通督調(diào)神針灸預(yù)處理對腦缺血再灌注大鼠miRNA664及MMP9調(diào)控機制的研究

鄭仕平，韓　為，儲浩然，王　穎，張　玲，張國慶，朱玲玲

（安徽中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，合肥230061）

通督調(diào)神針灸預(yù)處理對腦缺血再灌注大鼠miRNA664及MMP9調(diào)控機制的研究

鄭仕平，韓為，儲浩然，王穎，張玲，張國慶，朱玲玲

（安徽中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，合肥230061）

目的探討通督調(diào)神針灸預(yù)處理對腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)行為功能和腦水含量的影響及miRNA664、MMP9表達(dá)的調(diào)控作用機制。方法將130只Wistar大鼠隨機分為A組（電針預(yù)處理組）30只、B組（艾灸預(yù)處理組）30只、C組（阿司匹林預(yù)處理組）30只、D組（模型組）30只和E組（空白對照組）10只。A組進行電針治療；B組用清艾條懸灸；C組用阿司匹林10 mg/kg灌胃。治療7 d后各組進行腦缺血再灌注模型制作，于再灌注后24 h，觀察大鼠神經(jīng)行為功能和腦水含量以及皮質(zhì)區(qū)相關(guān)miRNA、MMP9的表達(dá)。結(jié)果A組、B組、C組和D組神經(jīng)行為學(xué)評分與E組比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。A組、B組神經(jīng)行為學(xué)評分與C組比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。A組神經(jīng)行為學(xué)評分與B組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。A組、B組、C組和D組腦水含量、miRNA664相對表達(dá)量及MMP9相對表達(dá)量與E組比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.05）。A組、B組和C組腦水含量、miRNA664相對表達(dá)量及MMP9相對表達(dá)量與D組比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。A組和B組腦水含量、miRNA664相對表達(dá)量及MMP9相對表達(dá)量與C組比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.05）。A組腦水含量、miRNA664相對表達(dá)量及MMP9相對表達(dá)量與B組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.05）。結(jié)論通督調(diào)神針灸預(yù)處理可有效降低腦缺血再灌注大鼠的神經(jīng)行為學(xué)評分和腦水含量，并通過調(diào)控miRNA664的表達(dá)降低MMP9相對表達(dá)量。通督調(diào)神針灸預(yù)處理腦保護機制之一可能通過調(diào)控miRNA664的表達(dá)降低MMP9相對表達(dá)量，誘導(dǎo)腦缺血耐受，減輕腦水腫。

針灸療法；通督調(diào)神；miRNAs；MMP9；大鼠；電針Reperfusion Injury再灌注損傷（再查一下）

隨著缺血性腦血管病發(fā)病率的上升和致死致殘率的增加，其發(fā)病前期的預(yù)防性治療更加有其必要性和重要性。而針灸預(yù)處理治療以其操作方便，對機體副反應(yīng)小而更有應(yīng)用推廣價值。

本研究通過觀察通督調(diào)神針灸預(yù)處理對腦缺血再灌注大鼠相關(guān)miRNAs的調(diào)控，評價通督調(diào)神針灸預(yù)處理對腦卒中預(yù)防的效果，探討通督調(diào)神針灸預(yù)處理對腦缺血再灌注大鼠相關(guān)miRNAs的調(diào)控機制，現(xiàn)報告如下。

1　材料與方法

1.1動物及分組

選擇130只清潔級健康雄性Wistar大鼠，月齡3～4個月，體重250～300 g，由上海西普爾必凱實驗動物有限公司提供。經(jīng)1星期適應(yīng)性飼養(yǎng)后開始實驗。采用隨機數(shù)字法分為A組（電針預(yù)處理組）30只、B組（艾灸預(yù)處理組）30只、C組（阿司匹林預(yù)處理組）30只、D組（模型組）30只和E組（空白對照組）10只。

1.2藥品及試劑

阿司匹林腸溶片（南京白敬宇制藥有限責(zé)任公司）；清艾條（南洋艾灸廠訂做）；ECL超敏發(fā)光試劑盒（Thermo公司）；AQP4（Bioworld公司）；MMP-9（Boster公司）；one-step qPCR Kit、rno-miRNA-494-3p、rno-miRNA-290、rno-miRNA-664-3p（Biomics公司）；核酸染料（賽百盛GoldView公司）。

