乙氧酰胺苯甲酯表面分子印跡聚合物的制備與吸附特性

張臘梅，李道敏，李兆周，劉二偉，李松彪，曹 力，高紅麗，王 芳，侯玉澤（河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽 471003）

乙氧酰胺苯甲酯表面分子印跡聚合物的制備與吸附特性

張臘梅，李道敏*，李兆周，劉二偉，李松彪，曹 力，高紅麗，王 芳，侯玉澤
（河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽 471003）

合成功能單體N,O-雙異丁烯酰乙醇胺（N,O-bismethacryloyl ethanolamine，NOBE），采用表面分子印跡技術(shù)，以硅膠為載體，乙二醇二甲基丙烯酸酯（ethylene glycol dimethacrylate，EGDMA）為交聯(lián)劑，制備乙氧酰胺苯甲酯（ethopabate，ETP）分子印跡聚合物（molecularly imprinted polymers，MIPs）。采用正交試驗(yàn)方法，對(duì)ETPNOBE物質(zhì)的量比、ETP-EGDMA物質(zhì)的量比和致孔劑種類3 個(gè)因素進(jìn)行考察，結(jié)果表明：3 個(gè)影響因素主次順序?yàn)橹驴讋┓N類＞ETP-NOBE物質(zhì)的量比＞ETP-EGDMA物質(zhì)的量比；當(dāng)致孔劑為乙腈、ETP-NOBE-EGDMA的物質(zhì)的量比為1∶2∶20時(shí)，所制備的ETP-MIPs印跡效果最佳。Scatchard模型研究發(fā)現(xiàn)存在兩類結(jié)合位點(diǎn)，高親和位點(diǎn)與低親和位點(diǎn)的平衡離解常數(shù)Kd和最大表觀結(jié)合量Qmax分別為Kd1=1.608 μg/mL，Qmax1=1.101 μg/mg；Kd2=0.109 μg/mL，Qmax2=0.172 μg/mg。

分子印跡聚合物；表面分子印跡技術(shù)；正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)；乙氧酰胺苯甲酯

乙氧酰胺苯甲酯（ethopabate，ETP），分子式為C12Hl5O4N，相對(duì)分子質(zhì)量為237.26，抗球譜廣，抗球指數(shù)高，常作為一種廣譜型抗球蟲藥物，在雞球蟲病防治方面發(fā)揮著重要的作用[1]。然而此藥物的不合理使用，不僅會(huì)使雞產(chǎn)生抗藥性，而且極易造成雞肉組織中ETP的殘留超標(biāo)，人體食用后直接給健康帶來威脅[2]。

目前動(dòng)物性食品中ETP的主要檢測(cè)方法有液相色譜（liquid chromatograph，LC）法[3-4]、高效液相色譜（high performance liquid chromatograph，HPLC）法[5-7]、氣相色譜（gas chromatography，GC）法[4]、LC-質(zhì)譜（mass spectrometry，MS）聯(lián)用法[8]和電化學(xué)傳感器法[9]等。GC及LC-MS法檢測(cè)靈敏度較高，但GC法需對(duì)樣品進(jìn)行衍生化，操作繁瑣，干擾多，適用范圍有限；LC-MS法抗干擾能力強(qiáng)，更適用于多殘留檢測(cè)；而HPLC法易受到雜質(zhì)干擾，對(duì)樣品純度要求高，樣品前處理繁瑣，且檢測(cè)結(jié)果難以滿足藥物殘留限量的要求[10]。因此，研究出一種準(zhǔn)確度高、靈敏度強(qiáng)的檢測(cè)方法，用于雞肉中ETP的控制及檢測(cè)極為重要。

分子印跡技術(shù)（molecular imprinting technology，MIT）作為一種基于分子識(shí)別的分離技術(shù)倍受關(guān)注；采用該技術(shù)制備的分子印跡聚合物（molecularly imprinted polymers，MIPs）具有構(gòu)效預(yù)定性、特定識(shí)別性、化學(xué)穩(wěn)定性和廣泛適用性等優(yōu)點(diǎn)[11]，在食品檢驗(yàn)、藥物分離和檢測(cè)等方面顯示出廣泛的應(yīng)用前景。表面分子印跡在很大程度上改善了傳統(tǒng)聚合方法制備的MIPs選擇吸附能力低、剛性弱、傳質(zhì)速率慢、單分散性差和穩(wěn)定性不足等缺點(diǎn)，近年來被廣泛研究[12]。

