電針對糖尿病性胃輕癱模型大鼠INS水平和CCK含量的影響

賀鳳娥，萬全荃，林亞平，彭　艷，沈　菁

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)，長沙410007）

電針對糖尿病性胃輕癱模型大鼠INS水平和CCK含量的影響

賀鳳娥，萬全荃，林亞平，彭艷，沈菁

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)，長沙410007）

目的觀察電針對糖尿病胃輕癱（DGP）大鼠血清胰島素（INS）水平和胃竇組織膽囊收縮素（CCK）含量的影響。方法將60只SD大鼠隨機分為A組、B組、C組、D組和E組，每組12只。A組為正常對照組，B組、C組、D組和E組采用腹腔一次性注射2%鏈脲佐菌素（STZ）配合高糖高脂不規(guī)則飲食建立DGP模型。B組為模型組，不接受治療；C組采用電針足三里、三陰交和梁門治療；D組采用電針足三里、三陰交和梁門的對照點治療；E組采用甲氧氯普胺片（胃復(fù)安）藥液灌胃治療。采用OneTouch血糖儀測血糖，尿糖試紙測尿糖，酚紅灌胃法測胃排空率和腸移行率，并采用ELISA法檢測各組大鼠治療前后血清INS水平和胃竇組織CCK的含量。結(jié)果B組、C組、D組和E組大鼠血糖值及尿糖值與A組比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。C組大鼠血糖值及尿糖值與B組和E組比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。B組、C組、D組和E組大鼠胃排空率與A組比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。C組大鼠胃排空率與B組和D組比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.05）。B組和D組大鼠腸移行率與A組比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。C組大鼠腸移行率與B組和D組比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。B組大鼠血清INS水平及胃竇組織CCK含量與A組比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。D組大鼠胃竇組織CCK含量與A組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。C組和E組大鼠血清INS水平及胃竇組織CCK含量與B組比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。C組大鼠胃竇組織CCK含量與D組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論電針能明顯改善DGP大鼠的胃腸功能癥狀，促進(jìn)胃排空，其療效可能與電針刺激能提高血清INS水平，同時降低胃竇組織CCK含量有關(guān)。

針刺療法；電針；胃輕癱；糖尿病并發(fā)癥；胰島素；膽囊收縮素

糖尿病胃輕癱（diabetic gastroparesis，DGP）又稱糖尿病性胃麻痹或胃潴留，是以胃動力低下為特點的臨床癥候群，是糖尿病慢性并發(fā)癥之一，其主要臨床表現(xiàn)為腹痛、餐后飽脹、食欲不振、噯氣、反酸、惡心干嘔、體重減輕等癥狀。血糖控制不良是糖尿病發(fā)生并發(fā)癥的主要原因之一，糖尿病并發(fā)癥是決定糖尿病患者預(yù)后的最主要因素，是導(dǎo)致糖尿病致死和致殘的最主要原因。

DGP發(fā)病機制相當(dāng)復(fù)雜，至今尚未闡明。研究認(rèn)為高血糖不僅可直接影響自主神經(jīng)功能及胃腸激素的分泌，而且還可直接影響胃的運動功能，血糖濃度的增高與胃排空延緩之間互為因果關(guān)系［1］。

近年來，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療DGP大多是在控制血糖的基礎(chǔ)上配合促胃腸動力藥，如甲氧氯普胺片（胃復(fù)安）、多潘立酮片（嗎丁啉）等，其副反應(yīng)較大，易產(chǎn)生耐藥性。而中醫(yī)針灸治療DGP有其獨特的療效和優(yōu)勢，其作用主要以多環(huán)節(jié)、多靶點、多層次的綜合調(diào)節(jié)為特點，且復(fù)發(fā)率較低，副反應(yīng)較少?，F(xiàn)代研究亦表明，電針足三里等穴對胃腸功能不良患者胃腸運動功能具有調(diào)節(jié)作用。基于以上認(rèn)識，本實驗以DGP模型大鼠為研究對象，觀察電針對DGP大鼠胃動力障礙的治療作用以及對DGP模型大鼠血清胰島素（insulin，INS）水平和胃竇組織膽囊收縮素（cholecystokinin，CCK）含量的影響，現(xiàn)報告如下。

1　材料與方法

1.1實驗動物

60只健康SD大鼠，SPF級，雌雄各半，體重為（231 ±10）g，購自湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司（動物質(zhì)量合格證號43004700002152）。隨機分為A組、B組、C組、D組和E組，每組12只。