1.3主要實驗儀器

SDZ-Ⅱ型電針治療儀（蘇州醫(yī)療用品廠有限公司）；QUICK型電凝針（常州速駿電子有限公司）；DHG-9140型干燥箱（上海精宏實驗設(shè)備有限責(zé)任公司）；EPS 300型電泳儀、VE-180型電泳槽、VE-186型轉(zhuǎn)膜儀、垂直板電泳槽（Tanon公司）；普通PCR儀（杭州晶格科學(xué)儀器有限公司）；熒光定量PCR儀（Thermo PIKOREAL 96）；PIKO Plate Illuminator（Thermo公司）；針灸針（0.25 mm×13 mm）。

1.4動物模型制備及治療

1.4.1動物模型制備

模型制備大鼠大腦中動脈梗死（MCAO）模型制備參照Zea Longa方法進行，并加以改進。除E組外，其余各組大鼠以3%水合氯醛（1 mL/100 g體重）腹腔注射麻醉，頸前皮膚正中切口，暴露左側(cè)頸三角，分離左側(cè)頸總動脈（CCA）、頸外動脈（ECA）、頸內(nèi)動脈（ICA），結(jié)扎、切斷、游離ECA主干，在其根部用l號線打1個松結(jié)，用縫合線暫時阻斷CCA和ICA血流，在ECA殘端剪1個約相當(dāng)于ECA直徑2/3大小的切口，將制備好的栓線插入ICA，至阻斷ICA血流處，不完全結(jié)扎ECA根部絲線，去除暫時阻斷ICA血流的縫合線，線栓從頸外動脈插入，進入頸內(nèi)動脈顱內(nèi)段，當(dāng)遇有輕微阻力時停止，結(jié)扎ECA根部絲線，去除暫時阻斷CCA血流的縫合線。栓線插入深度為19～22 mm，經(jīng)ICA分叉輕插入顱內(nèi)至大腦前動脈（ACA），消毒、縫合皮膚。2 h后再次麻醉大鼠，剪開切口縫合線，拔出栓線，使其頭端置于ECA殘端，使CCA、ICA血流再通。以再灌后不能完全伸展對側(cè)前爪，或行走時向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈，或站立不穩(wěn)，向?qū)?cè)傾倒并存活至規(guī)定時間點為模型成功的標(biāo)準(zhǔn)。

1.4.2治療方法

A組取天門、百會、大椎。天門穴、百會穴平刺進針3 mm，大椎穴斜刺3 mm，針刺后百會和大椎穴接電針治療儀，選用頻率為2/5 Hz的疏密波，電流強度為1～2 mA。每日1次，每次持續(xù)20 min，共治療7 d。

正說著，嘚嘚嘚的高跟鞋聲由遠(yuǎn)而近，魯冰瑩又走了進來，她心有不甘地對護士們說：“告訴大家個秘密，顏副院長才是名副其實的‘工業(yè)酒精’，他幾年前把一個女學(xué)生搞大了肚子，那女學(xué)生的姐夫是個局長，準(zhǔn)備告他，《起訴書》都寫好了。后來，女學(xué)生的姐姐怕壞了她妹妹的名聲和前程，才讓顏副院長賠一筆‘青春損失費’了事?！?/p>

B組將大鼠頭部固定，保持其清醒狀態(tài)下，選取百會、天門、大椎穴剃毛點記，用清艾條懸灸20 min。每日1次，治療7 d。

C組根據(jù)“人和動物體表面積折算的等效劑量比率表”確定大鼠的灌胃藥量，大鼠每千克體重需要阿司匹林0.01 g。將阿司匹林片研磨成粉末，與蒸餾水混合成0.01 g/mL濃度的溶液，按大鼠所需要的藥物量進行給藥。每日1次，治療7 d。

D組與E組同各組平行飼養(yǎng)，不做任何處理。

1.5檢測指標(biāo)與方法

1.5.1神經(jīng)行為功能測定

動物于手術(shù)結(jié)束后放回籠中進行觀察，自由飲食。于再灌注后24 h，由不了解分組情況的觀察者進行神經(jīng)功能評分，評分方法分為有自發(fā)探究記0分，刺激時能走動記1分；正常步態(tài)記0分，共濟失調(diào)記1分；爬行記2分，無步態(tài)記3分；能進食記0分，不能進食記1分；能飲水記0分，不能飲水記1分；疼痛刺激可移動記0分，僅頭或軀干運動記1分，肢體回縮或無反應(yīng)記2分。

