針刺對急性腦梗死大鼠海馬區(qū)Cx43蛋白表達的影響

劉　坤，胡建功，張連城，肖震心，潘艷穎，楊寶旺，馬　妍，郭富斌，王占奎

（1.天津中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院，天津300150；2.天津中醫(yī)藥大學，天津300193；3.長春中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，長春130021）

針刺對急性腦梗死大鼠海馬區(qū)Cx43蛋白表達的影響

劉坤1，胡建功1，張連城1，肖震心1，潘艷穎1，楊寶旺1，馬妍2，郭富斌3，王占奎1

（1.天津中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院，天津300150；2.天津中醫(yī)藥大學，天津300193；3.長春中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，長春130021）

目的觀察針刺對缺血再灌注大鼠海馬區(qū)縫隙連接蛋白Cx43蛋白表達的影響。方法將Wistar大鼠隨機分為正常組、模型組、非穴位針刺組及針刺組。采用改良的線栓法制備大鼠大腦中動脈局灶性腦缺血再灌注模型，模型組、非穴位針刺組及針刺組內分設4個亞組，即缺血再灌注30 min組、缺血再灌注60 min組、缺血再灌注180 min組、缺血再灌注360 min組，每組10只。針刺組電針大鼠頂中線和頂旁線；非穴位針刺組取患側肋下髂嵴上10 mm的固定點作為針刺點；模型組不予任何處理。采用免疫組化法測Cx43蛋白表達情況。結果針刺組不同時間腦缺血再灌注后行為障礙（Bederson’s）評分與非穴位針刺組和模型組比較，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。模型組、針刺組和非穴位針刺組不同時間腦缺血再灌注后海馬Cx43灰度值與正常組比較，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。針刺組不同時間腦缺血再灌注后海馬Cx43灰度值與模型組和非穴位針刺組比較，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結論針刺可以阻斷Cx43的過度表達，干預大腦神經(jīng)元缺血再灌注損傷，在缺血性腦損傷中發(fā)揮神經(jīng)保護作用。

針刺療法；腦梗死；缺血再灌注；Cx43；大鼠；電針

腦卒中是當今人類死亡率最高的三大疾病之一，是人類致殘的主要原因。缺血性腦卒中源于腦血流減少和缺血性腦損傷，2006年Thompson RJ等［1］研究發(fā)現(xiàn)缺血缺氧條件能誘導神經(jīng)細胞膜半通道的開放。腦缺血時連接蛋白43（Cx43）半通道的開放對神經(jīng)元的影響已成為醫(yī)學界關注的焦點。在特特條件下（缺血、缺氧、機械刺激等因素［2-3］），半通道可以被激活開放，導致各種物質通過該通道進出細胞，引起神經(jīng)細胞的損傷。目前Cx43半通道已成為防治腦梗死時神經(jīng)細胞死亡的一個重要的干預靶標，為腦梗死的診治開辟了一個全新的研究方向。

本研究以Cx43為切入點，通過針刺干預大鼠大腦中動脈缺血再灌注模型，采用免疫組化檢測Cx43在大鼠腦缺血再灌注實驗模型中蛋白表達情況，探討其在早期腦缺血時的分布規(guī)律以及針刺對大鼠缺血側海馬區(qū)Cx43蛋白表達的干預作用，為針刺早期治療急性腦梗死提供一項重要指標及理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1動物模型制備及分組

健康清潔級雄性Wistar大鼠，體重250～300 g。按Longa改良的線栓法［4］制備動物腦缺血再灌注模型，缺血1 h后拔出線栓實現(xiàn)再灌注。采用Zausinger6分法［5］對其神經(jīng)功能進行評分，判斷模型成功與否。根據(jù)SPSS13.0生成的隨機表，隨機分為正常組、模型組、非穴位針刺組及針刺組。模型組及針刺組再分設4個亞組，即再灌注30 min組（I/R-30 min）、再灌注60 min組（I/R-60 min）、再灌注180 min組（I/R-180 min）和再灌注360 min組（I/R-360 min）。每組10只。

各組于相應操作后1 h觀察動物行為障礙的程度，參考Bederson JB等［6］評分標準記分。①動物有不停地向一側轉圈者，記1分。②提鼠尾離開地面30 cm，觀察前肢屈曲情況，如雙前肢對稱伸向地面，記為0分；如手術對側前肢出現(xiàn)腕屈曲、肘屈曲、肩內旋或既有腕、肘的屈曲又有肩內旋者，分別記為1、2、3、4分。③將大鼠兩前肢置一金屬網(wǎng)上，觀察大鼠兩前肢的肌張力，雙側肌力對等且有力者記為0分，同樣根據(jù)手術對側前肢肌張力下降程度不同記為1、2、3分。④將大鼠放于平地上，分別推其雙肩向對側移動，檢查阻力，如雙側對等且有力，記為0分；當向手術對側推動時阻力下降者，可根據(jù)下降程度不同分為輕、中、重3度，分別記為1、2、3分。