1.2試劑與儀器

鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ），美國Sigama公司生產(chǎn)；高糖高脂飼料，由普通飼料按比例（普通飼料、熟豬油、蔗糖、奶粉、雞蛋之間比例為58:15: 20:5:2）加工而成；血糖儀及血糖試紙，美國強生公司生產(chǎn)；尿糖試紙，廣州花都高爾寶生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；SDZ-Ⅱ型電針儀，蘇州醫(yī)療用品廠有限公司生產(chǎn)；針灸針，蘇州華倫醫(yī)療用品有限公司生產(chǎn)；甲氧氯普胺片（胃復(fù)安），山西云鵬制藥生產(chǎn)；酚紅，天津恒興化學(xué)試劑制造有限公司生產(chǎn)；氫氧化鈉，湖南匯虹試劑公司生產(chǎn)；三氯乙酸，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)；ELISA法檢測血清INS水平、胃竇組織CCK含量試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.3DGP模型制作

將大鼠購回先適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，然后禁食12 h，按55 mg/kg的劑量于左下腹腔內(nèi)單次注射2%STZ溶液，72 h后取尾靜脈血，采用OneTouch血糖儀和血糖試紙測血糖，即刻血糖≥16.7 mmol/L者作為糖尿病大鼠。之后給予高糖高脂飼料不規(guī)則喂養(yǎng)（即采取單日上午和雙日下午進(jìn)食法）持續(xù)8星期，期間檢測血糖＜16.7 mmol/L者予以剔除。DGP造模成功指標(biāo)分為①血糖≥16.7mmol/L，尿糖呈陽性；②大鼠一般情況及大便性狀與正常對照組有明顯差別；③大鼠胃排空率及腸移行率與正常對照組相比有顯著差異。

1.4處理方法

1.4.1A組

正常飼養(yǎng)（以下各組略），不進(jìn)行造模及治療，每日捆綁20 min。

1.4.2B組

造模，不給予任何治療，每日捆綁20 min。

1.4.3C組

造模成功后，取足三里、三陰交和梁門穴。穴位定位參照李忠仁主編的《實驗針灸學(xué)》常用動物穴位定位法及擬人對照法定位，以胸鎖聯(lián)合和恥骨聯(lián)合連線下1/4與上3/4交點為肚臍，足三里位于膝關(guān)節(jié)后外側(cè)，腓骨小頭下約5 mm處；三陰交位于后肢內(nèi)踝尖直上10 mm處；梁門位于胸劍聯(lián)合到肚臍連線中點的水平線與鎖骨中線相交處。將大鼠束縛于鼠板上，定位后局部剪毛，采用0.32 mm×25 mm毫針直刺5～7 mm，針刺后接用電針治療儀，一組輸出線的負(fù)極接在穴位上，正極接在該穴位下2 mm的附點上，每只大鼠共接3組輸出線，采用疏密波（疏波為10 Hz，密波為50 Hz；疏波時間為5 s，密波時間為10 s），強度以毫針或穴位周圍肌肉出現(xiàn)輕微顫動為度，留針20 min。隔日左右交替治療，每日1次，連續(xù)治療15 d。

1.4.4D組

造模成功后，取足三里、三陰交和梁門穴的相應(yīng)對照點。足三里對照點在平足三里穴外側(cè)5 mm處；三陰交對照點在平三陰交穴內(nèi)側(cè)5 mm處；梁門對照點在平梁門穴外側(cè)5 mm處。電針方法及療程同C組。

1.4.5E組

以1.7%甲氧氯普胺片（胃復(fù)安）藥液按1 mL/100 g灌胃治療。每日1次，連續(xù)治療15 d。

1.5標(biāo)本采集

實驗期間大鼠均自由攝食和飲水。實驗第15天處理后，5組大鼠禁食24 h，禁水2 h。第16天所有大鼠予腹腔注射10%水合氯醛麻醉后取材。

血清處理:腹主動脈采血，常溫放置2～3 h，4℃3000 r/min離心15 min，取上清液，EP管分裝，-20℃保存，待測INS水平。

胃腸處理:大鼠剖腹，結(jié)扎賁門及幽門取胃，沿胃大彎切開，用冰0.9%氯化鈉溶液沖洗并收集胃內(nèi)容物，定容20 mL，測胃排空；迅速剪取胃竇組織一塊置凍存管中，液氮中保存，待測CCK含量；取小腸，測腸移行率。

1.6觀察指標(biāo)