1.5.2腦水含量測定

1.5.3miR664表達(dá)測定

1.5.3.1RNA的提取

將50 mg組織或細(xì)胞標(biāo)本中加入1 mL Trizol（Invitrogen公司）勻漿，靜置5 min，加氯仿0.2 mL，混勻后靜置5 min，4℃12000×g離心15 min，吸取上層無色液相，加入0.5 mL異丙醇，靜置15 min，4℃12000×g離心15 min，可見RNA沉淀，棄上清，加75%乙醇1 mL混勻，4℃7500×g離心5 min，棄上清，無RNA酶水溶解。采用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，分光光度計檢測RNA濃度及純度。

1.5.3.2逆轉(zhuǎn)錄實時定量PCR檢測miR664的表達(dá)

①一步法miRNA定量體系的建立。取總RNA0.1～100 ng進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)體系為總RNA 0.1～100 ng、2×Master mix 12.5 μL、50×SYBR GreenⅠ0.5 μL、RT Primer（10 μM）0.5 μL、Forward Primer（10 μM）0.5 μL、Reverse Primer（10 μM）0.5 μL、DEPC-H2O補至25 μL。②實時定量PCR反應(yīng)程序。反轉(zhuǎn)錄，37℃～42℃60 min；熱失活變性，95℃10 min；擴增，95℃20 s，62℃30 s，72℃30 s，進行45個循環(huán)。以上各步驟中，反應(yīng)體系以及試劑用量均嚴(yán)格按照EzOmicsTMmiRNA qPCR Detection Kit（Biomics公司）說明書進行操作。miR664相對表達(dá)量分析方法為relative quantification study，分析所采用的指標(biāo)為2-△△Ct。

1.5.4基質(zhì)金屬蛋白9表達(dá)測定

應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)（Western Blot法）檢測腦組織基質(zhì)金屬蛋白9（MMP9）的表達(dá)。剪取組織約100 mg，加入RIPA細(xì)胞裂解液1 mL（內(nèi)含1 mM PMSF）后提取總蛋白，SDS-PAGE凝膠電泳，電轉(zhuǎn)膜后將蛋白轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜，采用5%脫脂牛奶封閉2 h后，使用TBS洗膜，再加一抗MMP9（92kDa）和內(nèi)參beta-actin抗體，4℃過夜。加入洗滌液（TBST），每次洗滌10 min，共洗滌3次。最后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗作用2 h，洗膜后加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯影。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法

實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS17.0進行數(shù)據(jù)處理，采用單因素方差分析比較均數(shù)間的差異。以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1各組神經(jīng)行為學(xué)評分比較

由表1可見，A組、B組、C組和D組神經(jīng)行為學(xué)評分與E組比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。A組、B組神經(jīng)行為學(xué)評分與C組比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。A組神經(jīng)行為學(xué)評分與B組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

表1　各組神經(jīng)行為學(xué)評分比較（x±s，分）

2.2各組腦水含量比較

由表2可見，A組、B組、C組和D組腦水含量均明顯提高，與E組比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.05）。A組、B組和C組腦水含量與D組比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。A組和B組腦水含量與C組比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。A組腦水含量與B組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表2　各組腦水含量比較（x±s，%）

2.3各組miRNA664相對表達(dá)量比較

由表3、圖1及圖2可見，A組、B組、C組和D組miRNA664相對表達(dá)量與E組比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。A組、B組和C組miRNA664相對表達(dá)量與D組比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。A組和B組miRNA664相對表達(dá)量與C組比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。A組miRNA664相對表達(dá)量與B組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表3　各組miRNA664相對表達(dá)量比較（x±s，2-△△Ct）

2.4各組MMP9相對表達(dá)量比較

由表5、圖3可見，A組、B組、C組和D組MMP9相對表達(dá)量與E組比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。A組、B組和C組MMP9相對表達(dá)量與D組比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。A組和B組MMP9相對表達(dá)量與C組比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。A組MMP9相對表達(dá)量與B組比較，差具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表3　各組miRNA664相對表達(dá)量比較（x±s，MMP9/β-actin）

圖1　miRNA664擴增曲線圖

圖2　miRNA664溶解曲線圖

圖3　Western印跡檢測MMP9蛋白的表達(dá)

