家蠶B類清道夫受體BmSCRB8基因的克隆及表達(dá)

趙羽卒，張奎，唐梅，徐曼，李重陽(yáng)，潘光照，申利，崔紅娟，楊麗群

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家蠶B類清道夫受體基因的克隆及表達(dá)

趙羽卒，張奎，唐梅，徐曼，李重陽(yáng)，潘光照，申利，崔紅娟，楊麗群

西南大學(xué)家蠶基因組生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400716

B類清道夫受體在動(dòng)脈粥樣硬化及其他心血管疾病的形成或抑制，機(jī)體免疫防御，凋亡細(xì)胞清除等生理過程中起著重要的作用?？寺×思倚QB型清道夫受體家族的一個(gè)成員基因，通過RACE技術(shù)獲得的cDNA全長(zhǎng)為2 668 bp，其ORF為1 704 bp，編碼567個(gè)氨基酸，通過在線預(yù)測(cè)其蛋白分子量為63.87 kDa，等電點(diǎn)為6.06。采用RT-PCR方法得到了的時(shí)空表達(dá)譜，結(jié)果表明在家蠶各組織以及血液各時(shí)期均有表達(dá)，且在脂肪體中表達(dá)量最高，變態(tài)發(fā)育時(shí)期表達(dá)量較高。原核表達(dá)獲得重組蛋白，并經(jīng)由蛋白純化、免疫小鼠后制備得到家蠶多克隆抗體。同時(shí)構(gòu)建了真核表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染家蠶胚胎細(xì)胞系。免疫熒光及過表達(dá)結(jié)果顯示主要定位于細(xì)胞膜上，Western blotting結(jié)果顯示免疫小鼠后所得到的抗血清可特異性識(shí)別蛋白。

家蠶，，表達(dá)譜，多克隆抗體，亞細(xì)胞定位

清道夫受體(SR) 是一類細(xì)胞膜糖蛋白，能夠識(shí)別并結(jié)合諸如氧化低密度脂蛋白、細(xì)菌、凋亡細(xì)胞等多聚陰離子配體[1-5]。根據(jù)美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院15位清道夫受體領(lǐng)域?qū)＜业挠懻撗芯?，清道夫受體包括10種不同的亞類 (A-J)[5]。其中B類清道夫受體(SR-B) 包括CD36、SR-BⅠ及其剪切變體SR-B Ⅱ和LIMP Ⅱ(Lysosomal integral membrane protein Ⅱ) 4個(gè)成員[1,5-7]。SR-B主要參與到動(dòng)脈粥樣硬化、炎癥反應(yīng)、宿主防御、血管生成、凋亡細(xì)胞清除等生理過程[7-12]。本研究中的即為家蠶中CD36基因的同源基因之一。1976年，Okumura等[13-14]發(fā)現(xiàn)一種血小板膜表面糖蛋白并將其命名為糖蛋白Ⅳ (G Ⅳ)，即CD36。在昆蟲中，關(guān)于CD36研究主要集中在果蠅里。目前，果蠅中了解到的CD36同源基因主要有3個(gè)。Croquemort (Catcher of death) 基因，主要介導(dǎo)吞噬并且在凋亡細(xì)胞的清除中發(fā)揮作用[15]；ninaD基因，在果蠅中參與類胡蘿卜素的轉(zhuǎn)運(yùn)過程[16]；SNMP (Sensory neuron membrane protein)，表達(dá)于觸角的嗅覺感覺神經(jīng) (OSNs)，在果蠅中參與信息素的探測(cè)[17-18]。在家蠶中，B類清道夫受體 (SR-B) 家族基因均具有CD36結(jié)構(gòu)域。目前，有關(guān)家蠶SR-B家族的研究較少，2008年Tanaka等在對(duì)家蠶全基因組中免疫相關(guān)基因進(jìn)行鑒定時(shí)，分析獲得了13個(gè)家蠶SR-B基因[19]。2010年，Sakudoh等證實(shí)了家蠶的黃繭基因C (Yellow cocoon) 編碼Cameo2蛋白——B類清道夫受體家族 (SR-B) 的一個(gè)成員[20]。隨后，該課題組又鑒定得到了另一個(gè)與β-胡蘿卜素轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的蛋白SCRB15，該蛋白由Fresh (F) 基因編碼，與Cameo2蛋白的氨基酸相似性為26%[21]。Dong等[22-23]克隆得到了家蠶B類清道夫家族的兩個(gè)成員：SCRBQ1和SCRBQ4，在對(duì)其功能的初步探索中，推測(cè)這兩個(gè)基因均能結(jié)合大腸桿菌和金黃色葡萄球菌。家蠶作為中國(guó)最主要的經(jīng)濟(jì)昆蟲之一，同時(shí)也是鱗翅目昆蟲的典型代表。對(duì)家蠶基因的研究，一方面，可將家蠶作為模式生物進(jìn)一步豐富對(duì)SR-B家族基因的功能研究；另一方面，也可以弄清在家蠶中發(fā)揮的具體作用以及該基因參與的相關(guān)的生理活動(dòng)，豐富對(duì)家蠶功能基因的研究。本文通過RACE技術(shù)克隆得到了家蠶B類清道夫受體家族的一個(gè)成員，并對(duì)其基因結(jié)構(gòu)特征、時(shí)空表達(dá)譜和亞細(xì)胞定位進(jìn)行了分析研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大造 (P50)，取自西南大學(xué)家蠶基因資源庫(kù)。幼蟲在27 ℃，相對(duì)濕度80%的條件下常規(guī)桑葉飼育。RNA提取試劑盒購(gòu)自O(shè)mega公司。HiFi酶、限制性內(nèi)切酶、載體PMD19-T、DNA marker、Solution Ⅰ連接酶為TaKaRa公司產(chǎn)品。質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自Qiagen公司。膠回收試劑盒購(gòu)自Axygen公司。RACE試劑盒、轉(zhuǎn)染試劑均購(gòu)自Invitrogen公司。引物由華大基因合成。多聚甲醛購(gòu)自生工生物工程 (上海) 股份有限公司。抗熒光猝滅劑和DAPI為碧云天公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取及cDNA合成

