香蕉BBI型蛋白酶抑制劑（MaBBI1）的誘導(dǎo)、變性和復(fù)性

黃司法，唐志敏，楊禮香

（廣州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州　510006）

香蕉BBI型蛋白酶抑制劑（MaBBI1）的誘導(dǎo)、變性和復(fù)性

黃司法，唐志敏，楊禮香

（廣州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州510006）

BBI（Bowman-Birk protease inhibitor）是一種富含半胱氨酸的植物蛋白酶抑制劑，其抑制的蛋白酶主要包括胰蛋白酶、糜蛋白酶和彈性蛋白酶等絲氨酸蛋白酶。以從香蕉（Musa acuminata L. cv.Brazilian）根中提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄成的cDNA為模板，根據(jù)NCBI公布的野生型馬來西亞蕉（Musa acuminata subsp. Malaccensis）BBI基因（收錄號(hào)：XM_009415512）的序列設(shè)計(jì)引物，克隆了1個(gè)BBI型蛋白酶抑制劑基因（MaBBI1）。MaBBI1基因大小為381 bp，編碼126個(gè)氨基酸，包括12個(gè)半胱氨酸（9.5%），將該基因構(gòu)建到載體pGEX-6P-1上轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rossetta菌株進(jìn)行重組蛋白GST-MaBBI1的誘導(dǎo)表達(dá)。在IPTG誘導(dǎo)3 h后，一個(gè)預(yù)測分子量為40.8953 ku的GST-MaBBI1融合蛋白被大量表達(dá)。IPTG誘導(dǎo)后的GST-MaBBI1融合蛋白是不溶的并累積成包涵體，通過對(duì)包涵體進(jìn)行變性和復(fù)性的方法得到可溶的GST-MaBBI1融合蛋白，為進(jìn)一步在體外研究該蛋白的功能奠定基礎(chǔ)。

香蕉；Bowman-Birk蛋白酶抑制劑（BBI）；誘導(dǎo)；變性；復(fù)性

黃司法，唐志敏，楊禮香. 香蕉BBI型蛋白酶抑制劑（MaBBI1）的誘導(dǎo)、變性和復(fù)性［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，43（9）：44-50.

蛋白酶抑制劑廣泛存在于動(dòng)植物中，可抑制不同來源的蛋白水解酶。植物含有大量的蛋白酶抑制劑，生殖器官、儲(chǔ)藏器官和營養(yǎng)器官均可表達(dá)此類蛋白。植物在正常生長發(fā)育、遭遇草食性動(dòng)物侵食、病原菌和害蟲侵害時(shí)均可產(chǎn)生蛋白酶抑制劑以抵御病蟲害［1-2］。目前，59個(gè)不同的蛋白酶抑制劑家族已經(jīng)被歸類［3］，其中富含半胱氨酸的蛋白酶抑制劑被歸納為BBI（Bowman-Birk protease inhibitor）家族［4］。BBI最早由Bowman在大豆中發(fā)現(xiàn)，并由Birk純化［5-6］，其抑制的蛋白酶主要包括胰蛋白酶、糜蛋白酶和彈性蛋白酶等絲氨酸蛋白酶［7］。大量研究表明，BBI型蛋白酶抑制劑具有多種生理功能，包括調(diào)節(jié)內(nèi)源蛋白酶活性、存儲(chǔ)含硫氨基酸、防止病原微生物入侵和抵抗蟲害［8-9］。體外實(shí)驗(yàn)表明，BBI可以抑制昆蟲腸道消化酶的活性［10］，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，昆蟲食用含BBI的食物后表現(xiàn)出營養(yǎng)不良［11］。此外，BBI抗炎、免疫激活和抗癌的功能也陸續(xù)被報(bào)道［12-14］，這表明BBI在防衛(wèi)反應(yīng)中起重要作用。

香蕉是三倍體，難以通過常規(guī)育種方法得到品種改良。因此，充分挖掘香蕉自身的抗性基因尤為重要。本研究從香蕉（Musa acuminata L.cv.Brazilian）中克隆了1個(gè)BBI型蛋白酶抑制劑基因（MaBBI1），構(gòu)建了GST融合蛋白表達(dá)載體pGEX-6P-1-MaBBI1，并成功誘導(dǎo)出GSTMaBBI1融合蛋白。誘導(dǎo)后的GST-MaBBI1融合蛋白累積成包涵體，通過對(duì)包涵體進(jìn)行變性和復(fù)性的方法得到了可溶的GST-MaBBI1蛋白，為進(jìn)一步在體外研究其生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

