發(fā)芽及提取條件對大麥麥芽根中核酸酶活性的影響

劉馨予，楊洋，朱思齊，秦陽，李新，張洪微，高玉榮，崔素萍

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，大慶　163319）

發(fā)芽及提取條件對大麥麥芽根中核酸酶活性的影響

劉馨予，楊洋，朱思齊，秦陽，李新，張洪微，高玉榮，崔素萍

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，大慶163319）

為了從大麥芽根中制備高活性的核酸酶，以麥芽根及成品麥芽根中核酸酶活性為指標(biāo)，確定了內(nèi)蒙墾大麥和澳洲大麥的最佳發(fā)芽條件。在此基礎(chǔ)上，研究了麥芽根中核酸酶的提取條件對核酸酶活性的影響。結(jié)果表明：最佳發(fā)芽條件是25℃，發(fā)芽64 h時，內(nèi)蒙墾和澳洲麥芽根中核酸梅的活性最高分別為316.7 U·mL-1，364.5 U·mL-1。麥芽根長度為大麥種子1～1.5倍時，澳洲和內(nèi)蒙墾大麥酶活性最高分別為353.8 U·mL-1，321.0 U·mL-1。60目的麥芽根粉，在浸提溫度50℃，pH 5.1，料液比為1∶12，成品麥芽根酶活性最高為543.6 U·mL-1。研究為麥芽根中核酸酶的進(jìn)一步應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。

大麥；發(fā)芽；麥芽根；核酸酶；酶活力

5′-磷酸二酯酶（Exonuclease）是一種能將單鏈DNA和RNA水解為5′-核苷酸的核酸水解酶。該酶可以通過動物、植物微生物發(fā)酵獲得。不同來源的5′-磷酸二酯酶，可能具有不同的分子結(jié)構(gòu)及催化性能［1，2］。目前，核酸酶可用作食品添加劑、生化藥物、在農(nóng)業(yè)上可作為植物生長劑［3］，在飼料上用做安全高效的添加劑［4］。朱政斌［5］從麥芽根中分離得到了5′-磷酸二酯酶，采用戊二醛為交聯(lián)劑，將該酶固定到殼聚糖上，用于酵母RNA的催化水解，以制備5′-核苷酸。研究了酶固定化反應(yīng)的影響因素，在最適條件下，酶活回收率可達(dá)53.6%。喻晨［6］通過部分析因試驗(yàn)設(shè)計(jì)（FFD）、中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（CCD）和響應(yīng)面分析法（RSM）對桔青霉產(chǎn)核酸酶P1培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化研究，優(yōu)化后的培養(yǎng)基發(fā)酵酶活力達(dá)到563 U·mL-1，比原培養(yǎng)基（202 U·mL-1）提高了64%。但發(fā)酵制備磷酸二酯酶的生產(chǎn)過程復(fù)雜，且成本較高。如能利用大麥麥芽根中的磷酸二酯酶，可以提高麥芽根的利用率［7］，同時減少桔青酶發(fā)酵廢液的排放，對環(huán)境保護(hù)和降低成本都具有重要的意義。李祥［8］通過正交試驗(yàn)確定了從麥芽根中提取5′-磷酸二酯酶的最佳工藝條件，5′-磷酸二酯酶活力達(dá)到了160 U·mL-1。Beluhan等［9］從麥芽根中提取了一種堿性5′-磷酸二酯酶，提純后的5′-磷酸二酯酶的酶活達(dá)到了30 U·mL-1。

低嘌呤食品的研制為痛風(fēng)病人攝入均衡的營養(yǎng)具有一定的意義［10］。麥芽根是麥芽生產(chǎn)啤酒過程中生成的主要副產(chǎn)物，含有豐富的磷酸二酯酶，如果能夠?qū)Ⅺ溠扛鬯楹筇砑拥胶懈哙堰实氖称分校苯永名溠扛械暮怂崦杆馐称分械暮怂?，將核酸降解為嘌呤堿和嘧啶堿［11］，然后利用吸附劑吸附核酸堿基，從而降低食品中嘌呤含量，對于研制適合于痛風(fēng)患者食用的高蛋白低嘌呤食品，具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