本研究合成了功能單體N,O-雙異丁烯酰乙醇胺（N,O-bismethacryloyl ethanolamine，NOBE）；并采用表面分子印跡技術(shù)，以硅膠為載體、乙二醇二甲基丙烯酸酯（ethylene glycol dimethacrylate，EGDMA）為交聯(lián)劑，制備ETP-MIPs；通過正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，從ETP-NOBE物質(zhì)的量比、ETP-EGDMA物質(zhì)的 量比和致孔劑種類3 個(gè)因素進(jìn)行考察，對(duì)ETP-MIPs的制備條件進(jìn)行了優(yōu)化；并對(duì)ETP-MIPs的吸附性能進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乙醇胺（分析純） 江蘇強(qiáng)盛功能化學(xué)股份有限公司；三乙胺（分析純） 天津市德恩化學(xué)試劑有限公司；甲基丙烯酰氯（純度99%） 上海諾泰化工有限公司；柱層析硅膠（100～200、300～400目）青島海洋化工廠；KH-570硅烷偶聯(lián)劑（純度99.5%）恒宇化工有限公司；ETP（純度99%） 美國Sigma公司；EGDMA（純度99%） 阿拉丁試劑公司；乙腈（色譜純） 西隴化工股份有限公司；偶氮二異丁腈（分析純） 通光榮化工有限公司；其他有機(jī)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

SZCL-3B數(shù)顯控溫磁力攪拌器 鞏義市予華儀器責(zé)任有限公司；AC-60-S電動(dòng)攪拌器 上海昂尼儀器儀表有限公司；UV2400紫外-可見分光光度計(jì) 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；1260 HPLC儀 美國安捷倫公司；VERTEX70傅里葉變換紅外光譜儀 德國布魯克公司；STARe差示掃描量熱（differential scanning calorimeter，DSC）儀 瑞士梅特勒-托利多集團(tuán)；S-4800場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 功能單體的合成

參照文獻(xiàn)[13-14]報(bào)道的方法，N2保護(hù)及冰浴條件下，將64 mmol（3.83 mL）乙醇胺加入裝有200 mL CH2Cl2的500 mL四口瓶中，以400 r/min的速率進(jìn)行機(jī)械攪拌，然后向混合溶液中緩慢加入148 mmol（20.6 mL）三乙胺，攪拌15 min后，逐滴緩慢加入148 mmol（14.4 mL）甲基丙烯酰氯，將溫度緩慢升至室溫后反應(yīng)24 h。反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)所得產(chǎn)物進(jìn)行抽濾，棄除濾渣，濾液依次用30 mL 5 mol/L的NaHCO3溶液和30 mL 5 mol/L的檸檬酸鈉溶液進(jìn)行洗滌，收集淡黃色有機(jī)層液體，加入10 g無水Na2SO4脫水后，過濾，濾液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，脫除有機(jī)溶劑，得到黃色油狀物。采用硅膠柱層析法提純所得產(chǎn)品，先用乙酸乙酯-正己烷（1∶1，V/V）混合溶液洗脫除去雜質(zhì)，再用乙酸乙酯洗脫，得到目標(biāo)化合物，進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后，得到淡黃色油狀物即為NOBE。

ν/cm－1：3 334.72[δ（N—H）]，1 720.66[δ（C＝O）]，1 6 5 8.5 8，1 6 2 1.4 7[δ（C＝C）]，1 2 9 7.3 9 [δ（C—N）]，1 167.82 [δ（C—O）]。1H NMR （DMSO，400 MHz，10－6）：δ 8.08（1H，bs），6.04 （1H，m），5.64 （1H，t，J=4 Hz），5.32 （1H，s），4.14 （2H，t，J=8 Hz），3.41（2H，t，J=4 Hz），1.86（3H，s），1.84（3H，s）；13C NMR （DMSO，400 MHz，10－6）：δ 167.80，166.51，139.82，135.84，125.74，119.06，62.74，39.40，18.50，17.89。Mr=197。