各組織材料通過解剖5齡3 d家蠶得到，包括頭、表皮、中腸、絲腺、脂肪體、馬氏管、精卵巢和血液。同時(shí)取4齡3 d起各時(shí)期家蠶血液，將Trizol直接加入血細(xì)胞中進(jìn)行裂解，其他組織先在液氮中研磨為粉末后再加入Trizol，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)得到cDNA模板。

1.2.2 RACE法擴(kuò)增的全長(zhǎng)序列

從SilkDB (http://www.silkdb.org/silkdb/) 下載預(yù)測(cè)的的mRNA序列，根據(jù)預(yù)測(cè)的mRNA序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增基因的特異引物 (表1)。以家蠶5齡3 d脂肪體cDNA為模板擴(kuò)增基因的部分序列，克隆及測(cè)序驗(yàn)證后，根據(jù)該序列設(shè)計(jì)特異引物 (表1) GSP1、GSP2、NGSP1和NGSP2。根據(jù)GeneRacerTM RACE Ready cDNA Kit說明書 (Invitrogen) 擴(kuò)增3′和5′端。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)回收擴(kuò)增產(chǎn)物，進(jìn)行T克隆，測(cè)序后拼接得到的cDNA序列。

1.2.3蛋白序列分析

在通過RACE法獲得基因全長(zhǎng)cDNA序列后，通過在線軟件ORF Finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)對(duì)的ORF序列進(jìn)行預(yù)測(cè)并得到其所翻譯的氨基酸序列。運(yùn)用在線軟件TMHMM Server v. 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)、SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/)、Protein isoelectric point calculator (http://isoelectric. ovh.org/)、SignalP 4.1 Server (http://www.cbs. dtu.dk/services/SignalP/)、ExPasy (http://www. expasy.org/tools/) 預(yù)測(cè)蛋白的分子量、等電點(diǎn)、結(jié)構(gòu)域等信息，并對(duì)其內(nèi)含子外顯子情況進(jìn)行分析。

1.2.4 BmSCRB8蛋白進(jìn)化分析

根據(jù)RACE得到的基因的ORF，得到其編碼的氨基酸全長(zhǎng)，在NCBI中進(jìn)行比對(duì)后下載了16個(gè)物種的同源序列，通過Clustalx軟件比對(duì)其序列，導(dǎo)入MEGA 6軟件以NJ法構(gòu)建進(jìn)化樹。