內(nèi)蒙墾大麥、澳洲大麥及成品麥芽根，均由北大荒農(nóng)墾麥業(yè)提供。

核糖核酸，Sigma公司產(chǎn)品，為生化試劑；鉬酸銨、高氯酸、醋酸鈉、醋酸、硫酸鋅、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀均為分析純級試劑。

DK-S24電熱恒溫水浴鍋，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；SPECORD 210 PLUS紫外可見分光光度計(jì)，德國耶拿分析儀器股份公司；TD5A-WS臺式低速離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；FW-80萬能粉碎，北京市永光明醫(yī)療儀器廠；Seven Multi（S40）pH計(jì)，瑞士METTLER TOLEDO；DR9082型電熱恒溫恒濕培養(yǎng)箱，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；CP313電子天平，奧豪斯儀器有限公司。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1大麥的發(fā)芽處理

大麥的發(fā)芽方法按QB/T3691-1999（箱式大麥發(fā)芽系統(tǒng)）方法進(jìn)行，具體做法如下：

分別挑選金黃色的、顆粒飽滿、大小均勻、無蟲蛀的優(yōu)質(zhì)大麥，用清水洗5遍，去除雜質(zhì)。取100 g大麥，放入500 mL燒杯中加水浸泡，水面高于麥粒10～ 15 cm，水溫15～30℃，浸泡1 h；然后將水溫升到26～35℃，繼續(xù)浸泡30 min，瀝出水分，時隔6 h后將麥芽再次浸入約30℃水中，浸泡30 min，反復(fù)2次，麥粒增重大約40%～50%。將浸水后的大麥放入鋪有濕紗布的托盤中，放入恒溫恒濕培養(yǎng)箱時為發(fā)芽0 h，溫度設(shè)為15～30℃，然后每隔4 h淋水1次，每隔8～12 h翻1次。將發(fā)芽好的麥芽根剪下放入托盤中，可以自然風(fēng)干；若人工風(fēng)干可將其放在烘干箱中：初期為35～40℃、5 h，再逐漸升高溫度≤50℃、7 h，即可得到麥芽根。

1.2.2麥芽根中核酸酶活性的研究

1.2.2.1發(fā)芽溫度與發(fā)芽時間對核酸酶活性的影響

大麥發(fā)芽溫度分別設(shè)為15、20、25、30℃，從發(fā)芽40 h開始（在發(fā)芽40 h之前大麥先長苗，隨之長根，根部生長不完全，故在40 h之后開始測核酸酶活性。）每隔6 h檢測1次麥芽根中核酸酶活性。

1.2.2.2麥芽根長度與核酸酶活性的關(guān)系

從發(fā)芽40 h開始，分別取麥芽根長度為種子長度的1至1.5倍、1.5至2倍及2至2.5倍的發(fā)芽大麥，測定麥芽根核酸酶活性。

1.2.2.3核酸酶活力測定方法

采用Prentice［12］方法測定核酸酶活力。用0.1 mol·L-1pH 5.0醋酸鹽緩沖液溶解底物RNA，使底物質(zhì)量濃度為1%。取1 mL底物溶液放置于30℃水浴中保溫，待溫度達(dá)到平衡后，加入已恒溫（30℃）的酶液1 mL，立刻混勻后計(jì)時，反應(yīng)10 min后取出試管，置于冰浴中震蕩，然后在反應(yīng)體系中加入1 mL沉淀劑（0.25%鉬氨酸溶于25%高氯酸溶液中），并在冰浴中保持15 min后過濾，取濾液稀釋至合適倍數(shù)后于260 nm比色，空白試驗(yàn)先加沉淀劑。

