(fā)酵性能明顯提升。在5 L罐發(fā)酵中，重組菌最大細(xì)胞干重、糖耗和丁二酸產(chǎn)量比對照菌分別提高了15.6%、22%和23%，表明引入IrrE蛋白可提高菌株對高滲透壓脅迫的耐受能力。進(jìn)一步比較重組菌和對照菌胞內(nèi)相容性物質(zhì)海藻糖和甘油的濃度后發(fā)現(xiàn)，重組菌胞內(nèi)海藻糖和甘油濃度明顯提高，其最大積累量分別是對照菌的1.3和3.8倍，推測IrrE可通過增加胞內(nèi)相容性物質(zhì)的積累提高菌株對高滲透壓脅迫的耐受性。

滲透壓，全局調(diào)控，IrrE蛋白，丁二酸

高滲透壓脅迫是微生物發(fā)酵過程中常見的脅迫之一。以丁二酸生產(chǎn)為例，為維持合適的菌株生長代謝環(huán)境，發(fā)酵過程中需不斷添加pH中和劑中和所生成的丁二酸，結(jié)果體系中被引入大量的金屬離子如鈉、鉀、銨等，使得發(fā)酵末期體系的滲透壓不斷增大，對菌株的生長及產(chǎn)酸產(chǎn)生了嚴(yán)重的抑制。Lee[1]和Fang[2]等曾報(bào)道，在產(chǎn)丁二酸厭氧螺菌和產(chǎn)丁二酸放線桿菌發(fā)酵過程中，當(dāng)NaCl的濃度分別高于4 g/L和0.5 mol/L時(shí)，菌體的生長以及產(chǎn)酸性能都受到抑制。此外，高糖和產(chǎn)物濃度也會對菌株造成高滲透壓的脅迫。因此，提高菌株對高滲透壓脅迫的耐受性能是提高整個(gè)丁二酸發(fā)酵過程效率的關(guān)鍵因素之一。

研究者們已在這一方面展開了不同策略的研究，獲得了一些耐受性能提升的菌株。如Fang等[3]通過連續(xù)培養(yǎng)法篩選出可耐受0.7 mol/L NaCl的丁二酸放線桿菌CH050，其丁二酸產(chǎn)量達(dá)66 g/L，比出發(fā)菌株提高了37.5%。徐敏等[4]通過紫外線和甲基磺酸乙酯(EMS) 誘變處理，得到1株產(chǎn)丁二酸放線桿菌突變菌，丁二酸產(chǎn)量達(dá)到35.8 g/L，較出發(fā)菌提高了37.7%。另一方面，向發(fā)酵液中外源添加相容性物質(zhì)也是提高菌株耐受性能的常用方法之一。如在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加甜菜堿，Andersson等[5]發(fā)現(xiàn)在高糖濃度下 (150 g/L) 菌株生產(chǎn)丁二酸發(fā)酵周期比未添加甜菜堿的縮短了32 h。Fang等[2]比較了高滲透壓脅迫下不同相容性物質(zhì)對產(chǎn)丁二酸的影響后發(fā)現(xiàn)，當(dāng)添加25 mmol/L脯氨酸時(shí)，菌株NJ113生產(chǎn)丁二酸濃度達(dá)到最高，為56.2 g/L，比未添加情況下提高了22.2%。此外，利用基因工程技術(shù)實(shí)現(xiàn)胞內(nèi)相容性物質(zhì)如海藻糖的合成也是提高大腸桿菌在高滲透壓下的方法之一[6]。然而，需要指出的是，細(xì)胞能耐受高滲透壓脅迫，往往需要協(xié)調(diào)體內(nèi)眾多基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平，單個(gè)或幾個(gè)基因的改造和修飾雖可提高菌株的耐受性，但具有一定的局限性，因此需要從全基因組水平上進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)控以更好地提高菌株對高滲透壓脅迫的耐受性。

