五味子和黃精對副溶血弧菌及其生物膜的體外抑制作用

龐歡瑛，黃芝鳳，黃 洋，黃郁蔥，魯義善，簡紀(jì)常

（廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院/廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動物病原生物學(xué)及流行病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省教育廳水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動物病害控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江　524088）

五味子和黃精對副溶血弧菌及其生物膜的體外抑制作用

龐歡瑛，黃芝鳳，黃 洋，黃郁蔥，魯義善，簡紀(jì)常

（廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院/廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動物病原生物學(xué)及流行病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省教育廳水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動物病害控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江524088）

采用瓊脂擴(kuò)散法，分別測定五味子（Shisandra chinensis）、黃精（Polygonatum sibiricum）對副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）的體外抑菌作用；選用倍比稀釋法確定五味子、黃精對副溶血弧菌的最小抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC）；采用改良微孔板法（MTT）評價(jià)兩種中草藥液對溶藻弧菌生物膜形成的影響。結(jié)果表明，兩種中草藥都有不同程度的抑制副溶血弧菌的作用，五味子對副溶血弧菌的抑菌圈直徑為18.67（±0.2）mm，MIC為1.56 mg/mL，MBC為3.125 mg/mL；黃精的抑菌圈直徑為11.26（±0.6）mm，MIC和MBC分別為1.56、3.125 mg/mL。當(dāng)藥物濃度達(dá)到3.125 mg/mL以上時(shí)，五味子和黃精對副溶血弧菌生物膜的形成有極顯著抑制作用。

五味子；黃精；副溶血弧菌；體外抑制作用；生物膜

龐歡瑛，黃芝鳳，黃洋，等. 五味子和黃精對副溶血弧菌及其生物膜的體外抑制作用［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，43（9）：119-123.

副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）屬于弧菌科（Vibrionaceae）弧菌屬（Vibrio），是一種革蘭氏陰性嗜鹽桿菌，廣泛存在于沿岸海水、海河交界處及水生動物中，能引起魚、蝦、蟹和貝類等多種養(yǎng)殖動物的疾?。?-2］，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。此外，副溶血弧菌能導(dǎo)致食物中毒，嚴(yán)重危害人類健康［3］。生物膜（Biofilm）是細(xì)菌在自然界中為了抵抗外界不利因素而形成的微生物群體結(jié)構(gòu)，是微生物（如細(xì)菌）最主要的存在方式［4］。副溶血弧菌形成生物膜后能更強(qiáng)烈地抵御抗生素藥物的殺滅作用（即產(chǎn)生抗藥性）［5］，同時(shí)也能更有效逃避宿主細(xì)胞的免疫作用，給弧菌病的預(yù)防和治療造成困難。因此，關(guān)于弧菌生物膜防治的研究成為當(dāng)前弧菌病防治的熱門研究課題之一。

中草藥是我國醫(yī)學(xué)寶庫中最珍貴的財(cái)富之一，許多中草藥含有抗菌活性強(qiáng)、毒性低的有效成分。五味子（Shisandra chinensis）屬于木蘭科五味子族五味子屬，俗稱玄及、山花椒、五梅子、壯味、五味，其果實(shí)、種子、藤莖均可入藥［6］。五味子富含維生素、植物固醇、有機(jī)酸、類黃酮及木脂素［7］，具有降酶保肝、保護(hù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)、抗腫瘤、抗衰老、抑菌等作用［8］。黃精（Polygonatum sibiricum）又名爪子參、雞爪參、雞頭黃精、老虎姜、黃雞菜，為曬干或烘干后的百合科植物黃精等的根莖。黃精根莖含有豐富的黃精多糖、甾體皂苷、蒽醌、強(qiáng)心苷、木質(zhì)素［9］，臨床上用于治療肺結(jié)核、癬菌病，藥理上具有抗病原微生物、抗病毒及抗炎作用［10］。五味子和黃精是常用的中草藥，它們在防治水產(chǎn)動物疾病中有著廣泛的應(yīng)用。吳穎瑞等采用瓊脂擴(kuò)散法測定了153種中草藥乙醇提取物對羅非魚海豚鏈球菌的抑菌活性，發(fā)現(xiàn)北五味子對海豚鏈球菌具有明顯的抑菌活性［11］。陳輝等采用瓊脂擴(kuò)散法測定100種常見中草藥提取液對溶藻弧菌的抑制作用，發(fā)現(xiàn)黃精的最小抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC）均為500 mg/mL，五味子的MIC和MBC均為1 000 mg/ mL［12］。目前，尚鮮見關(guān)于五味子和黃精對副溶血弧菌及其生物膜抑制作用的報(bào)道。本研究通過測定五味子和黃精對副溶血弧菌及其生物膜的體外抑制作用，探索這兩種中藥的抑菌和抗生物膜功能，為今后應(yīng)用中藥防治由該菌引起的弧菌病提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1菌株 副溶血弧菌GZ01由廣東省湛江海域患病石斑魚（Epinephelus coioides）魚體中分離并保存。五味子、黃精購自湛江春天藥房。