酶活計(jì)算公式：

其中α-原酶液的稀釋倍數(shù)，β-離心清液的稀釋倍數(shù)，ΔA260-測定的吸光值。

1.2.3麥芽根中核酸酶提取研究

1.2.3.1麥芽根粉粒度與核酸酶活性的關(guān)系

將發(fā)芽溫度為25℃，發(fā)芽時間為64 h的兩種大麥發(fā)芽制備的麥芽根及成品麥芽根粉碎，分別過40、60、80、100目篩。將2.0 g不同目數(shù)的麥芽根粉分別放入三角瓶中，分別加入20 mL pH5.1醋酸緩沖液（含0.1 mol·L-1ZnSO4），放入50℃水浴鍋中恒溫2 h提取，過濾得澄清粗酶液，分別測定核酸酶活性。

1.2.3.2水浴溫度對核酸酶活性的影響

取細(xì)度為60目，25℃下發(fā)芽64 h的麥芽根粉及成品麥芽根粉，分別加入pH5.1的醋酸緩沖液（含0.1 mol·L-1ZnSO4）中，分別在20、30、40、50、60℃水浴30 min，然后對其分別進(jìn)行過濾，取得澄清酶液，分別測定核酸酶活性。

1.2.3.3料液比對核酸酶活性的影響

稱取60目、發(fā)芽時間為64 h、發(fā)芽溫度為25℃自制及成品麥芽根粉2 g，分別加入12、16、20、24、28 mL的pH 5.1醋酸緩沖液（含0.1 mol·L-1ZnSO4），水浴溫度50℃進(jìn)行酶液提取，過濾得澄清酶液，分別測定其核酸酶活性。

1.2.3.4正交試驗(yàn)

通過對麥芽根粉細(xì)度、提取溫度、料液比等單因素的研究，確定正交試驗(yàn)因素及水平。

1.2.4數(shù)據(jù)處理

每個處理做三次重復(fù)，利用SPSS12.0分析系統(tǒng)對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2　結(jié)果與分析

2.1麥芽根中核酸酶活性的研究

2.1.1發(fā)芽溫度和時間對麥芽根核酸酶活性的影響

內(nèi)蒙墾大麥和澳洲大麥麥芽根核酸酶活性與發(fā)芽溫度的關(guān)系見圖1及圖2。

圖1　不同發(fā)芽溫度和時間內(nèi)蒙墾大麥麥芽根核酸酶活力Fig.1Nuclease activity of Nei Meng ken barely malt root at different germination temperature and germination time

圖2　不同發(fā)芽溫度和時間澳洲大麥麥芽根核酸酶活力Fig.2Australia germinated barley malt roots nuclease activity at different temperature and germination time

由圖1、圖2可知，在不同發(fā)芽溫度和時間下，麥芽根中核酸酶活性均有不同。發(fā)芽時間為64 h時，不同發(fā)芽溫度的內(nèi)蒙墾麥芽根及澳洲麥芽根核酸酶活力均最高，且差異顯著（P＜0.01）。在發(fā)芽溫度為25℃，發(fā)芽時間為64 h時，內(nèi)蒙墾麥芽根及澳洲麥芽根核酸酶活力最高分別為316.7 U·mL-1和364.5 U·mL-1。原因可能是溫度過低不利于大麥發(fā)芽，故酶活性較低；而溫度過高，大麥呼吸作用加快，CO2在麥層中的濃度升高，抑制了麥芽生長；另外原因可能是過高溫度不利于核酸酶合成［13］。

2.1.2麥芽根長度與核酸酶活性的關(guān)系

麥芽根長度與核酸酶活性關(guān)系見表1。

表1　麥芽根長度與核酸酶活性的關(guān)系Table 1Correlations between malt root length and nuclease activity