全轉(zhuǎn)錄工程(Global transcription machinery engineering) 是通過調(diào)控全基因組轉(zhuǎn)錄水平獲得有益細(xì)胞表型的一種定向進(jìn)化方法[7]。如對CRP[8-10]、spt15[11-12]和σ因子[13]的改造可以有效提高生物體對滲透壓、乙醇和丁醇的耐受性。IrrE是來自于耐輻射異常球菌的一個(gè)全局調(diào)控蛋白[14]，其作為激活生物體內(nèi)相關(guān)重要基因的開關(guān)，可調(diào)控至少400個(gè)基因[15]。研究表明異源引入IrrE可以增強(qiáng)微生物耐受輻射[16]、氧化及高溫脅迫的能 力[17-18]。此外將其外源表達(dá)還可提高植物對干旱和鹽脅迫的耐受性能[19]。在運(yùn)動發(fā)酵單胞菌中表達(dá)IrrE可有效提高其對乙醇、酸、滲透壓和熱等多重脅迫的耐受性，使得菌種在發(fā)酵過程保持旺盛的生長和代謝活力，乙醇產(chǎn)量達(dá)14.59 g/L，比出發(fā)菌株提高了66.7%[20]。在產(chǎn)乙醇大腸桿菌中引入IrrE，不僅提高大腸桿菌耐受滲透壓能力，且乙醇生產(chǎn)中兩個(gè)關(guān)鍵酶丙酮酸脫羧酶 (PDC) 和乙醇脫氫酶 (ADH) 的活力都得到提升[21]。在以葡萄糖和木糖為碳源發(fā)酵時(shí)，乙醇產(chǎn)量分別達(dá)39.63 g/L和34.53 g/L，分別提高了14.7%和26.3%。

因此，本文以產(chǎn)丁二酸大腸桿菌BER208為出發(fā)菌株，引入IrrE調(diào)控蛋白，考察其對菌株耐受高滲透壓脅迫的影響。在此基礎(chǔ)上，檢測了IrrE對胞內(nèi)相容性物質(zhì)合成的影響，初步解析了IrrE提高菌株耐高滲透壓性能的原因。

1 材料與方法

1.1 菌株

BER208：保藏號為CCTCC NO: M2012351[22]；其是由丁二酸生產(chǎn)菌株AFP111 (F+△ (: : Cam): : Kan) 通過ARTP誘變和進(jìn)化代謝選育得到。

DH5α: F-φ80dlacZΔM15，△(lacZYA-)U169，，，，hsdR17(rk-, mk+)，，，λ-，，,。

1.2 培養(yǎng)基

JSM培養(yǎng)基：檸檬酸 3 g/L，Na2HPO4·12H2O 4 g/L，KH2PO48 g/L，(NH4)2HPO48 g/L， NH4Cl 0.2 g/L，(NH4)2SO40.75 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，CaCl2·2H2O 10 mg/L，ZnSO4·7H2O 0.5 mg/L，CuCl2·2H2O 0.25 mg/L，MnSO4·H2O 2.5 mg/L，CoCl2·6H2O 1.75 mg/L，H3BO30.12 mg/L，Al2(SO4)31.77 mg/L，Na2MoO4·2H2O 0.5 mg/L，檸檬酸鐵 16.1 mg/L，121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min；維生素B120 mg/L，生物素2 mg/L。

1.3 方法

1.3.1IrrE重組大腸桿菌的構(gòu)建

從NCBI中獲得啟動子[23]和基因的序列信息，由Primer 5軟件設(shè)計(jì)引物，如表1所示。

表1 引物序列

以耐輻射異常球菌基因組DNA為模板，采用Over-lap PCR方法連接，使用DNA聚合酶進(jìn)行PCR。擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃變性45 s，59 ℃退火45 s，72 ℃延伸3 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增得到和片段，切割回收純化后，經(jīng)第3輪PCR，條件如上，將兩片段融合成一條，再通過T-A克隆連接到pMD19-T載體上。通過菌落PCR和測序?qū)rrE重組大腸桿菌進(jìn)行篩選和鑒定，成功構(gòu)建帶有啟動子的對照質(zhì)粒pMG1和成功表達(dá)IrrE的質(zhì)粒pMG1-。

1.3.2 種子培養(yǎng)方法

將保存于–80 ℃凍存管中的菌株以1%的接種量轉(zhuǎn)接到裝液量為5 mL的試管中，37 ℃、200 r/min過夜培養(yǎng)作為一級種子。將試管中的一級種子，以1%的接種量轉(zhuǎn)接到含100 mL JSM的500 mL三角瓶中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)6 h，作為二級種子。