1.1.2主要儀器 -80℃超低溫冰箱，青島海爾公司產(chǎn)品；SZ-93自動雙重雙蒸水蒸餾器，上海市亞榮生化儀器廠產(chǎn)品；自動高壓滅菌鍋（HVE-50），日本HIRAYAMA公司產(chǎn)品；恒溫培養(yǎng)箱為上海市博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠產(chǎn)品；超凈工作臺，上海匯龍儀表電子有限責(zé)任公司生產(chǎn)；搖床，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠生產(chǎn)；酶標(biāo)儀，美國Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.1.3藥品及試劑配制 胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基（TSB）：大豆蛋白胨5 g、胰蛋白胨15 g、NaCl 20 g，蒸餾水定容至1 000 mL（調(diào)節(jié)pH至7.2），高壓滅菌，4℃保存。胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（TSA）：大豆蛋白胨5 g、胰蛋白胨15 g、瓊脂粉15 g、NaCl 20 g，蒸餾水定容至1 000 mL（調(diào)節(jié)pH至7.2）。MTT 配制：0.5 g MTT，溶于 100 mL磷酸緩沖液（PBS），用 0.22 μm濾膜過濾除，4℃避光保存。PBS：Na2HPO41.44 g，NaCl 8 g，KCl 0.2 g，KH2PO40.24 g，調(diào)節(jié)pH至7.4，定容至1 L。高壓蒸汽滅菌，室溫保存。0.85%生理鹽水：NaCl 0.85 g，用蒸餾水定容至1 000 mL，高壓鍋滅菌后備用。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1副溶血弧菌培養(yǎng) 副溶血弧菌接種在含2%NaCl的胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)液（TSB）中，28℃下120 r/min搖床培養(yǎng)18 h。用TSB將菌懸液的濃度調(diào)至約OD600=0.8備用（約108CFU/ mL）［12］。

1.2.2中草藥水煎液的制備 中草藥水煎液的制備參照黎家勤等［13］的方法。

1.2.3藥物體外抑菌試驗(yàn) 采用瓊脂擴(kuò)散法。每種藥液3次重復(fù)，分別向TSA平板加100 μL菌液，涂抹均勻。然后用打孔器在每個(gè)平板上打3個(gè)孔（每孔直徑為6.00 mm，且兩孔之間相距不小于2 cm），每孔加入30 μL藥液。另設(shè)1個(gè)涂有副溶血弧菌菌液的平板作對照，將平板置于28℃培養(yǎng)24 h，觀察抑菌效果并用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈。抑菌效果判定：抑菌圈直徑≥20 mm為強(qiáng)抑菌作用，用“+++”表示；15～20 mm為中等抑菌作用，用“++”表示；10～15 mm為弱抑菌作用，“+”表示；≤10 mm為無抑菌作用，以“-”表示。

1.2.4MIC的測定 采用倍比稀釋法確定最小抑菌濃度，參照馮銳基等［14］的方法。

1.2.5MBC的測定 在最小抑菌濃度的試管中取細(xì)菌生長不明顯的試管，取100 μL分別涂布于TSA平板，于28℃培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果。TSA平板上沒有細(xì)菌生長且含藥液濃度最低管的藥液濃度，即為該種藥物對溶藻弧菌的最小殺菌濃度［15］。

1.2.6副溶血弧菌生物膜的形成與定量檢測生物膜活性測定：利用四甲基偶氮唑鹽（MTT）法［15］測定生物膜活性，具體實(shí)驗(yàn)步驟參照黎家勤等的方法［13］。

1.2.7不同培養(yǎng)時(shí)間對副溶血弧菌成膜的影響將副溶血弧菌接種于96孔板后置于28℃濕盒中靜止培養(yǎng)，每隔4～6 h取樣，按1.2.6方法測定成膜情況。