1.2實驗主要儀器和試劑

SFC-12體視顯微鏡（麥克奧迪實業(yè)集團有限公司）；FluoView?FV1000型共聚焦激光掃描顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；HPIAS-1000彩色圖像分析系統(tǒng)（同濟醫(yī)科大學千屏影像工程公司）；紅四氮唑（TTC，Sigma公司產(chǎn)）；APES粘片劑、高效切片石蠟、蘇木素、伊紅（天津瑞科生物技術有限公司）。

1.3實驗方法

1.3.1治療方法

針刺組取頂中線（MS5，百會向至前頂）、頂旁線（相當于國標頂旁2線MS9，承靈與正營連線）作為針刺穴位［7］。造模成功后，將大鼠固定于實驗臺上，用長25 mm的毫針沿皮刺入大鼠頂中線和頂旁線，然后接電針儀（KWD-8081，長城牌），用疏密波，頻率為2/15 Hz，電流強度為1 mA，強度以肢體輕微抖動為宜，留針10 min。非穴位針刺組選取患側肋下髂嵴上10 mm的固定點作為針刺點。正常組和模型組同樣抓取，不作其他處理。

1.3.2切片制備

(2)察汗烏蘇河地區(qū)1∶25 000地球化學測量圈定綜合異常60個，顯示異常元素種類多，元素組合明顯，異常強度高，濃集中心明顯，為后期找礦工作提供了較為詳實的地球化學資料。

大鼠于規(guī)定時間點斷頭取腦。去掉小腦和低位腦干，將待檢測缺血側腦組織在前聯(lián)合水平沿冠狀切面切下厚約2 mm的腦片，置于4%多聚甲醛中固定。梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋。用切片機行連續(xù)冠狀切片，厚5 μm，行HE和免疫組化染色。分別在低倍和高倍顯微鏡下觀察腦組織缺血區(qū)（海馬）病理變化，每張切片在缺血側半影區(qū)隨機選取5個視野，用HPIAS-100多媒體彩色病理圖文分析系統(tǒng)進行圖像分析，光鏡下觀察組織形態(tài)學變化。

1.3.3HE染色步驟

將石蠟切片放于60℃恒溫培養(yǎng)箱烘烤2 h，取出后至室溫；二甲苯透明脫蠟各10 min；梯度乙醇脫水各1 min；蘇木素染色5 min，清水沖洗1 min；乙醇分色1 min，清水沖洗1 min；伊紅染料復染20 s至1 min；梯度乙醇脫水各1 min；二甲苯透明，中性樹膠封片；光鏡下觀察腦組織染色情況。

1.3.4免疫組化具體步驟

將石蠟包塊切成厚度為5 μm連續(xù)組織切片，貼于經(jīng)多聚賴氨酸處理過的載玻片上，60℃烘烤1 h。將切片先后用二甲苯脫蠟、乙醇常規(guī)至水化。切片放入盛有檸檬酸鹽的緩沖液中，再放入微波爐內用中高檔進行抗原修復8 min，自然冷卻至室溫。1%甲醇雙氧水，室溫10 min，消除內源性過氧化酶活性，PBS洗3次，每次5 min。滴加10%山羊血清封閉液，室溫20 min，勿洗。滴加一抗，4℃過夜，PBS洗3次，每次5 min。滴加生物素化二抗（IgG），37℃孵育30 min，PBS洗3次，每次5 min。切片上滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液（S-A/HRP），37℃20 min，PBS洗3次，每次5 min。DAB顯色使用DAB顯色試劑盒，1 mL蒸餾水加顯色劑A、B、C各1滴，混勻，滴加至切片上，光學顯微鏡下觀察，以棕黃色為陽性表達，顯色約10 min，自來水沖洗終止顯色。蘇木素復染1 min，自來水返藍。經(jīng)梯度乙醇脫水、二甲苯透明及中性樹脂封片，再通過顯微鏡觀察，進行顯微照相（×400）。

1.3.5圖像分析

每個組別選取3張切片，每張切片隨機選取5個完整而不重疊的高倍鏡視野（×400），經(jīng)過微機程序處理進行測定，測量值為每個視野下陽性反應的平均光密度。背景值為同一張切片上胼胝體的平均光密度值，用前者減去后者可以得到矯正的平均光密度值。

1.4統(tǒng)計學方法

2　結果

2.1各組大鼠癥狀體征及神經(jīng)功能評價

實驗過程中共有7只動物在術中或術后死亡，死亡率為5.8%。死亡后大鼠斷頭取腦發(fā)現(xiàn)4只為腦出血，另3只行TTC染色發(fā)現(xiàn)手術同側大面積腦梗死，甚至對側也出現(xiàn)梗死，并有嚴重腦水腫，部分已經(jīng)液化。上述動物未列入行為障礙評分分析。另取7只大鼠造模后，補充入相應組內。正常組無大鼠死亡。