1.3.3 血清瓶厭氧發(fā)酵

按1%接種量，將二級種子液接種到含30 mL JSM發(fā)酵培養(yǎng)基的血清瓶中，通CO2氣體2 min以維持厭氧，200 r/min、37 ℃培養(yǎng)48 h。

1.3.4 發(fā)酵罐分批補(bǔ)料培養(yǎng)方法

采用發(fā)酵培養(yǎng)基，在5 L發(fā)酵罐(上海生物寶興) 中進(jìn)行一步厭氧發(fā)酵，接種量10%，發(fā)酵溫度37 ℃，用20% Na2CO3溶液控制pH在6.8，轉(zhuǎn)速200 r/min，初糖濃度為30 g/L，當(dāng)糖濃度低于5 g/L時(shí)補(bǔ)加葡萄糖至30 g/L。

1.3.5 分析檢測

菌體密度測定：紫外可見分光光度計(jì)(Spectrumlab752S)，于600 nm處測定吸光值，細(xì)胞干重DCW=600×0.4。

葡萄糖濃度測定：生物傳感分析儀(SBA240C，山東省科學(xué)院生物研究所)。

發(fā)酵液中有機(jī)酸的測定：用高效液相色譜法檢測，色譜柱為Prevail Organic Acid，流動相為25 mmol/L KH2PO4(pH 2.5)，流速1.0 mL/min，紫外檢測波長215 nm。

相容性物質(zhì)的提取[24]：取1 mL樣品，4 ℃、12 000×離心10 min，并用冰冷的蒸餾水洗滌2次。所得細(xì)胞用700 W微波爐微波破碎。破碎方式為微波破碎60 s，間歇30 s，循環(huán)6次后用1 mL蒸餾水室溫提取1 h。離心后上清液用微孔濾膜過濾后，–80 ℃保存待用。

相容性物質(zhì)的檢測[24]：用高效液相色譜分析海藻糖和胞內(nèi)甘油的含量。色譜柱為Aminex·resin-based柱(Bio-Rad，美國)；柱溫為65 ℃；流動相為5 mmol/L H2SO4，流速為 0.800 mL/min。海藻糖的單位定義為每克細(xì)胞干重所含海藻糖的質(zhì)量，胞內(nèi)甘油的單位定義為每克細(xì)胞干重所含胞內(nèi)甘油的質(zhì)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 IrrE重組大腸桿菌的構(gòu)建和鑒定

分別以引物P1、P2進(jìn)行第一輪擴(kuò)增得到啟動子片段，通過T-A克隆連接到pMD19-T載體上，成功構(gòu)建對照質(zhì)粒pMG1質(zhì)粒。以引物P3、P4進(jìn)行第2輪擴(kuò)增得到基因片段，再以P1、P4為引物進(jìn)行第3輪擴(kuò)增得到融合片段，再通過T-A克隆構(gòu)建質(zhì)粒pMG1-質(zhì)粒。以pMD19-T上通用引物M13F/M13R進(jìn)行菌落PCR，篩選陽性克隆，再通過Ⅰ酶切驗(yàn)證和測序鑒定成功構(gòu)建IrrE重組大腸桿菌，結(jié)果如圖1所示。

2.2 引入IrrE對菌株在不同鈉離子濃度下厭氧生長及產(chǎn)酸的影響

以NaCl為滲透壓調(diào)節(jié)劑，首先考察了不同濃度Na+脅迫對照菌BER208的生長及產(chǎn)酸性能。由表2可知，隨著Na+濃度的提高，菌株BER208的生長和產(chǎn)酸性能不斷降低。如在0.5 mol/L Na+脅迫下，細(xì)胞干重和丁二酸產(chǎn)量分別為0.53 g/L和3.51 g/L，相比于0.3 mol/L Na+濃度下的細(xì)胞干重和產(chǎn)酸量分別降低了76%和83%，表明細(xì)胞受到了嚴(yán)重的滲透壓脅迫。引入IrrE后，在相同Na+濃度下，重組菌生長、糖耗、產(chǎn)酸量和糖酸得率相比對照菌株都有明顯提升，仍以0.5 mol/L Na+脅迫下的生長和產(chǎn)酸情況為例，重組菌BER208/pMG1-生長和產(chǎn)酸性能明顯提升，細(xì)胞干重和產(chǎn)酸量分別較對照菌提高了4.2和4.4倍，同時(shí)丁二酸相對于葡萄糖的收率提高了22.6%。該研究結(jié)果表明，引入IrrE可提高丁二酸生產(chǎn)大腸桿菌BER208對高滲透脅迫的耐受性。但是，隨著Na+濃度的不斷提高，IrrE提升菌株耐高滲透壓性能不斷減弱，表明IrrE只有當(dāng)滲透脅迫在一定范圍內(nèi)才能體現(xiàn)出明顯效果，繼續(xù)提高滲透壓壓力，IrrE對菌株耐滲透壓性能的提升能力減弱。