1.3.2 硅膠的活化與硅烷化

[15-16]報(bào)道的方法：稱取硅膠20 g加到100 mL濃硝酸中，磁力攪拌2 h，均勻后靜置24 h，通過浸泡可除去無機(jī)雜質(zhì)并增加其表面羥基數(shù)目?；罨枘z用去離子水反復(fù)清洗至pH 7，于100 ℃條件下干燥12 h后，備用。N2保護(hù)條件下，250 mL三口燒瓶中加入活化硅膠以及100 mL甲苯，磁力攪拌條件下逐滴滴加KH-570硅烷偶聯(lián)劑10 mL，于120 ℃條件下回流反應(yīng)24 h，制得表面被不飽和C＝C雙健修飾的改性硅膠。將所得產(chǎn)物依次用甲苯、丙酮、甲醇進(jìn)行清洗，于100 ℃條件下干燥12 h，得到硅烷化硅膠，裝入自封袋中，封口備用。

1.3.3 ETP表面MIPs的制備

稱量1 mmol ETP溶于90 mL乙腈中，加入一定量功能單體NOBE和引發(fā)劑偶氮二異丁腈（2,2’-azobis(2-methylpropionitrile)，AIBN）100 mg，超聲混勻后，封口，靜置于冰箱中，4 ℃條件下低溫預(yù)聚合12 h。準(zhǔn)確稱取2 g硅烷化硅膠加入到250 mL三口燒瓶中。向預(yù)聚合溶液中依次加入一定量交聯(lián)劑EGDMA，超聲混勻10 min。N2保護(hù)條件下，將混合溶液緩慢加入四口燒瓶中，以400 r/min的轉(zhuǎn)速進(jìn)行機(jī)械攪拌，通N215 min后密封，在60 ℃的水浴條件下進(jìn)行聚合反應(yīng)12 h。聚合反應(yīng)結(jié)束后，將混合液體進(jìn)行離心，棄上清液，將得到的MIPs先用超純水進(jìn)行洗滌，渦旋并離心3 次，采用同 樣方法，再依次用甲醇洗滌3 次、乙醇洗滌2 次，以除去未參與聚合反應(yīng)的功能單體和交聯(lián)劑等其他雜質(zhì)分子，最終將得到的MIPs于120 ℃條件下干燥6 h。

以甲醇-乙酸（9∶1，V/V）混合溶液為洗脫液進(jìn)行洗提，洗脫液多次更換，直到紫外測(cè)試無ETP檢出為止。用甲醇洗滌除去乙酸等雜質(zhì)，所得MIPs于100 ℃條件下干燥，并用200～325 目分級(jí)篩進(jìn)行分級(jí)，得到粒徑范圍在45～75 μm的MIPs。

非印跡聚合物（non-imprinted polymers，NIPs）的制備除了不加ETP外，其他與MIPs相同。

1.3.4 ETP-MIPs制備單因素試驗(yàn)

影響MIPs吸附效果的因素有很多，其中致孔劑的種類、功能單體用量以及交聯(lián)劑用量等是其最主要的影響因素。

1.3.4.1 致孔劑種類的選擇

致孔劑可使MIPs生成豐富的孔結(jié)構(gòu)。對(duì)于非共價(jià)型印跡，致孔劑對(duì)MIPs的結(jié)構(gòu)、形態(tài)影響較大，其極性、介電常數(shù)、黏度及用量等都會(huì)對(duì)MIPs的吸附效果產(chǎn)生較大影響[17]。固定模板ETP用量1 mmol、NOBE用量4 mmol、EGDMA用量20 mmol，分別選擇乙腈、氯仿、丙酮作為溶劑制備MIPs。

基于HPLC法，根據(jù)吸附前后溶液中ETP質(zhì)量濃度變化計(jì)算MIPs和NIPs的吸附量Q，平行測(cè)定3 次取平均值。計(jì)算[18]如式（1）所示：

式中：C0為ETP的初始質(zhì)量濃度/（μg/mL）；C為ETP的平衡質(zhì)量濃度/（μg/mL）；V為溶液體積/mL；M為微球質(zhì)量/mg。