1.2.8中草藥液對副溶血弧菌生物膜形成的影響 在無菌條件下，將細(xì)菌懸浮液與TSB按1∶100的比例混合均勻，加入中草藥水煎液，倍比稀釋后，分別上樣200 μL至96孔板中，每個(gè)處理設(shè)8個(gè)重復(fù)孔，并設(shè)置陽性對照（含0.1 mol/L EDTA）、陰性對照（含培養(yǎng)基和菌液）和僅含培養(yǎng)基的空白對照，28℃濕盒中培養(yǎng)12 h，按1.2.6步驟測定成膜情況。按以上方法設(shè)立無菌的藥物對照。

用SPSS 17.0 軟件中的成對樣本t 檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2　結(jié)果與分析

2.1兩種中草藥對副溶血弧菌的抑菌效果

對五味子和黃精兩種中草藥體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果（表1）表明，五味子對副溶血弧菌有中等抑菌作用，黃精有弱抑菌作用。

表1　五味子和黃精對副溶血弧菌的體外抑菌效果

2.2MIC和MBC測定結(jié)果

選用倍比稀釋法測定五味子、黃精對副溶血弧菌的MIC和MBC，結(jié)果（表2）顯示，五味子和黃精的抑菌效果一樣，MIC和MBC分別為1.56、3.125 mg/mL。

表2　五味子和黃精對副溶血弧菌的MIC和MBC

2.3副溶血弧菌生物膜的生長曲線

用MTT法對生物膜進(jìn)行定量檢測，得到副溶血弧菌生物膜的生長曲線（圖1），由圖1可知，副溶血弧菌生物膜成膜量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。在12 h時(shí)OD590值達(dá)到最大，極顯著高于其他時(shí)間的檢測值。即在前12 h 中生物膜成膜量為逐漸增加，在12 h時(shí)形成的生物膜成膜量最大，12 h后又逐漸下降并出現(xiàn)再次上升現(xiàn)象，但均小于12 h時(shí)的成膜量。

圖1　副溶血弧菌生物膜的生長曲線

2.4不同藥物濃度對副溶血弧菌生物膜形成的影響

與陰性對照相比，五味子藥物濃度在3.125mg/mL 以下時(shí)，雖對副溶血弧菌生物膜成膜量有所影響，但差異不顯著，藥物濃度為3.125 mg/ mL 時(shí)開始出現(xiàn)明顯的抑制作用，藥物濃度超過3.125 mg/mL時(shí)有極顯著抑制作用（圖2）。

圖2　五味子對副溶血弧菌生物膜形成的影響

與陰性對照相比，黃精對副溶血弧菌生物膜成膜量的影響表現(xiàn)為：黃精煎液濃度在1.56 mg/mL及以下時(shí)，對副溶血弧菌生物膜成膜量有所影響，但差異不顯著，藥物濃度在3.125 mg/ mL及以上時(shí)，成膜量呈現(xiàn)極顯著下降，即有極顯著抑制作用（圖3）。

圖3　黃精對副溶血弧菌生物膜形成的影響

3　結(jié)論與討論

目前，在海水養(yǎng)殖業(yè)持續(xù)發(fā)展中出現(xiàn)了各種致病性弧菌病，很大程度上影響了魚、蝦、蟹、貝等海產(chǎn)品的健康養(yǎng)殖，而針對各種弧菌病的防治普遍采用了抗生素和化學(xué)消毒劑，但它們對海水造成了污染，也使各種弧菌逐漸產(chǎn)生了抗藥性。因此，尋找更安全、低污染的防治弧菌病的方法顯得尤為重要。

中草藥防治弧菌病的研究表明，五味子中的有機(jī)酸具有抑菌功能［16］。童國忠等［17］研究了中草藥對海水養(yǎng)殖的大黃魚病原哈氏弧菌的抑菌效果，結(jié)果表明五味子具有較好的抑菌效果。金珊等［18］通過15種中草藥對鱸魚體內(nèi)分離的哈維氏弧菌等研究發(fā)現(xiàn)五味子具有一定的抑菌作用。鄭天倫等［19］測定15 種中草藥對大黃魚病原菌——溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）的最小抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC），其中五味子的抑菌能力最強(qiáng)。本研究探索了五味子對副溶血弧菌的體外抑菌作用，結(jié)果表明五味子對溶藻弧菌有中等抑菌作用，其抑菌圈直徑為18.67（±0.2）mm，五味子對副溶血弧菌的MIC和MBC分別為1∶640和1∶320，這與童國忠等［15］“五味子對哈氏弧菌和副溶血弧菌的MIC和MBC均為1∶40”的結(jié)論存在一定差異。這可能是由于實(shí)驗(yàn)環(huán)境不同、中草藥取材來源不同等引起的。五味子除了抑菌作用還能抑制生物膜的形成。當(dāng)五味子藥物濃度小于3.125 mg/mL 時(shí)對副溶血弧菌生物膜成膜量無顯著抑制作用，當(dāng)藥液濃度達(dá)到3.125 mg/mL 以上時(shí)出現(xiàn)極顯著抑制作用。