香蕉苗（Musa acuminata L.cv.Brazilian）由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供，大腸桿菌菌株DH5α、Rossetta，蛋白表達(dá)載體pGEX-6P-1均由中國科學(xué)院華南植物園提供。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1目的基因MaBBI1的克隆 用苗齡2周的香蕉出根苗為試驗(yàn)材料，取5 g根用于提取總RNA，總RNA的提取依照Magen公司HiPure Plant RNA Kits（R4151）的說明書進(jìn)行。以總RNA為模板采用兩步法逆轉(zhuǎn)錄cDNA，cDNA鏈的合成依照全式金公司TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix 的說明書進(jìn)行。根據(jù)NCBI（http：//www.ncbi.nlm. nih.gov/）公布的野生型馬來西亞蕉（Musa acuminata subsp. Malaccensis）BBI基因（收錄號(hào)：XM_009415512） 的序列，通過網(wǎng)站Convert PCR Primers Into In-Fusion? Primers（http：// bioinfo.clontech.com/infusion/convertPcrPrimersInit. do）在線設(shè)計(jì)引物，MaBBI1-PEF：5′-GGGGC CCCTGGGATCCATGAGGTACAACATGGTG-3′和 MaBBI1-PER：5′-GGAATTCCGGGGATCCCT ACTGGGCGAGGAGCGG-3′。以cDNA為模版，采用高保真Taq酶PCR擴(kuò)增MaBBI1基因全長。目的片段的回收依照Magen公司HiPure Gel Pure DNA Kits說明書進(jìn)行?；蛩磉_(dá)蛋白的分子量通過網(wǎng)站ProtParam（http：//web.expasy. org/protparam/）進(jìn)行預(yù)測。

1.2.2蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建 將蛋白表達(dá)載體pGEX-6P-1用BamHⅠ進(jìn)行酶切，酶切后的載體的回收依照Magen公司HiPure Gel Pure DNA Kits說明書進(jìn)行。通過In-Fusion的方法將目的基因與載體連接，依照TaKaRa公司In-FusionTMAdvantage PCR Cloning Kit的說明書進(jìn)行。將連接產(chǎn)物加入100 μL 大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，在冰上放置30 min；42℃熱擊60 s后于冰中放置1 min；再加入800 μL LB液體培養(yǎng)基，于37℃恒溫?fù)u床（200 r/min）培養(yǎng)60 min。將上述菌液在LB 固體培養(yǎng)基（含100 μg/mL Amp）上涂板；待平板干燥后置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)過夜形成單菌落；用引物MaBBI1-PEF 和MaBBI1-PER進(jìn)行PCR鑒定陽性菌落。將篩選出來的陽性單菌落接種到LB液體培養(yǎng)基（含100 μg/mL Amp）中，于37℃恒溫?fù)u床（200 r/min）培養(yǎng)過夜；依照Magen公司HiPure Plasmid Micro Kit說明書提取重組質(zhì)粒pGEX-6P-1-MaBBI1。重組質(zhì)粒用BamHⅠ進(jìn)行酶切鑒定，并送往Invitrogen公司測序。

1.2.3重組質(zhì)粒pGEX-6P-1-MaBBI1轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rossetta 分別將測序正確的重組質(zhì)粒pGEX-6P-1-MaBBI1和空載體pGEX-6P-1轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rossetta感受態(tài)細(xì)胞，方法如2.2.2所述。將上述菌液在LB 固體培養(yǎng)基（含100 μg/mL Amp、50 μg/mL Kan和34 μg/mL Chl）上涂板；待平板干燥后置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)過夜形成單菌落。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌株用引物MaBBI1-PEF 和 MaBBI1-PER進(jìn)行PCR鑒定陽性菌落。