由表1可以看出，麥芽根長度為大麥種子本身長度1～1.5倍，有嫩黃色的苗長出時，核酸酶活性最強(qiáng)。其中澳洲大麥麥芽根酶活最高可達(dá)353.8 U·mL-1，內(nèi)蒙墾大麥麥芽根酶活最高可達(dá)321.0 U·mL-1。當(dāng)頂部長出綠色麥芽時，核酸酶活性開始有明顯降低，并在后期發(fā)芽生長過程中核酸酶活力較為恒定，沒有大幅度變化。

2.2麥芽根中核酸酶提取研究

2.2.1麥芽根粉細(xì)度與核酸酶活性的關(guān)系

麥芽根粉細(xì)度與核酸酶活性關(guān)系圖3。

圖3　麥芽根粉細(xì)度與核酸酶活性的關(guān)系Fig.3Correlations between size of malt root powder particle and nuclease activity

由圖3可以看出，三種麥芽根粉細(xì)度在60目時，麥芽根中核酸酶活性均最高，且差異顯著（p＜0.01）；不同細(xì)度成品麥芽根中核酸酶的活性都明顯（p＜0.01）高于其他兩種發(fā)芽麥芽根中核酸酶的活性，成品麥芽根粉為60目時，活性最高為513.3 U·mL-1。麥芽根粉細(xì)度過高或過低，核酸酶的活性降低，這可能是由于在粉碎的過程中，粉碎顆粒過小，破壞了麥芽根細(xì)胞的組織結(jié)構(gòu)，使酶充分暴露在空氣中，酶被氧化失活導(dǎo)致的；顆粒過大，核酸酶在提取液中并沒有得到充分溶出，有效的酶濃度降低。由此可見，麥芽粉細(xì)度并不是越高越有利于酶活性的提高［12］。

2.2.2提取溫度對核酸酶活性的影響

提取溫度對核酸酶活性影響見圖4。

由圖4可知，提取溫度對核酸酶活性影響較大，在20～50℃范圍內(nèi)，隨著溫度升高，提取液中酶活隨之升高。同一溫度條件下，成品麥芽根酶活力均最高。50℃時，提取液中核酸酶活性達(dá)到最大值，其中成品麥芽根活性可達(dá)438.2 U·mL-1。當(dāng)溫度低于或高于50℃時，核酸酶活性下降，這可能是核酸酶的最適反應(yīng)溫度是50℃左右，偏離酶促反應(yīng)最適溫度使得部分酶失去活性造成酶活降低［14］。

2.2.3料液比對核酸酶活性的影響

料液比對核酸酶活性影響見圖5。

圖4　提取溫度對核酸酶活性的影響Fig.4Effect of the extraction temperature on nuclease activity

圖5　料液比對核酸酶活性的影響Fig.5Effect of the ratio of material to liquid on nuclease activity

由圖5可以看出，料液比1∶12時，三種麥芽根核酸酶活性均明顯最高；與其他兩組比較，成品麥芽根酶活力最高為228.9 U·mL-1。這可能是由于過低料液比可能會導(dǎo)致麥芽根核酸酶溶出不完全。所以，料液比為1∶12最宜，這與郭建華［13］研究結(jié)果一致，成品中麥芽根核酸酶活性最高，為228.9 U·mL-1。

通過以上單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，成品麥芽根核酸酶活性比自制發(fā)芽麥芽根核酸酶活力高。因此，將成品麥芽根進(jìn)行三因素三水平正交試驗(yàn)，確定最佳試驗(yàn)條件。其中，考慮到核酸酶提取時，過高的料液比，會導(dǎo)致酶的回收和廢液處理比較困難，正交試驗(yàn)中最高的料液比定為1∶12。正交設(shè)計(jì)及正交試驗(yàn)結(jié)果見表2與表3。

通過極差分析得出，影響核酸酶活性的因素主次順序是提取溫度＞細(xì)度＞料液比，由k值分析得出的組合為A2B2C3，即提取溫度50℃，麥芽根粉細(xì)度60目，料液比1∶12，核酸酶的活力為543.6 U·mL-1。