張傳亮等［16］研究表明，富含多糖的黃精能通過調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)達(dá)到治療弧菌病的效果。王玉娥等［20］發(fā)現(xiàn)黃精對哈氏弧菌和副溶血弧菌具有明顯抑菌抗菌作用。趙明軍等［21］通過中草藥對水產(chǎn)動物疾病的防治效果研究中發(fā)現(xiàn)，黃精能在不同程度上緩解及治療弧菌引起的魚類疾病。本研究探索了黃精對副溶血弧菌的體外抑菌作用，結(jié)果表明黃精對副溶血弧菌的抑菌圈直徑為11.26（±0.6）mm，MIC和MBC分別為1∶640和1∶320；當(dāng)藥物濃度達(dá)到3.125 mg/mL以上時(shí)，黃精對副溶血弧菌生物膜的形成有極顯著抑制作用。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，五味子和黃精對副溶血弧菌的游離菌及其生物膜形成具有抑制作用，對由致病性弧菌引起的水產(chǎn)動物疾病防治具有參考意義。但本研究只是在細(xì)菌相對穩(wěn)定的生長環(huán)境中進(jìn)行試驗(yàn)，沒有考慮到環(huán)境和用藥方式等對藥效的影響，具有一定的局限性。此外，中草藥制劑在海水動物細(xì)菌性疾病中的開發(fā)應(yīng)用還處于摸索階段，實(shí)際應(yīng)用中仍存在一定問題，如由于季節(jié)、產(chǎn)地及炮制方法等不同造成同一種中草藥的有效成分含量差異較大進(jìn)而導(dǎo)致藥材質(zhì)量的不穩(wěn)定［22］。今后，我們既要揭示漁用中草藥的主要成分和功效，又要廣泛開展養(yǎng)殖環(huán)境和用藥方法上的綜合研究，真正發(fā)揮中草藥在海水養(yǎng)殖動物細(xì)菌性疾病防治中的重要作用。

［1］Tra V T，Meng L，Pichpol D，et al. Prevalence and antimicrobial resistance of Vibrio spp. in retail shrimps in Vietnam［J］. Berl Munch Tierarztl Wochenschr，2016，129（1-2）：48-51.

［2］Xu X，Cheng J，Wu Q，et al. Prevalence，characterization，and antibiotic susceptibility of Vibrio parahaemolyticus isolated from retail aquatic products in North China［J］. BMC Microbiol，2016，9：16-32.

［3］Froelich B A，Noble R T. Vibrio bacteria in raw oysters：managing risks to humanhealth［J］. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci，2016，371：1689.

［4］李京寶，韓峰，于文功. 細(xì)菌生物膜研究技術(shù)［J］. 微生物學(xué)報(bào)，2007，47（3）：558-561.

［5］Stoodley P，Sauer K，Davies D G，et al. Biofilms as complex differentiated communities［J］. Annu Rev Microbiol，2002，56：187-209

［6］國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典·一部［S］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：61.

［7］賀鳳成，李守信，趙志全，等. 一測多評法測定五味子中4種木脂素類成分的含量［J］. 藥學(xué)學(xué)報(bào)，2012，27（7）：930-933.

［8］劉麗，趙春蘇，馬永全，等. 五味子抗氧化和抑菌作用的研究進(jìn)展［J］. 仲愷農(nóng)業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報(bào)，2011，24（3）：63-66.

［9］傅圣斌，錢建鴻，陳樂意，等. 黃精多糖的提取及其對小鼠免疫活性的影響［J］. 中國食品學(xué)報(bào)，2013，13（1）：68-72.

［10］董治程，謝昭明，黃丹，等. 黃精資源、化學(xué)成分及藥理作用研究概況［J］. 中南藥學(xué)，2012，10（6）：450-453.

［11］吳穎瑞，龔慶芳，方宏，等. 153種中草藥對羅非魚無乳鏈球菌和海豚鏈球菌的抑制活性研究［J］. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2013，41（1）：25-32.