1.2.5 BmSCRB8表達(dá)譜分析

以家蠶5齡3 d各組織和4齡3 d到熟蠶各時(shí)期血液cDNA為模板對(duì)進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，內(nèi)參為肌動(dòng)蛋白3 ()，引物序列列于表1。PCR體系：模板0.1 μg， 20 μmol/μL上下游引物各0.5 μL，10×HiFi 緩沖液 2.5 μL，2.0 mmol/L，dNTPs 2 μL，HiFi酶0.2 μL，雙蒸水補(bǔ)齊至25 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min 40 s，共25個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min，12 ℃保存。各取5 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，分析得到表達(dá)譜。

1.2.6 BmSCRB8原核表達(dá)

根據(jù)全長(zhǎng)序列及生物信息學(xué)分析選取特異性片段，設(shè)計(jì)帶有H Ⅰ、Ⅰ酶切位點(diǎn)的特異引物序列，引物序列見表1。進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并將擴(kuò)增得到片段構(gòu)建到原核表達(dá)載體pET-28(a) 中，即為pET-28(a)-。轉(zhuǎn)化后經(jīng)卡那霉素抗性篩選后挑取陽(yáng)性克隆，搖菌提取質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化Rosseta感受態(tài)，接種單菌落于含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h后，分別轉(zhuǎn)接100 μL于4份卡那霉素抗性的10 mL LB培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r/min搖菌至600值為0.8–1.0時(shí)，其中3份加入終濃度為 1 mmol/L的IPTG，1份不加IPTG作為對(duì)照，分別在16 ℃、25 ℃、37 ℃，220 r/min的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。其中16 ℃培養(yǎng)24 h，25 ℃培養(yǎng)16 h，37 ℃培養(yǎng)8 h。離心棄上清收集菌體，并用PBS清洗菌體數(shù)次，以PBS重懸菌體后置于冰上進(jìn)行超聲破碎直至菌液透亮為止。離心分別收集上清和沉淀，取20 μL蛋白加入5 μL SDS-PAGE上樣緩沖液 (5×) 沸水浴30 min變性，采用5%濃度濃縮膠與10%濃度分離膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳?？捡R斯亮藍(lán)染色分析。分別接100 μL于4份卡那霉素抗性的10 mL LB培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r/min搖菌至600值為0.8–1.0時(shí)，其中3份分別加入終濃度為0.05 mmol/L、0.1 mmol/L、0.2 mmol/L的IPTG，1份不加IPTG作為對(duì)照，在16 ℃、220 r/min條件下進(jìn)行培養(yǎng)。收集菌體后依次進(jìn)行超聲破碎，收集上清、沉淀，SDS-PAGE電泳、考染檢測(cè)。最終發(fā)現(xiàn)優(yōu)化條件后，蛋白始終誘導(dǎo)在沉淀中。比較條件后最終選擇16 ℃、24 h、220 r/min、IPTG終濃度為1 mmol/L的條件進(jìn)行大規(guī)模誘導(dǎo)。

表1 引物序列

1.2.7 BmSCRB8蛋白純化

接菌培養(yǎng)至600值介于0.8到1.0之間時(shí)，在16 ℃、220 r/min的條件下用1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)24 h。收集菌體，50 mmol/L Tris-HCl重懸后，高壓破碎收集沉淀。尿素溶解后用 0.45 μm濾膜抽濾進(jìn)行Ni離子親和柱純化，使用不同濃度咪唑進(jìn)行梯度洗脫，收集洗脫液后用SDS-PAGE分析蛋白純化情況?？捡R斯亮藍(lán)染色后選擇條帶單一梯度進(jìn)行透析、濃縮后加入30%甘油于–80 ℃保存蛋白。用純化好的重組蛋白免疫昆明鼠，腹腔注射。共5次，蛋白量依次為50、70、100、120、140 μg，其中前3次間隔為10 d，第4次15 d，第5次21 d。在第5次免疫小鼠3 d后摘取小鼠眼球取血，通過梯度離心最終得到抗血清，加入30%甘油后分裝保存于–80 ℃。