表2　正交試驗(yàn)因素與水平表Table 2Factors and levels of orthogonal experiment

表3　正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3Results of orthogonal experiment

3　討論

麥芽根中酶類非常豐富，應(yīng)用價(jià)值很高，特別是其中的磷酸二酯酶，因此，麥芽根常被用于提取5'-磷酸二酯酶［15-17］。因此，利用麥芽根中較高的核酸酶活性，可將麥芽根粉用到其他領(lǐng)域中，例如，將其添加到飼料中，促進(jìn)動物的生長發(fā)育；另外，將少量的麥芽根粉添加到含有高嘌呤的食物中，利用麥芽根中核酸酶對食物中嘌呤進(jìn)行水解，再用吸附劑吸附嘌呤，制備低嘌呤食物，可以提供給痛風(fēng)人群食用，這樣既可以提高啤酒發(fā)芽大麥副產(chǎn)物麥芽根的利用率，而且還增加了經(jīng)濟(jì)效益［18］。

4　結(jié)論

以內(nèi)蒙墾大麥、澳洲大麥及成品麥芽根為材料，研究了發(fā)芽條件，發(fā)芽長度、麥芽根粉細(xì)度、提取溫度、料液比核酸酶活力關(guān)系。通過單因素實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，麥芽根中含有較高活性的核酸酶，成品麥芽根中核酸酶活力最高。正交試驗(yàn)的結(jié)果表明成品麥芽根粉碎后過60目的篩子，在提取溫度為50℃，料液比為1∶12，成品麥芽根活力最高為543.6 U·mL-1。

在后續(xù)研究工作中，將把粉碎為60目的成品麥芽根粉，按一定比例添加到脫脂豆粕粉中，利用麥芽根粉中核酸水解酶水解脫脂豆粕粉中的核酸，然后用吸附劑吸附并去除核酸水解后產(chǎn)生的嘌呤堿基，制備低嘌呤脫脂大豆粉。

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Effect of Gemination and Extraction Conditions on the Nuclease Activity of Barely Malt Root

Liu Xinyu，Yang Yang，Zhu Siqi，Qin Yang，Li Xin，Zhang Hongwei，Gao Yurong，Cui Suping
（College of Food Science，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319）

The optimum germination conditions of Nei Meng ken barley and Australia barley were ascertained by using the nuclease activity of malt root and malt root product as index in order to prepare highly active nuclease from barley malt root.Then，the effect of nuclease extraction conditions of barly malt root on the nuclease activity was studied.The results showed that the best germination temperature was 25℃，germination time was 64 h，the highest nuclease activity in Nei Meng ken barley and Australia barley malt root was316.7 U·mL-1，364.5 U·mL-1，respectively.As the length of barley malt root was 1～1.5 times than that of barely seeds，the highest nuclease activity in Nei Meng ken barley and Australia barley malt root was 353.8 U·mL-1，321.0 U·mL-1，respectively.When the size of malt root powder particle was 60 mesh sieve，the nuclease extraction temperature was 50℃，pH5.1，material/liquid ratio was 1∶12，malt root product nuclease activity was 543.6 U·mL-1.It provided theoretical basis for further application of nuclease of barley malt root.

barley；germination；malt root；nuclease；enzyme activity

Q946.5

A

1002-2090（2016）02-0070-06

10.3969/j.issn.1002-2090.2016.02.014

2015-06-19

黑龍江省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項(xiàng)目（201310223027）；黑龍江省農(nóng)墾總局科技局項(xiàng)目（HNK125B-13-03）；黑龍江省教育廳項(xiàng)目（JG2012010458）。

劉馨予（1987-），女，黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院2011級碩士研究生。

崔素萍，女，教授，碩士研究生導(dǎo)師，E-mail：cuisup@163.com。