［12］陳輝，張其中. 100種中草藥對溶藻弧菌的體外抑菌實(shí)驗(yàn)［J］. 中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2012，34（6）：452-455.

［13］黎家勤，龐歡瑛，簡紀(jì)常，等. 大黃和公丁香對致病性哈氏弧菌及其生物膜的體外抑制作用［J］. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（24）：8188-8190，8202.

［14］馮銳基，龐歡瑛，黃郁蔥，等. 五倍子和石榴皮對溶藻弧菌及其生物膜的體外抑制作用［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，44（11）1：1-3，11.

［15］賈紅玲. 新生隱球菌生物膜外分泌蛋白初步分析的研究［D］. 上海：第二軍醫(yī)大學(xué)，2012.

［16］張傳亮，李槿年，李小飛. 擬態(tài)弧菌的致病性、耐藥性及中草藥防治弧菌病應(yīng)用［J］. 水利漁業(yè)，2007，27（1）：96-98.

［17］童國忠，石亞素，馬劍茵，等. 中草藥對海水養(yǎng)殖黃魚病原弧菌抑菌效果研究［J］. 水產(chǎn)科學(xué)，2007，26（8）：436-439.

［18］金珊，王國良，趙青松，等. 控制海水網(wǎng)箱養(yǎng)殖鱸魚皮膚潰瘍病的藥物研究［J］. 浙江海洋學(xué)院學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），1999，18（4）：301-304.

［19］鄭天倫，王國良，金珊. 網(wǎng)箱養(yǎng)殖大黃魚弧菌病的中草藥防治［J］. 水產(chǎn)科學(xué)，2005，24（2）：24-25.

［20］王玉娥，邢晨光，王國良. 5種海洋致病弧菌對34種中草藥敏感性的測定［J］. 水產(chǎn)科學(xué)，2008，27（5）：221-225.

［21］趙明軍，張洪玉，周狀. 中草藥對水產(chǎn)動物疾病防治的藥效學(xué)研究綜述［J］. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（36）：18010-18015，18036.

［22］汪長友. 中草藥在魚病防治中的應(yīng)用［J］. 漁業(yè)致富指南，2003，16（2）：91-93.

（責(zé)任編輯 楊賢智）

Inhibitory activity of Shisandra chinensis and Polygonatum sibiricum on Vibrio parahaemolyticus and its biomembrane

PANG Huan-ying ，HUANG Zhi-feng，HUANG Yang，HUANG Yu-cong，LU Yi-shan，JIAN Ji-chang
（Fisheries College of Guangdong Ocean University/Guangdong Provincial Key Laboratory of Pathogenic Biology and Epidemiology for Aquatic Economic Animals/Key Laboratory of Diseases Controlling for Aquatic Economic Animals，Guangdong Higher Education Institutions，Zhanjiang 524088，China）

The inhibitory effects of Shisandra chinensis and Polygonatum sibiricum on Vibrio parahaemolyticus were tested by disc agar diffusion，and the minimal inhibitory concentration（MIC） and minimal bactericidal concentration（MBC） were detected by double dilution；the effects of S. chinensis and P. sibiricum on V. parahaemolyticus biomembrane were measured by MTT assay. The two species of Chinese herbal medicine had different degree of inhibition. S. chinensis had inhibitory effects with the diameter of inhibition zone（DIZ） of 18.67（±0.2） mm，and the MIC and MBC respectively were 1.56，3.125 mg/mL；P. sibiricum had inhibitory effects with the diameter of inhibition zone（DIZ） of 11.26（±0.6） mm，and the MIC and MBC respectively were 1.56，3.125 mg/mL. Both S. chinensis and P. sibiricum exhibited a potent inhibitory activity against V. parahaemolyticus biomembrane formation，when the concentration of medicine was over 3.125 mg/mL.

Shisandra chinensis；Polygonatum sibiricum；Vibrio parahaemolyticus；in vitro inhibitory activity；biomembrane

S948

A

1004-874X（2016）09-0119-05

2016-06-11

廣東海洋大學(xué)創(chuàng)新強(qiáng)校項(xiàng)目（GDOU2015050216）；廣東省教育廳基礎(chǔ)研究重大培育項(xiàng)目（2014GKXM046）；廣東高校國際合作創(chuàng)新平臺項(xiàng)目（2013gjhz0008）

龐歡瑛（1980-），女，博士，副教授，E-mail：phying1218 @163.com

簡紀(jì)常（1964-），男，博士，教授，E-mail：jianjc@gmail.com