1.2.8 BmSCRB8過表達(dá)載體構(gòu)建及細(xì)胞轉(zhuǎn)染

根據(jù)全長(zhǎng)設(shè)計(jì)特異性過表達(dá)引物，引物序列見表1。擴(kuò)增得到全長(zhǎng)ORF序列片段，將該片段連接至PIZ-OpIE2-EGFP載體，轉(zhuǎn)化后挑取陽(yáng)性克隆測(cè)序驗(yàn)證。該過表達(dá)質(zhì)粒命名為PIZ-OpIE2--EGFP。在24孔板內(nèi)放入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板蓋玻片，細(xì)胞鋪板后用無抗Grace培養(yǎng)基培養(yǎng)家蠶胚胎細(xì)胞系，待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到對(duì)數(shù)期時(shí)，進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。將 0.5 μg質(zhì)粒加入100 μL無抗無血清的Grace培養(yǎng)基中，混勻，加入1.5 μL脂質(zhì)體，輕柔混勻，室溫孵育30 min。將質(zhì)粒-脂質(zhì)體混合液加入24孔板中，培養(yǎng)6 h后換正常培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染3 d后用4%多聚甲醛固定15 min，Hochest染核10 min，封片，共聚焦觀察。

1.2.9 免疫熒光檢測(cè)BmSCRB8亞細(xì)胞定位

4齡眠時(shí)期家蠶解剖取脂肪體，PBS洗后以4%多聚甲醛固定30 min，0.3%TritonX-100打孔30 min，用含有10%山羊血清的1%BSA在37 ℃條件下進(jìn)行封閉，4 ℃孵育一抗 (即抗血清1∶500稀釋) 過夜。PBS洗一抗后室溫避光孵育二抗 (1∶2 000稀釋) 2 h。PBS洗二抗后用Hochest染核，室溫避光2 h。挑取組織到滴加了抗熒光淬滅劑的載玻片上，蓋上蓋玻片，于4 ℃避光壓片過夜。封片，Olympus FV1000共聚焦熒光顯微鏡觀察的細(xì)胞定位情況。

1.2.10 Western blotting檢測(cè)BmSCRB8抗血清特異性

以原核表達(dá)并純化得到的重組蛋白作為樣品，通過Western blotting實(shí)驗(yàn)檢測(cè)抗血清的特異性。通過SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜上后用5% BSA室溫封閉2 h，4 ℃孵育一抗 (即抗血清) 過夜，一抗1∶5 000稀釋。TBST洗一抗后孵育二抗， 1∶10 000稀釋，室溫2 h。TBST洗二抗后曝光。

表2 BmSCRB8抗血清效價(jià)

2 結(jié)果與分析

2.1 家蠶BmSCRB8基因全長(zhǎng)克隆與分析

根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)結(jié)果，以家蠶5齡3 d脂肪體的cDNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，克隆得到長(zhǎng)度為1 612 bp的中間序列。根據(jù)克隆得到的序列，通過RACE技術(shù)擴(kuò)增得到5′末端序列和3′末端序列，分別為541 bp和1 441 bp，拼接得到長(zhǎng)為2 668 bp的全長(zhǎng)序列 (圖1A)。序列提交GenBank，登錄號(hào)為KU866108。其中含有一個(gè)長(zhǎng)度為1 704 bp的開放閱讀框(ORF)，編碼567個(gè)氨基酸，通過在線軟件預(yù)測(cè)得到其蛋白分子量為63.87 kDa，等電點(diǎn) (PI) 為6.06；同時(shí)還包括121 bp長(zhǎng)的5'非編碼片段 (5'-UTR) 和843 bp長(zhǎng)的3'非編碼片段 (3'UTR) (圖1B)。在線數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果顯示，基因位于23號(hào)染色體 (圖1D)，為多外顯子基因，基因全長(zhǎng)34 364 bp，其中包括12個(gè)外顯子和11個(gè)內(nèi)含子 (圖1C)。