大鼠蘇醒后，除正常組動物外，各組動物多有不同程度的神經(jīng)癥狀體征表現(xiàn)，主要為一般精神狀態(tài)較差，精神萎靡，反應遲鈍。鼠毛蓬亂豎起，動作緩慢或活動減少，行動不協(xié)調，屈曲姿勢，表現(xiàn)為不同程度的手術對側前肢內收、屈曲，力弱，爬行時向一側轉圈，嚴重者不能前行、原地轉圈或偏癱（不能站立和行走）。針刺組不同時間腦缺血再灌注后行為障礙（Bederson’s）評分與非穴位針刺組和模型組比較，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。詳見表1。

2.2各組HE染色腦組織病理變化情況

正常組各時間點顯微鏡下可見各區(qū)域腦組織結構致密，層次清晰，細胞輪廓正常，核居中，細胞排列規(guī)則，核仁清楚，神經(jīng)細胞及毛細血管周圍間隙正常，毛細血管內可見紅細胞，神經(jīng)細胞無腫脹、核深染。模型組I/R-30 min亞組可見梗死區(qū)腦組織水腫，局灶性細胞核固縮，小部分神經(jīng)細胞腫脹，細胞輪廓模糊，神經(jīng)細胞和膠質細胞明顯減少；模型組I/R-60 min亞組可見神經(jīng)細胞變性、凋亡、壞死，排列無規(guī)則，神經(jīng)元脫失嚴重，神經(jīng)細胞腫脹，部分細胞核固縮深染；模型組I/R-180 min亞組缺血中心區(qū)神經(jīng)元、膠質細胞和血管大量壞死顯著，神經(jīng)細胞排列紊亂，極向不清，有空泡變，核結構不清，細胞骨架消失或嚴重破壞；模型組I/R-360 min亞組上述現(xiàn)象進一步加重，周圍可見較多凋亡細胞，病灶中心可見大量固縮核和核碎片，表現(xiàn)為神經(jīng)元壞死、變性、胞核濃縮、濃染、胞漿腫脹。針刺組各亞組神經(jīng)元、膠質細胞、毛細血管結構恢復程度等方面與同時間點模型組亞組比較，改善明顯。非穴位針刺組各亞組對以上結構損傷沒有改善作用。

2.3各組Cx43陽性細胞變化情況

正常組可見棕黃色著色顆粒，均有Cx43陽性表達，分布于星形膠質細胞膜及周圍突起；模型組各亞組海馬區(qū)均有Cx43陽性表達，較正常組著色顆粒明顯減少，分布于星形膠質細胞膜及周圍突起，隨缺氧、缺血后時間的推移，Cx43陽性表達有逐漸增加的趨勢；針刺組各亞組著色顆粒隨時間的延長而逐漸增加，與模型組比較，Cx43陽性表達呈逐漸降低的趨勢；非穴位針刺組各亞組對Cx43陽性表達無明顯改善。詳見圖1。

表1　各組大鼠行為障礙（Bederson’s）評分比較（x±s，分）

圖1　各組大鼠腦缺血再灌注后海馬Cx43陽性細胞變化

表2　各組大鼠腦缺血再灌注后海馬Cx43陽性細胞平均灰度值比較（x±s，個/半側切面）

模型組、針刺組和非穴位針刺組不同時間腦缺血再灌注后海馬Cx43灰度值與正常組比較，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。針刺組不同時間腦缺血再灌注后海馬Cx43灰度值與模型組和非穴位針刺組比較，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。詳見表2。