3　討論

miRNA是一類新發(fā)現(xiàn)高度保守的內(nèi)源性非編碼RNA，大小長約19～23個核苷酸，大部分是由內(nèi)含子部位產(chǎn)生，成熟miRNA堿基互補配對的方式識別靶mRNA分子并誘導(dǎo)靶降解或/和翻譯抑制，調(diào)控基因表達(dá)。miRNA在中樞神經(jīng)系統(tǒng)含量豐富，參與調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)的生長發(fā)育，而同時也參與神經(jīng)系統(tǒng)重大疾病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，如缺血性腦血管病、神經(jīng)退行性疾病、神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤等［1］。多項研究［2-5］表明，大鼠大腦中動脈閉塞造成的局灶性腦缺血能夠明顯改變多種miRNA的表達(dá)，它們調(diào)節(jié)一些介導(dǎo)神經(jīng)元保護、受體功能以及炎癥基因表達(dá)，從而調(diào)控卒中的病理生理學(xué)過程。

急性局灶性腦缺血導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)能量耗竭，造成跨膜電位消失、Ca2+內(nèi)流和谷氨酸釋放，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。促進缺血預(yù)適應(yīng)（ischemic precondition，IPC）是指組織在經(jīng)歷多次短暫缺血后產(chǎn)生一定的“自我”保護作用，使其對隨后較長時間的缺血耐受性明顯增強的現(xiàn)象［6］。已知預(yù)處理誘導(dǎo)腦缺血耐受需要合成新蛋白，并短暫性地抑制基因表達(dá)。有研究［7］通過檢測miRNA在新蛋白合成中的調(diào)節(jié)作用，揭示了預(yù)處理可通過調(diào)控miRNA在小鼠腦皮質(zhì)中的表達(dá)，下調(diào)miRNA的一個顯著的預(yù)測靶基因是甲基-CpG結(jié)合蛋白2（methy1-CpG binding protein2，MeCP2）。MeCP2在耐受中的作用可能抑制非必要基因同時，激活細(xì)胞存活所需要的必要基因。研究發(fā)現(xiàn)，包括miR-132在內(nèi)的許多miRNA可與MeCP2的3’-UTR結(jié)合，小鼠皮質(zhì)IPC能誘導(dǎo)miR-132顯著下調(diào)，MeCP2蛋白快速增加。由于具有甲基-DNA結(jié)合劑轉(zhuǎn)錄抑制域，MeCP2被認(rèn)為是一種廣譜性轉(zhuǎn)錄抑制劑。該研究表明，MeCP2應(yīng)為誘導(dǎo)IPC所必需，而某些miRNA的下調(diào)可上調(diào)MeCP2表達(dá)，從而促進IPC。

miRNA-497作用于bcl-2，它在小鼠短暫性MCAO時可被誘導(dǎo)表達(dá)。研究證明，mir-497能抑制bcl-2/-w的翻譯。在體內(nèi)應(yīng)用antagomir-497能有效降低miR-497水平，相應(yīng)地提高bcl-2/-w蛋白水平，從而減輕MCAO導(dǎo)致的梗死和神經(jīng)元損傷［8］。在腦缺血模型中，miR-21是一種很強的抗凋亡因子。在大鼠腦缺血模型中，缺血邊緣區(qū)神經(jīng)元內(nèi)miR-21水平較對側(cè)半球顯著增高。在培養(yǎng)的皮質(zhì)神經(jīng)元中，miR-21過度表達(dá)可顯著地抑制OGD誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，表明miR-21過度表達(dá)可保護缺血神經(jīng)細(xì)胞。另外，神經(jīng)元過度表達(dá)miR-21還能顯著降低Fas配體水平，而后者是一種重要的細(xì)胞死亡誘導(dǎo)配體，這很可能是miR-21神經(jīng)保護作用的機制之一［9］。另一項研究發(fā)現(xiàn)，miR-21耗竭會減少細(xì)胞增殖并增加細(xì)胞凋亡，其靶基因包括PTEN和bcl-2［10］。

MMP9屬于Ⅳ型膠原酶，也稱明膠酶，它能有效分解基底膜及細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分［11］。MMP9合成后以酶原形式存在，被特特的蛋白酶切割后產(chǎn)生活性，導(dǎo)致白細(xì)胞浸潤［12］。體內(nèi)許多炎性細(xì)胞因子［如IL-6、IL-18腫瘤壞死因子-α（TNF-α）］，生長因子及其他MMP的激活均能誘導(dǎo)或刺激MMP9在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)。現(xiàn)已證實MMP9的水平與不穩(wěn)定斑塊呈正相關(guān)［13］。國內(nèi)外的研究都已顯示，MMP9在腦梗死的發(fā)生與發(fā)展中起重要作用［14-15］。在永久性腦缺血大鼠模型中，腦缺血24 h血漿與腦組織MMP9活性皆顯著升高［16］，MMP9活性被抑制與神經(jīng)元損傷減少呈正相關(guān)［17］。研究發(fā)現(xiàn)MMP9能降解ECM，在血腦屏障的破壞、腦水腫的形成過程中發(fā)揮著重要作用［18-19］，并能將細(xì)胞與基質(zhì)間相互作用的微環(huán)境破壞，誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞的死亡，導(dǎo)致神經(jīng)功能障礙［20］。