圖1 家蠶B型清道夫受體BmSCRB8的克隆及分析

2.2 家蠶B類清道夫受體BmSCRB8蛋白結(jié)構(gòu)分析

通過在線網(wǎng)站TMHMM Server v.2.0 (http:// www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)，SMART (http:// smart.embl-heidelberg.de/)，分析發(fā)現(xiàn)在76–98、522–544存在兩個(gè)典型的跨膜結(jié)構(gòu)域，兩個(gè)胞內(nèi)區(qū)域1–75、545–567 (圖2A) 和一個(gè)胞外區(qū)域99–521 (CD36結(jié)構(gòu)域) (圖2B)。利用NetNGlyc 1.0 server (http://www.cbs.dtu.dk/services/ NetNGlyc/) 和NetPhos 2.0 server (http://www. cbs.dtu.dk/services/NetPhos/) 進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)該蛋白有4個(gè)N-糖基化位點(diǎn)以及27個(gè)磷酸化位點(diǎn)，其中包括11個(gè)Ser、9個(gè)Thr和7個(gè)Tyr (圖2C)。

圖2 家蠶BmSCRB8蛋白結(jié)構(gòu)分析

2.3 同源與進(jìn)化分析

對(duì)16種與具有同源序列的物種進(jìn)行聚類分析，結(jié)果如圖3所示。從進(jìn)化樹來看，家蠶與同為鱗翅目的小菜蛾的B類清道夫受體最為接近。

2.4 家蠶BmSCRB8的時(shí)空表達(dá)分析

利用RT-PCR技術(shù)，以5齡3 d家蠶各組織，包括頭、表皮、中腸、絲腺、脂肪體、馬氏管、精巢、卵巢和血液的cDNA作為模板分析在各組織中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示在以上組織中均有表達(dá)，且在脂肪體中表達(dá)量最高，精卵巢次之 (圖4A)。為進(jìn)一步分析基因在家蠶幼蟲各時(shí)期的表達(dá)情況，我們獲取從4齡3 d到熟蠶時(shí)期的脂肪體cDNA作為模板，RT-PCR結(jié)果顯示從4齡3 d到熟蠶時(shí)期持續(xù)性表達(dá)，且在變態(tài)發(fā)育時(shí)期，即4齡眠和上蔟時(shí)期高表達(dá) (圖4B)。

2.5 BmSCRB8的原核表達(dá)

選擇家蠶蛋白99–521 aa段序列，設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列見 表1。經(jīng)H Ⅰ和Ⅰ雙酶切后將該片段連接到PMD19-T載體上進(jìn)行測(cè)序，得到正確的序列。將該片段克隆到pET-28a (+) 載體上，經(jīng)H Ⅰ和Ⅰ雙酶切，出現(xiàn)935 bp的特異性片段 (圖5A)，成功獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)-。轉(zhuǎn)化Rosseta表達(dá)菌株，加入終濃度為1 mmol/L 的IPTG，16 ℃誘導(dǎo)24 h，得到原核表達(dá)產(chǎn)物。SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，獲得41 kDa大小的pET-28a(+)-重組蛋白，其中BmSCRB8片段為 36.1 kDa，該蛋白存在于兩個(gè)跨膜區(qū)域中間，且以包涵體形式存在 (圖5B)。并且優(yōu)化表達(dá)條件后，蛋白始終存在于包涵體中 (圖5C)。

圖3 家蠶BmSCRB8進(jìn)化分析

圖4 家蠶BmSCRB8在家蠶幼蟲各組織及脂肪體各時(shí)期的時(shí)空表達(dá)譜

2.6 BmSCRB8的蛋白純化及抗體制備

大規(guī)模誘導(dǎo)產(chǎn)生包涵體蛋白后，通過Ni+親和層析法純化蛋白，得到純度>99%的重組蛋白。用純化的家蠶BmSCRB8重組蛋白免疫昆明鼠，獲得鼠源抗血清。將純化得到的重組蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳后，以免疫得到的抗血清作為一抗進(jìn)行孵育后在41 kDa附近得到單一條帶 (圖5D)，表明我們得到較為特異性的抗血清。

2.7 BmSCRB8蛋白的亞細(xì)胞定位

通過PCR擴(kuò)增得到的全長(zhǎng)ORF片段，克隆到PIZ-OpIE2-EGFP載體上，將該質(zhì)粒命名為PIZ-OpIE2--EGFP (圖6A)。分別用PIZ-OpIE2-EGFP和PIZ-OpIE2-- EGFP轉(zhuǎn)染家蠶胚胎細(xì)胞系72 h后，固定細(xì)胞，Hochest染核，通過共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察，結(jié)果顯示對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后整個(gè)細(xì)胞均勻分布著EGFP陽(yáng)性信號(hào)，而在重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，EGFP信號(hào)則特異性地表達(dá)于細(xì)胞膜上，反映出BmSCRB8蛋白定位于細(xì)胞膜上(圖6B)。