3　討論

間隙連接是一個低電阻的細胞間通道，參與信號的傳遞和保持代謝的連續(xù)性。間隙連接的基本結構是連接蛋白，大腦中星形膠質細胞間具有廣泛的間隙連接，主要由Cx43構成。Cx43形成的通道主要有半通道和間隙連接通道［8］。在正常生理情況下，間隙連接通道處于開放狀態(tài)，允許細胞間通訊，而半通道則處于關閉狀態(tài)［9］。半通道是目前認為相鄰細胞間唯一能直接進行能量、物質和信息交換的一種特特通道，廣泛存在于神經(jīng)系統(tǒng)中，在神經(jīng)細胞的分化、發(fā)育和生理功能的調節(jié)中起重要的作用［10］。在缺血缺氧等因素下，半通道可被激活開放，導致各種物質通過該通道進出細胞，導致神經(jīng)細胞的損傷。半通道的基本結構單位為連接蛋白，Cx43是神經(jīng)系統(tǒng)內的主要連接蛋白，在哺乳動物腦組織中表達最強，且在神經(jīng)系統(tǒng)信號傳遞及各種反應中發(fā)揮重要作用。大腦缺血再灌注損傷常對病灶周圍的神經(jīng)元造成不可逆的損傷，危害極大。Cx43參與大腦的缺血再灌注損傷，在腦缺血再灌注損傷的不同階段都發(fā)揮重要作用。在腦缺血再灌注過程中半通道的開放是一個隨著時間而遞增的過程。有研究［11］表明，缺血初期半通道僅有少量開放，之后開放量有顯著增加，尤其是再灌注初期，刺激誘導更大量的半通道開放。隨著Cx43的表達增強，間隙連接產(chǎn)生跨細胞膜信號，加劇神經(jīng)細胞損傷。其機制可能為缺血缺氧后，早期產(chǎn)生的一系列代謝應激信號如鈣流、氧自由基、興奮性氨基酸等毒性物質通過增強的Cx43半通道迅速跨膜傳導進入周邊細胞，使病變范圍擴大，加重半暗區(qū)的凋亡，加重腦損傷［12］。因此，阻斷Cx43半通道表達可減少神經(jīng)元的獨立生存能力，而合理調控Cx43的表達可預防大腦神經(jīng)元缺血再灌注損傷。

針刺作為一種天然的“阻滯劑”在干預Cx43在大腦缺血再灌注損傷的過程中起著重要作用。本實驗結果顯示，模型組各時間點海馬星形膠質細胞的Cx43表達均較正常組明顯增強，腦損傷后30 min Cx43表達已開始增加，隨著時間變化逐漸增強至360 min最為明顯，這種變化規(guī)律與腦組織病理改變嚴重程度、神經(jīng)細胞凋亡的時間框架是相吻合的，并且Cx43發(fā)生變化開始時間早于細胞凋亡出現(xiàn)的時間，說明星形膠質細胞Cx43表達的增強參與了大鼠急性腦損傷的病理形成過程。而針刺能明顯改善急性腦梗死大鼠形態(tài)學的變化，如減輕神經(jīng)細胞水腫狀態(tài)、減小梗死區(qū)域、抑制炎性細胞的浸潤等。這與針刺可以阻斷Cx43的過度表達，干預大腦神經(jīng)元缺血再灌注損傷有關。

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Effect of Acupuncture on Cx43 Protein Expression in the Hippocampal Region in Rats with Acute Cerebral Infarction

LIU Kun1，HU Jian-gong1，ZHANG Lian-cheng1，XIAO Zhen-xin1，PAN Yan-ying1，YANG Bao-wang1，MA Yan2，GUO Fu-bin3，WANG Zhan-kui1.1.Tianjin University of Traditional Chinese Medicine Second Hospital，Tianjin 300150，China；2.Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China；3.Changchun University of Traditional Chinese Medicine Hospital，Changchun 130021，China

ObjectiveTo investigate the effect of acupuncture on gap junction protein Cx43 expression in the hippocampal region in ischemia/reperfusion rats.MethodsWistar rats were randomized into normal，model，non-point acupuncture and acupuncture groups.A rat model of focal cerebral ischemia/reperfusion was made by modified middle cerebral artery thread occlusion.The model，non-point acupuncture and acupuncture groups were separately divide into four subgroups:30，60，180 and 360 min ischemia/reperfusion，10 rats each.The middle and lateral lines of vertex were given electroacupuncture in the acupuncture group of rats.A subcostal fixed point 10 mm above the iliac crest on the affect side was selected as an acupuncture point in thenon-pointacupuncturegroup.Themodelgroupwasnottreated.Cx43proteinexpressionwasdeterminedby an immunohistochemical method.ResultsThere was a statistically significant difference in the behavior disorder（Bederson’s）score between the acupuncture group and the non-point acupuncture or model group after different times of cerebral ischemia/ reperfusion（P＜0.05）.There was a statistically significant difference in hippocampal Cx43 content between model，acupuncture or non-point acupuncture group and the normal group and between the acupuncture group and the model or non-point acupuncture group after different times of cerebral ischemia/reperfusion（P＜0.05）.ConclusionsAcupuncture can inhibit the overexpression of Cx43，intervene in cerebral ischemia-reperfusion injury and produce a neuroprotective effect in ischemic brain injury.

Acupuncture therapy；Cerebral infarction；Ischemia/reperfusion；Cx43；Rats；Electroacupuncture

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2016.01.0090

1005-0957（2016）01-0090-04

國家自然科學基金項目（81102640）；天津市應用基礎與前沿技術研究計劃（14JCZDJC36800）

劉坤（1978-），女，檢驗醫(yī)師

王占奎（1977-），男，主治醫(yī)師，Email:wzk21cn@163.com

2015-09-03