Jeyaseelan K等［4］結(jié)合DNA芯片分析發(fā)現(xiàn)miR -125a、miR 290、miR-664調(diào)節(jié)MMP9基因的表達(dá)。同時也發(fā)現(xiàn)，miR-664與MMP9表達(dá)變化一致，這說明兩者之間可能存在調(diào)控與被調(diào)控關(guān)系。MMP9與血腦屏障的破壞和血管源性腦水腫密切相關(guān)。據(jù)此推測miRNA可能通過調(diào)控其靶基因表達(dá)而參與腦梗死后腦水腫形成。

本實驗研究發(fā)現(xiàn)通督調(diào)神針灸預(yù)處理可有效降低腦缺血再灌注大鼠的神經(jīng)行為學(xué)評分和腦水含量，并通過調(diào)控miRNA664的表達(dá)降低MMP9相對表達(dá)量，誘導(dǎo)腦缺血耐受，減輕腦水腫，這可能是通督調(diào)神針灸預(yù)處理腦保護機制之一。

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Study of the Mechanism of Du Meridian-unblocking and Mind-regulating Acupuncture Pretreatment for Modu-lating miRNA664 and MMP9 in Cerebral Ischemia/reperfusion Rats

ZHENG Shi-ping，HAN Wei，CHU Hao-ran，WANG Ying，ZHANG Ling，ZHANG Guo-qing，ZHU Ling-ling.1.Anhui University of Traditional Chinese Medicine Second Hospital，Hefei 230061，China

ObjectiveTo investigate the effect of meridian-unblocking and mind-regulating acupuncture pretreatment on neurobehavioral functions and cerebral water content and explore its mechanism for modulating miRNA664 and MMP9 expressions in cerebral ischemia/reperfusion rats.MethodsOne hundred and thirty Wistar rats were randomized into group A（electroacupuncture pretreatment）of 30 rats，group B（moxibustion pretreatment）of 30 rats，group C（aspirin pretreatment）of 30 rats，group D（model）of 30 rats and group E（blank control）of 10 rats.Group A

electroacupuncture；group B，suspended moxibustion with moxa sticks；group C，an oral gavage of aspirin 10 mg/kg.A model of cerebral ischemia/reperfusion was made in every group after seven days.Rat neurobehavioral functions were observed and cerebral water content and relative miRNA664 and MMP9 expressions in the cortical region were determined at 24 hours after reperfusion.ResultsThere was a statistically significant difference in the neurobehavioral score between group A，B，C or D and group E（P＜0.01），between group A or B and group C（P＜0.01）and between groups A and B（P＜0.01）.There were statistically significant differences in cerebral water content and relative miRNA664 and MMP9 expressions between group A，B，C or D and group E（P＜0.01，P＜0.05），between group A，B or C and group D（P＜0.01），between group A or B and group C（P＜0.01，P＜0.05）and between groups A and B（P＜0.01，P＜0.05）.ConclusionsMeridian-unblocking and mind-regulating acupuncture pretreatment can effectively decrease the neurobehavioral score and cerebral water content and reduce relative MMP9 expression through modulating miRNA664 expression in cerebral ischemia/reperfusion rats.One of the mechanisms of Du meridian-unblocking and mind-regulating acupuncture pretreatment for protecting the brain may be reducing relative MMP9 expression，inducing tolerance to cerebral ischemia and relieving cerebral edema by the modulation of miRNA664 expression.

Acupuncture therapy；Unblocking Du meridian and regulating mind；miRNAs；MMP9；Ischemia/reperfusion；Rats；Electroacupuncture

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2016.01.0076

1005-0957（2016）01-0076-05

安徽省自然科學(xué)基金項目（1308085MH174）

鄭仕平（1986-），男，住院醫(yī)師

韓為（1972-），男，主任醫(yī)師，Email:13956060099@139.com

2015-08-14