圖5 家蠶BmSCRB8原核表達(dá)、蛋白純化及抗體制備

2.8 BmSCRB8抗血清檢測(cè)

以純化得到的重組蛋白作為抗原，通過ELISA技術(shù)測(cè)定抗血清效價(jià)，見表2。取家蠶5齡3 d到5齡6 d脂肪體，提取蛋白后進(jìn)行Western blotting分析，結(jié)果顯示在 63.87 kDa附近有單一條帶，表明我們自制的抗血清能夠特異性識(shí)別BmSCRB8蛋白 (圖7A)。隨后，取家蠶4齡眠時(shí)期的脂肪體進(jìn)行免疫熒光，結(jié)果顯示BmSCRB8蛋白特異性表達(dá)于細(xì)胞膜上 (圖7B)，與過表達(dá)結(jié)果相一致，進(jìn)一步證明了BmSCRB8抗血清的特異性。

圖6 家蠶胚胎細(xì)胞系中BmSCRB8蛋白的亞細(xì)胞定位

圖7 BmSCRB8抗血清檢測(cè)

3 討論

B類清道夫受體 (SR-B) 是一類跨膜的細(xì)胞表面糖蛋白，其主要表達(dá)于巨噬細(xì)胞、血管上皮細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等，參與到諸如動(dòng)脈粥樣硬化、炎癥反應(yīng)、宿主防御、血管生成、凋亡細(xì)胞清除等生理過程中[24]。目前而言，SR-B的研究主要集中于哺乳動(dòng)物中，此外。昆蟲中對(duì)于果蠅SR-B的研究相對(duì)較多，多集中于對(duì)SR-B在類胡蘿卜素轉(zhuǎn)運(yùn)、信息素探測(cè)等生理過程中的功能[16-18,25]。在家蠶中，關(guān)于SR-B的功能鮮有報(bào)導(dǎo)?，F(xiàn)有的研究提到SR-B在宿主防御方面的功能，也有部分研究針對(duì)于家蠶黃繭的形成，即類胡蘿卜素的轉(zhuǎn)運(yùn)[19,21,23]。開展對(duì)家蠶基因的研究，一方面可將家蠶作為模式生物，更為方便地進(jìn)行體內(nèi)基因編輯，對(duì)SR-B進(jìn)行深入研究，為哺乳動(dòng)物的研究提供參考借鑒；另一方面也能進(jìn)一步豐富對(duì)家蠶功能基因的研究，為害蟲防治提供理論依據(jù)。本文通過PCR和RACE技術(shù)克隆得到家蠶基因的全長(zhǎng)對(duì)其編碼的蛋白序列進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，為具有CD36結(jié)構(gòu)域的兩次跨膜糖蛋白，為典型的SR-B家族成員。同時(shí)也對(duì)蛋白重要的功能位點(diǎn) (磷酸化、糖基化) 進(jìn)行了預(yù)測(cè)，該蛋白有4個(gè)N-糖基化位點(diǎn)和27個(gè)磷酸化位點(diǎn)，包括11個(gè)Ser、9個(gè)Thr和7個(gè)Tyr。這些位點(diǎn)能夠指導(dǎo)后續(xù)的功能研究。

在昆蟲中，脂肪體相當(dāng)于哺乳動(dòng)物中的肝臟并且在昆蟲的生長(zhǎng)發(fā)育和變態(tài)過程中發(fā)揮極其重要的作用[26]。有研究表明，昆蟲中脂肪體能在宿主免疫防御過程中快速產(chǎn)生抗菌肽進(jìn)而參與到免疫應(yīng)答中[27]，此外，昆蟲脂肪體還能參與到代謝中，合成血淋巴相關(guān)蛋白[28-29]，也能間接參與到免疫防御活動(dòng)中[30-31]。對(duì)家蠶5齡3 d各組織的表達(dá)譜進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，基因在各組織中均有明顯表達(dá)，且在脂肪體中表達(dá)量最高。而從家蠶4齡3 d到熟蠶時(shí)期的表達(dá)譜顯示，在各時(shí)期持續(xù)性表達(dá)，且在變態(tài)發(fā)育時(shí)期 (即眠期和上蔟時(shí)期) 表達(dá)量較高。推測(cè)可能參與到家蠶免疫反應(yīng)中。