1.2.4GST-MaBBI1重組蛋白的誘導(dǎo) 分別挑取攜帶有重組表達(dá)載體和空載體（對(duì)照）的大腸桿菌Rossetta單菌落至5 mL 2×YT液體培養(yǎng)基（含100 μg/mL Amp、50 μg/mL Kan和34 μg/mL Chl）中；于37℃恒溫?fù)u床（200 r/min）培養(yǎng)過夜達(dá)到飽和。將上述培養(yǎng)液按1：100的比例轉(zhuǎn)接到100 mL 新鮮的2×YT 液體培養(yǎng)基（含100 μg/mL Amp、50 μg/mL Kan和34 μg/mL Chl）中，于37℃恒溫?fù)u床（200 r/min）繼續(xù)培養(yǎng)；待OD600至0.4～0.6時(shí)（約3 h），加入終濃度為0.2 mmol/L的IPTG，于37℃恒溫?fù)u床（200 r/min）繼續(xù)培養(yǎng)3 h，將菌液于4℃、8000 r/min下離心8 min收集菌體。用4 mL預(yù)冷的1 ×PBS緩沖液（pH8.0）懸浮菌體，于冰上將重懸的菌體進(jìn)行超聲破碎（Φ3探頭，20%功率，超聲9 s，停止9 s，共30 min），離心（4℃、10 000 r/min，30 min）收集上清和沉淀。分別取上清和沉淀（包涵體）進(jìn)行12% SDS-PAGE電泳檢測，電泳后的膠用考馬斯亮藍(lán)R-250染色液進(jìn)行染色，再用脫色液（5%乙醇，10%醋酸，85% dH2O）進(jìn)行脫色以顯示蛋白條帶。

1.2.5包涵體（重組蛋白GST-MaBBI1）的變性與復(fù)性 將沉淀（包涵體）用2 mL洗滌緩沖液（10 mmol/L Tris-HCl pH7.8，300 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，1% TritonX-100，1 mol/L urea）懸浮，離心（4℃、8 000 r/min，8 min）收集沉淀；再加入2 mL溶解緩沖液（50 mmol/L Tirs-HCl pH7.8，5 mmol/L MgCl2，2.5 mmol/L β-mercaptoethanol，0.1% Tween20，8 mol/L urea）對(duì)沉淀進(jìn)行重懸，將上述混合樣品進(jìn)行超聲破碎（Φ3探頭，20%功率，超聲9 s，停止9 s，共30 min），離心（4℃、10 000 r/min，30 min）取上清；再往上清中逐滴加入復(fù)性緩沖液（0.4 mol/L L-Arginine，2 mmol/L DTT，0.5 mol/L NaCl，50 mmol/L Tris-HCl pH8.0）至urea終濃度為1 mol/L。把復(fù)性液轉(zhuǎn)入透析袋中并用預(yù)冷的1×PBS緩沖液（pH8.0）透析6 h，期間每隔1 h換1次1×PBS緩沖液（pH8.0）；用PGE20000將上述復(fù)性液濃縮至2 mL。取復(fù)性液進(jìn)行12% SDS-PAGE電泳檢測，電泳后的膠采用1.2.4所述方法進(jìn)行染色和脫色以顯示蛋白條帶。

2　結(jié)果與分析

2.1MaBBI1基因的克隆

電泳顯示MaBBI1大小位于300～500 bp之間（圖1），測序結(jié)果表明其與NCBI公布的野生型馬來西亞蕉BBI基因的序列相同，大小為381 bp，編碼126個(gè)氨基酸，包括12個(gè)半胱氨酸（9.5%），預(yù)測MaBBI1基因所表達(dá)蛋白的分子量為14.0711 ku。

圖1　克隆的MaBBI1基因電泳結(jié)果

2.2GST-MaBBI1重組蛋白在大腸桿菌Rossetta中的超量表達(dá)

將MaBBI1構(gòu)建到pGEX-6P-1載體上轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rossetta進(jìn)行GST-MaBBI1重組蛋白的誘導(dǎo)超量表達(dá)。在IPTG的誘導(dǎo)下大腸桿菌Rossetta表達(dá)1個(gè)預(yù)測分子量為40.8953 ku的GST-MaBBI1融合蛋白。12% SDS-PAGE電泳顯示，誘導(dǎo)3 h后大量的重組蛋白GST-MaBBI1被表達(dá)（圖2），累積蛋白條帶位于34～43 ku之間，與預(yù)期相符。而轉(zhuǎn)空載的對(duì)照則大量表達(dá)GST（圖3），累積蛋白帶大小約為26 ku。雖然誘導(dǎo)3 h后GST-MaBBI1融合蛋白的累積量較大，但以包涵體的形式存在于菌體沉淀中（圖4）。