1.6.1血糖及尿糖值

取尾靜脈血用OneTouch血糖儀及血糖試紙測血糖，用尿糖試紙測尿糖。

1.6.2胃排空

將收集的20 mL胃內(nèi)容物加入0.5 mol/L氫氧化鈉溶液20 mL攪拌混勻，靜置1 h后，取5 mL上清液，加入20%三氯乙酸0.5 mL去蛋白，以3500 r/min離心10 min，取上清液在560 nm波長紫外分光光度計下檢測吸光度值（OD）。胃排空率計算公式為，胃排空率=［1 -實測酚紅吸光度（OD）/標(biāo)準(zhǔn)酚紅吸光度（OD）］× 100%。

1.6.3腸移行率

將小腸輕輕剝離后直鋪在冰面上，先肉眼觀察小腸被酚紅染成紅色的末端，然后用眼科剪在該末端剪一小口，往該口上滴少量0.5 mol/L氫氧化鈉溶液，若變紫色則為酚紅到達(dá)的部位，之后在紫色區(qū)前后各滴少量氫氧化鈉溶液以確定酚紅到達(dá)的實際部位。腸移行率計算公式為，腸移行率=［小腸被酚紅染成紅色的末端至幽門的距離（a）/小腸的總長度（A，即幽門至回盲瓣的距離）］×100%。

1.6.4血清INS水平及胃竇組織CCK含量測定

采用ELISA法檢測，按照南京建成生物工程研究所試劑盒的要求進(jìn)行。

1.7統(tǒng)計學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計處理。資料進(jìn)行正態(tài)性檢驗，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組計量資料采用單因素方差分析（One-way ANOVA），方差齊者用LSD法，方差不齊者用Dunnett’s T3法；不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)用中位數(shù)（四分位間距）［M（Q）］表示，采用秩和檢驗。以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1各組大鼠血糖值及尿糖值比較

表1　各組大鼠血糖值及尿糖值比較［M（Q）］

由表1可見，B組、C組、D組和E組大鼠血糖值及尿糖值與A組比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），提示造模成功。C組大鼠血糖值及尿糖值與B組和E組比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），提示C組控制血糖值及尿糖值優(yōu)于B組和E組。

2.2各組大鼠胃排空率及腸移行率比較

由表2可見，B組、C組、D組和E組大鼠胃排空率與A組比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。C組大鼠胃排空率與B組和D組比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.05）。B組和D組大鼠腸移行率與A組比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。C組大鼠腸移行率與B組和D組比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

表2　各組大鼠胃排空率及腸移行率比較（x±s，%）

2.3各組大鼠血清INS水平及胃竇組織CCK含量比較

由表3可見，B組大鼠血清INS水平及胃竇組織CCK含量與A組比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。D組大鼠胃竇組織CCK含量與A組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。C組和E組大鼠血清INS水平及胃竇組織CCK含量與B組比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。C組大鼠胃竇組織CCK含量與D組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表3　各組大鼠血清INS水平及胃竇組織CCK含量比較（x±s）

3　討論

糖尿病是一種嚴(yán)重危害人類健康的常見病、多發(fā)病，其發(fā)病率高，并發(fā)癥多，已成為繼腫瘤和心腦血管疾病之后的第3大疾?。?-3］。預(yù)計到2025年，全世界的糖尿病患者將達(dá)3億，其中有50%～76%糖尿病患者并發(fā)胃輕癱［4］。DGP的主要病理表現(xiàn)為胃運動減弱，胃排空延遲，致食物滯留于胃腔內(nèi)。以往研究顯示針灸可通過影響胃腸激素的釋放來調(diào)節(jié)胃腸運動［5］。本課題組在針灸足陽明經(jīng)穴對胃黏膜保護(hù)作用方面進(jìn)行了長期大量的研究，證實針灸可調(diào)節(jié)胃運動［6-7］。本實驗在以往研究的基礎(chǔ)上，認(rèn)為電針足三里等穴可提高血清INS水平，降低胃竇組織CCK含量，以促進(jìn)胃排空，控制血糖值，改善DGP癥狀。

INS是促進(jìn)合成代謝、調(diào)節(jié)血糖穩(wěn)定的主要激素，INS的分泌不足會直接或間接影響血糖的穩(wěn)定，從而反饋性地影響胃運動，血糖的升高則可抑制胃排空。本研究結(jié)果顯示，DGP模型大鼠血清INS水平下降，與以往研究結(jié)果一致。而經(jīng)電針足三里等穴治療的DGP大鼠血清INS水平高于B組，血糖值顯著低于B組，表明電針足三里等穴能夠提高機體血清INS水平，控制血糖。