圖1 IrrE表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定

表2 對照菌E. coli BER208/pMG1和重組菌E. coli BER208/pMG1-irrE在不同Na+濃度下厭氧發(fā)酵結(jié)果

a: yield is defined as the percentage of the concentrations of succinic acid in consumed glucose. Each value is the mean of three parallel replicates ± standard deviation.

2.3 IrrE對重組菌在分批補(bǔ)料發(fā)酵過程中的影響

在上述研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步在5 L發(fā)酵罐中考察重組菌厭氧生長及發(fā)酵產(chǎn)酸的情況，結(jié)果如圖2所示。厭氧發(fā)酵85 h后，重組菌最大細(xì)胞干重達(dá)到2.3 g/L，共消耗72 g/L葡萄糖，丁二酸產(chǎn)量為53.2 g/L，得率為0.736 g/g，其細(xì)胞干重、耗糖和丁二酸產(chǎn)量分別比對照提高了15.6%、22%和23%，但是糖酸得率沒有明顯提升。進(jìn)一步考察發(fā)酵過程發(fā)現(xiàn)，在前50 h階段，對照菌和重組菌的細(xì)胞生長、耗糖速度和丁二酸產(chǎn)量基本一致，而在50 h以后出現(xiàn)了明顯的分化，即對照菌BER208的生長和產(chǎn)酸受到抑制，而重組菌BER208/pMG1-則繼續(xù)保持較高的生長和產(chǎn)酸能力。該結(jié)果表明，隨著丁二酸產(chǎn)量的增加，發(fā)酵后期體系的滲透壓不斷增大，對菌株的生長和產(chǎn)酸產(chǎn)生了抑制，而表達(dá)IrrE后可提高菌株對高滲透壓脅迫的耐受性。另一方面，極端情況下菌株生長性能的提高并不一定同步提升菌株的代謝性能，但本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，引入IrrE不僅提高了細(xì)胞在高滲透壓環(huán)境下的生長能力，同時(shí)使得細(xì)胞代謝合成丁二酸的性能也得到提升。

2.4 引入IrrE對菌株胞內(nèi)海藻糖和甘油含量的影響

親和性溶質(zhì)是不帶凈電荷的易溶有機(jī)滲透保護(hù)物質(zhì)，其在細(xì)胞內(nèi)大量積累，能夠給細(xì)胞的正常生理活動、DNA復(fù)制和蛋白質(zhì)分子的正確折疊提供穩(wěn)定環(huán)境，從而提高微生物對高滲透壓環(huán)境脅迫的耐受能力[25-28]。海藻糖和甘油是細(xì)菌中廣泛存在的親和性物質(zhì)。