圖2　GST-MaBBI1重組蛋白的誘導(dǎo)

圖3　GST蛋白的誘導(dǎo)

圖4　GST-MaBBI1重組蛋白在IPTG誘導(dǎo)后累積成包涵體

2.3可溶的重組蛋白GST-MaBBI1

GST-MaBBI1包涵體在變性和復(fù)性后的12% SDS-PAGE電泳分析如圖5所示。復(fù)性后的可溶蛋白條帶位于34～43 ku 之間，符合GST-MaBBI1（40.8953 ku）的大小，成功獲得可溶的重組蛋白GST-MaBBI1。

圖5　包涵體變性和復(fù)性后可溶的GST-MaBBI1重組蛋白

3　結(jié)論與討論

BBI是植物進(jìn)化過程中獲得的防御機(jī)制［15］，廣泛參與植物抗病蟲害和抗逆的防衛(wèi)反應(yīng)。在抗病方面，大豆BBI參與免疫調(diào)節(jié)和抗炎反應(yīng)［16］，能通過抑制病原菌蛋白酶的活性，使病原菌不能水解寄主細(xì)胞的蛋白而無法獲取充足營養(yǎng)，繼而導(dǎo)致病原菌生長繁殖受限，浸染與擴(kuò)展受阻，從而達(dá)到抗病目的［17］。在水稻中過量表達(dá)BBTI4可以增強(qiáng)水稻對(duì)白葉枯病的抗性［18］。在抗蟲方面，抑制劑干預(yù)害蟲的消化是植物天然的防御機(jī)制［19］，這種防御機(jī)制表現(xiàn)為一種或多種防御蛋白如蛋白酶抑制劑、α淀粉酶抑制劑和凝集素的積累［20］。BBI能抑制的蛋白酶包括胰蛋白酶、糜蛋白酶及彈性蛋白酶等絲氨酸蛋白酶［7］，而自然界多數(shù)昆蟲的蛋白消化酶正是絲氨酸類蛋白消化酶［21］。作為蛋白酶抑制劑，BBI能抑制昆蟲腸道中與消化相關(guān)的蛋白酶活性，使昆蟲不能消化所食的蛋白質(zhì)，繼而導(dǎo)致昆蟲缺乏營養(yǎng)及生長發(fā)育不良而死亡，從而起到抗蟲的作用［22］。赤豆（Vigna umbellata）BBI在體外可以強(qiáng)烈抑制黑森癭蚊（Mayetioa destructor）腸道胰蛋白酶和糜蛋白酶的活性［10］，冥蛾（kuehniella）幼蟲食用含有巴西木碟豆（Clitoria fairchildiana）BBI的食物后表現(xiàn)出營養(yǎng)不良［11］。在抗逆方面，水稻BBI家族可以通過形成二硫鍵來螯合重金屬以減少游離的重金屬對(duì)細(xì)胞的傷害［23］?；ㄉˋrachis hypogaea L.）AhBBI參與干旱脅迫的耐受性［24］，小麥BBI型蛋白酶抑制劑基因在煙草中超量表達(dá)可提高后代株系的耐鹽性［25］。由此可見BBI在植物抗病蟲害和抗逆基因工程育種中具有廣闊的應(yīng)用前景。

香蕉是許多熱帶和亞熱帶國家和地區(qū)的重要糧食作物，也作為我國南方的主要經(jīng)濟(jì)作物之一出口各國。香蕉枯萎病是制約香蕉產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素，是由古巴尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum f. sp. cubense）引起的一種由土壤傳播的病害。近年來枯萎病迅速蔓延，幾乎所有種植香蕉的國家和地區(qū)都遭受香蕉枯萎病的侵害，枯萎病對(duì)香蕉產(chǎn)業(yè)的發(fā)展構(gòu)成了巨大的威脅［26］。目前尚未找到一種有效的化學(xué)防治方法應(yīng)對(duì)香蕉枯萎病問題，而生物防治和抗病育種的方法越來越受到人們的重視。