本研究構(gòu)建了PIZ-OpIE2--EGFP過表達(dá)質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染家蠶胚胎細(xì)胞系共聚焦顯微鏡觀察，轉(zhuǎn)染了PIZ-OpIE2--EGFP的細(xì)胞有熒光蛋白信號(hào)表達(dá)于細(xì)胞膜上。我們進(jìn)一步構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET-28(a)-，并誘導(dǎo)其在大腸桿菌中高量表達(dá)，經(jīng)純化獲得原核表達(dá)蛋白，免疫昆明鼠后獲得抗血清，通過免疫熒光進(jìn)一步表明蛋白定位于脂肪體細(xì)胞膜，與過表達(dá)結(jié)果相互驗(yàn)證。暗示家蠶蛋白可能有與哺乳動(dòng)物相似的功能，作為一個(gè)跨膜糖蛋白參與到細(xì)胞膜內(nèi)外的物質(zhì)、能量、信號(hào)的運(yùn)輸與傳遞。促進(jìn)細(xì)胞對(duì)修飾過的脂質(zhì)分子的攝取，以及在與胞外配體結(jié)合后激活相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)而參與到噬菌、炎癥反應(yīng)等生理過程。Western blotting結(jié)果證明我們得到了較為特異的，為進(jìn)一步對(duì)家蠶基因的研究提供了重要的檢測(cè)依據(jù)。

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(本文責(zé)編 陳宏宇)

Cloning and expression of scavenger receptor class Bin silkworm

Yuzu Zhao, Kui Zhang, Mei Tang, Man Xu, Chongyang Li, Guangzhao Pan, Li Shen, Hongjuan Cui, and Liqun Yang

State Key Laboratory of Silkworm Genome Biology, Southwest University, Chongqing 400716, China

Scavenger receptor class B is involved in various indispensable physiological processes, like the formation and inhibition of atherosclerosis or other cardiovascular diseases, innate immune defense and the removal of apoptotic cells. Here, we cloned, a member of scavenger receptor class B in silkworm.We obtained the full-length cDNA sequence ofby rapid amplification of cDNA ends (RACE), including 2 668 bp. The ORF ofis 1 704 bp, encoding 567 amino acids. Online software prediction indicated that the molecular weight ofis 63.87 kDa and the isoelectric point (pI) is 6.06. The space-time expression profile ofwas detected by reverse transcription PCR (RT-PCR), which implicated thatis extensively expressed in each tissue and at each stage of blood. In addition,is highest expressed in fat body of silkworm, and is highly expressed in metamorphosis periods. Anti-polyclonal antibody was generated through prokaryotic expression, protein purification and mice immunization.Simultaneously, weconstructedeukaryotic vector and then transfected embryonic cell line of silkworm.Immunofluorescence and overexpression showed thatexpressed specifically in membrane. Western blotting demonstrated thatprotein can be specifically recognized by anti-serum generated after mice immunization.

,, expression profile, polyclonal antibody, subcellular localization

January 12, 2016; Accepted:June 15, 2016

Liqun Yang. Tel: +86-23-68251712; E-mail: cysylq@swu.edu.cn

Supported by:National Basic Research Program of China (973 Program) (No. 2012CB114603), National Natural Science Foundation of China (No. 81201551), the Fundamental Research Funds for the Central Universities (No. XDJK2013B020), Disciplinary Team Program of the Fundamental Research Funds for the Central Universities (No. 2362015XK09), Postgraduate Technology Innovation Program of Chongqing (No. CYB2015067), Basic Research Specialized Funds of Southwest University (No. XDJK2015D021).

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973計(jì)劃) (No. 2012CB114603)，國(guó)家自然科學(xué)基金 (No. 81201551)，中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金 (No. XDJK2013B020)，中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金學(xué)科團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目 (No. 2362015XK09)，重慶市研究生科研創(chuàng)新項(xiàng)目 (No. CYB2015067)，西南大學(xué)基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金 (No. XDJK2015D021) 資助。