圖2 對照菌E. coli BER208和重組菌E. coli BER208/pMG1-irrE在5 L發(fā)酵罐一步厭氧發(fā)酵結(jié)果

圖3 對照菌E. coli BER208和重組菌E. coli BER208/pMG1-irrE胞內(nèi)海藻糖濃度 (A) 及甘油濃度(B)對比

為進(jìn)一步解析IrrE提高菌株對高滲透壓脅迫的耐受機(jī)制，分別對重組菌和對照菌體內(nèi)的海藻糖和甘油含量進(jìn)行了檢測比較。如圖3所示，發(fā)酵過程中，重組菌胞內(nèi)的海藻糖和甘油濃度均高于對照菌。在前41.5 h，隨著培養(yǎng)基中Na+濃度積累細(xì)胞感知滲透壓增加，兩株菌胞內(nèi)海藻糖積累量快速上升，在第41.5 h積累量都達(dá)到最大值，其中重組菌胞內(nèi)海藻糖濃度為0.69 g/g DCW，是對照菌1.3倍，隨后推測隨著細(xì)胞的生長海藻糖可能作為胞內(nèi)的一種儲存性碳源被消耗利用而下降。同時(shí)，發(fā)酵中期兩株菌胞內(nèi)甘油積累量也隨著滲透壓增加而增加，且分別在37.5 h和49.5 h達(dá)到最大值，其中重組菌胞內(nèi)甘油濃度為8.29 g/g DCW，較對照菌提高了3.8倍，隨后更多甘油可能被運(yùn)輸?shù)桨饫^續(xù)保護(hù)細(xì)胞，從而胞內(nèi)的濃度逐漸降到很低[29]。周正富等[16]考察在有氧條件下引入IrrE后對菌株胞內(nèi)海藻糖和甘油代謝相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的影響后發(fā)現(xiàn)，外源引入IrrE一方面可降低甘油降解途徑關(guān)鍵基因 (和) 及甘油轉(zhuǎn)運(yùn)途徑關(guān)鍵基因 () 轉(zhuǎn)錄量，另一方面可提高海藻糖合成途徑關(guān)鍵基因 () 的轉(zhuǎn)錄水平，同時(shí)海藻糖分解途徑相關(guān)基因 () 轉(zhuǎn)錄水平顯著下調(diào)。因此我們認(rèn)為厭氧條件下引入IrrE可能對胞內(nèi)海藻糖和甘油的合成、降解和轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平也產(chǎn)生了影響，使得菌株胞內(nèi)相容性物質(zhì)海藻糖和甘油的積累量提高，并最終提高菌株對高滲透脅迫的耐受性。

3 結(jié)語

為提高丁二酸生產(chǎn)菌株對高滲透壓脅迫的耐受性，本文考察了利用基因提高產(chǎn)丁二酸大腸桿菌BER208耐高滲透壓脅迫的可行性。5 L發(fā)酵罐結(jié)果表明，引入IrrE后可有效提高BER208在高濃度Na+脅迫下的生長和代謝性能，重組菌生長能力和丁二酸產(chǎn)量比對照菌提高了15.6%和23%。進(jìn)一步對菌株胞內(nèi)相容性物質(zhì)海藻糖和甘油的檢測發(fā)現(xiàn)，引入IrrE后胞內(nèi)海藻糖和甘油最大濃度分別提高了1.3倍和3.8倍，表明IrrE可通過提高胞內(nèi)相容性物質(zhì)的濃度提高菌株對高滲透脅迫的耐受性。

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(本文責(zé)編 郝麗芳)

Influence of expressing IrrE fromon osmotic stress tolerance of succinate-producing

Xinggui Zhu1, Mingke Wu1, Jiangfeng Ma1, Youjun Gao2, Meili Chen1, and Min Jiang1

1 State Key Laboratory of Materials-Oriented Chemical Engineering, College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering, Nanjing Tech University, Nanjing 211816, Jiangsu, China;2 Changmao Biochemical Engineering Company Limited, Changzhou 213034, Jiangsu, China

Hyper-osmotic stress is one of the key factors that decrease the efficiency of biological succinic acid production. To increase the osmotic stress tolerance of succinate-producing, we studied the influence of IrrE, an exogenous global regulator, on cell osmotic stress resistance. Fermentation results showed that cell growth and succinic acid production by the recombinant increased under different Na+concentrations. Meanwhile, the maximum dry cell mass, glucose consumption and succinic acid concentration increased 15.6%, 22% and 23%, respectively, when fermented in a 5-L bioreactor. Expressing IrrE improved cell resistance to hyper-osmotic stress. Further comparison of intracellular osmoprotectants (trehalose and glycerol) concentrations showed that trehalose and glycerol concentrations in the recombinant increased. This suggested that introduction of IrrE could enhance intracellular osmoprotectants accumulation which conferred cell with improved resistance to osmotic stress.

osmotic pressure, global regulation, IrrE, succinic acid

March 23, 2016; Accepted: May 12, 2016

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