CCK既是胃腸道激素又是神經(jīng)肽，廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和周圍神經(jīng)系統(tǒng)中，可對餐后胃排空、胃腸動力以及攝食、飽感和鎮(zhèn)痛具有重要的調(diào)節(jié)作用［8］。在對人、狗、鼠、兔、猴等多種哺乳動物實驗研究中發(fā)現(xiàn)，CCK能抑制進(jìn)食后的胃排空活動，且濃度與胃的排空率呈反比關(guān)系［8］。有研究［9］發(fā)現(xiàn)，CCK對胃運動的調(diào)節(jié)，主要是使近端胃松弛，抑制胃竇運動，延緩胃排空。CCK可通過其特異性受體（CCK-AR、CCK-BR）來抑制胃排空，產(chǎn)生飽腹感抑制攝食行為［10］。本實驗結(jié)果顯示，DGP模型大鼠胃竇組織CCK含量明顯增高，胃排空及腸移行率明顯降低，而經(jīng)電針足三里等穴治療的DGP大鼠胃竇組織CCK含量低于B組，且胃排空及腸移行率均高于B組，提示電針足三里等穴可降低機體胃竇組織CCK含量，從而促進(jìn)胃排空，改善胃腸功能障礙。

綜上所述，電針足三里等穴可促進(jìn)DGP模型大鼠的胃腸運動，控制血糖值，其機制可能與血清INS水平的升高和胃竇組織CCK含量的降低有關(guān)。但其機制是通過何種信號途徑達(dá)到效應(yīng)，則有待進(jìn)一步的研究。

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Effect of Electroacupuncture on the INS Level and CCK Content in a Rat Model of DGP

HE Feng-e，WAN Quan-quan，LIN Ya-ping，PENG Yan，SHEN Jing.Hunan University of Traditional Chinese Medicine，Changsha，Hunan 410007，China

ObjectiveTo investigate the effect of electroacupuncture on serum insulin（INS）levels and gastric antral cholecystokinin（CCK）content in rats with diabetic gastroparesis（DGP）.MethodsSixty SD rats were randomized into groups A，B，C，D and E，12 rats each.Group A is a normal control.A DGP model was made by an intraperitoneal injection of 2%streptozocin（STZ）plus an irregular high sugar and fat diet in groups B，C，D and E.group B is a model one and did not receive treatment.Group C

electroacupuncture at points Zusanli，Sanyinjiao and Liangmen；group D，electroacupuncture at the control points of Zusanli，Sanyinjiao and Liangmen.Group C，an oral gavage of metoclopramide tablet solution.Blood sugar and urine sugar were determined using a OneTouch lood glucose meter and Tes-Tape，respectively.The gastric emptying rate and the intestinal migration rate were measured by an oral gavage of phenol red.Serum INS levels and gastric antral CCK content were measured by ELISA in every group of rats before and after treatment.ResultsThere were statistically significant differences in blood and urine sugar values between group B，C，D or E rats and group A（P＜0.01）and between group C rats and group B or E（P＜0.05）.There was a statistically significant difference in the gastric emptying rate between group B，C，D or E rats and group A（P＜0.01）and between group C rats and group B or D（P＜0.01，P＜0.05）.There was a statistically significant difference in the intestinal migration rate between group B or D rats and group A（P＜0.01）and between group C rats and group B or D（P＜0.01）.There were statistically significant differences in serum INS levels and gastric antral CCK content between groups B and A rats（P＜0.05，P＜0.01）.There was a statistically significant difference in gastric antral CCK content between groups D and A rats（P＜0.01）.There were statistically significant differences in serum INS levels and gastric antral CCK content between groups C or E rats and group B（P＜0.05，P＜0.01）.There was a statistically significant difference in gastric antral CCK content between groups C and D rats（P＜0.05）.ConclusionsElectroacupuncture can markedly improve gastrointestinal functions and promote gastric emptying in DGP rats.Its therapeutic effect may be related to electroacupuncture raising serum INS levels and reducing gastric antral CCK content.

Acupuncture therapy；Electroacupuncture；Gastroparesis；Diabetic complications；Insulin；Cholecystokinin

加

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2016.01.0081

1005-0957（2016）01-0081-04

國家自然科學(xué)基金項目（81403487）；湖南省高校創(chuàng)新平臺開放基金項目（12K088）

賀鳳娥（1987-），女，2012級碩士生

林亞平（1956-），女，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向為針灸治病的臨床與實驗研究，Email:lyp5381161@126.com

2015-09-12