香蕉為三倍體，難以通過常規(guī)雜交的方法獲得改良品種，急需大力挖掘香蕉自身的抗病基因資源，研究其抗病機(jī)理。通過微觀層面操縱抗病基因的表達(dá)，將從根本上解決香蕉病害的問題，對(duì)香蕉品種的改良具有重要意義。目前還沒有關(guān)于香蕉BBI基因功能研究的報(bào)道，本研究從香蕉中克隆了1個(gè)MaBBI1基因，大小為381 bp，編碼126個(gè)氨基酸，包括12個(gè)半胱氨酸（9.5%），預(yù)測MaBBI1基因所表達(dá)蛋白的分子量為14.0711 ku。植物蛋白酶抑制劑是一類分子量為8～20 ku的小分子蛋白，廣泛分布于單子葉植物和雙子葉植物中［27］，富含半胱氨酸是BBI型蛋白酶抑制劑的特征［4］。MaBBI1具有BBI型蛋白酶抑制劑的一般特征。將MaBBI1構(gòu)建到pGEX-6P-1載體上轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rossetta進(jìn)行GST-MaBBI1重組蛋白的誘導(dǎo)超量表達(dá)。在IPTG誘導(dǎo)3 h后一個(gè)預(yù)測分子量為40.8953 ku的GST-MaBBI1融合蛋白在大腸桿菌Rossetta中大量表達(dá)。雖然大多數(shù)帶GST標(biāo)簽的重組蛋白是可溶的，但GSTMaBBI1在IPTG誘導(dǎo)后累積成包涵體。Li等［28］在誘導(dǎo)GST-RBBI8時(shí)遇到相同的問題，原因可能是RBBI8富含的半胱氨酸影響了重組蛋白的折疊。MaBBI1與RBBI8相似，富含的半胱氨酸同樣可能影響重組蛋白的正常折疊，從而使得GST-MaBBI1的二硫鍵無法正確配對(duì)而形成包涵體。通過對(duì)包涵體進(jìn)行變性和復(fù)性的方法成功獲得可溶的GST-MaBBI1蛋白，為進(jìn)一步在體外探究該蛋白的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯 崔建勛）

Induction，denaturation and renaturation of Musa acuminata Bowman-Birk type protease inhibitor （MaBBI1）

HUANG Si-fa，TANG Zhi-min，YANG Li-xiang
（School of Life Sciences，Guangzhou University，Guangzhou 510006，China）

BBI （Bowman-Birk protease inhibitor） is a kind of plant-derived protease inhibitor and rich in cysteine，it can inhibit serine proteases，including trypsase，chymase，elastase and so on. A Bowman-Birk type protease inhibitor gene （MaBBI1） was cloned with the cDNA templates isolated and reversely transcribed from total RNA of banana （Musa acuminata L. cv.Brazilian） roots and the primers were designed according to the sequence of wild Malaysian banana （Musa acuminata subsp. Malaccensis） BBI gene （GenBank: XM_009415512）published in NCBI. The full length of MaBBI1 gene with 381 bp encoding 126 amino acids including 12 cysteines（9.5%） was inserted into vector pGEX-6P-1 and transformed Escherichia coli Rossetta to induce the expression of recombinant proteins GST-MaBBI1. A lot of GST-MaBBI1 fusion proteins with predicted molecular mass of 40.8953 ku were induced by IPTG at 3 h. However，the GST-MaBBI1 fusion proteins were insoluble after IPTG induction and accumulating as inclusion bodies. To get the soluble GST-MaBBI1 fusion proteins，the inclusion bodies were denatured and renatured. The soluble fusion proteins GST-MaBBI1 laid the foundation for its further study in vitro.

Musa acuminata；Bowman-Birk protease inhibitor（BBI）；induction；denaturation；renaturation

S336；Q786

A

1004-874X（2016）09-0044-07

2016-06-30

黃司法（1991-），男，在讀碩士生，E-mail：415339522@qq.com

楊禮香（1972-），女，博士，副教授，E-mail：365084473@qq.com