印跡效果（α）[19]的計(jì)算按照公式（2）進(jìn)行：

式中：QMIPs為MIPs的吸附量/（μg/mg）；QNIPs為NIPs的吸附量/（μg/mg）。

1.3.4.2 功能單體用量的選擇

功能單體為MIPs提供特定的結(jié)合位點(diǎn)；用量不足會(huì)引起專一識(shí)別位點(diǎn)少，MIPs含有較少印跡空穴；含量過多時(shí)，過量的功能單體呈隨機(jī)分布狀態(tài)，從而引入更多游離的功能基團(tuán)，導(dǎo)致特異性吸附位點(diǎn)減少，非特異性吸附位點(diǎn)增多，使MIPs對(duì)模板的選擇吸附能力變差[20]。分別選擇NOBE用量為2、4、6 mmol，固定模板ETP用量1 mmol、EGDMA用量20 mmol，制備ETP-MIPs。

1.3.4.3 交聯(lián)劑用量的選擇

交聯(lián)劑可用于固定結(jié)合位點(diǎn)，生成與模板分子結(jié)構(gòu)匹配的印跡空穴。用量較少時(shí)，所制備的MIPs交聯(lián)度較低，剛性弱，比表面積較小，吸附能力降低；過量則會(huì)引起MIPs交聯(lián)度過高，剛性過強(qiáng)，這不僅使模板分子洗脫較難，部分特異性結(jié)合位點(diǎn)被包埋其中，有效印跡空穴減少，導(dǎo)致模板分子難以與其內(nèi)部的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，MIPs吸附能力較差[21]。分別選擇EGDMA用量為10、20、30 mmol，固定模板ETP用量1 mmol、NOBE用量4 mmol，制備ETP-MIPs。

1.3.5 正交試驗(yàn)

為了制備出具有理想印跡效果的ETP-MIPs，采用L9（34）因素水平表進(jìn)行正交試驗(yàn)，主要從ETP-NOBE物質(zhì)的量比、ETP-EGDMA物質(zhì)的量比和致孔劑種類3 個(gè)因素考察（表1），在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，對(duì)ETP-MIPs的制備條件進(jìn)行優(yōu)化。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 The table of orthogonal experiment factor level code

1.3.6 ETP-MIPs的表征

1.3.6.1 ETP-MIPs吸附性能的測(cè)定

準(zhǔn)確配制5 μg/mL的ETP乙腈標(biāo)準(zhǔn)溶液50 mL。準(zhǔn)確稱取各組MIPs和NIPs各20 mg，分別裝入5 mL離心管中。各加入2 mL 5 μg/mL的ETP標(biāo)準(zhǔn)溶液，密封后，置于恒溫?fù)u床中，以室溫25 ℃、160 r/min的振蕩速率振蕩6 h后，離心取上清液，0.22 μm有機(jī)濾膜過濾，進(jìn)行HPLC檢測(cè)。

1.3.6.2 傅里葉紅外光譜檢測(cè)

對(duì)普通硅膠、硅烷化硅膠、MIPs、NIPs進(jìn)行紅外光譜檢測(cè)，采用KBr壓片法，以純KBr為底物樣品，在4 000～400 cm－1范圍內(nèi)進(jìn)行測(cè)定。通過紅外圖譜中一些特殊基團(tuán)的特征峰進(jìn)行分析，探討ETP與NOBE之間的相互作用機(jī)理。

1.3.6.3 DSC檢測(cè)

分別稱取10～20 mg MIPs和NIPs，在N2環(huán)境下，50～350 ℃溫度范圍內(nèi)（升溫速率5 ℃/min ）進(jìn)行測(cè)試及分析，以評(píng)價(jià)ETP-MIPs和ETP-NIPs的熱穩(wěn)定性。

1.3.6.4 掃描電鏡檢測(cè)

通過場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡測(cè)試，放大500～10 000倍后，觀察ETP-MIPs、ETP-NIPs的微觀結(jié)構(gòu)，研究其結(jié)構(gòu)及形貌。

1.3.6.5 等溫吸附曲線的測(cè)定與Scatchard分析

準(zhǔn)確配制質(zhì)量濃度為0.1、0.2、0.5 、1、1.5、2、3、4、5、10、15、20 μg/mL的系列ETP乙腈標(biāo)準(zhǔn)工作液。分別稱取ETP-MIPs、ETP-NIPs各20 mg，裝入一系列5 mL離心管中。各離心管加入2 mL不同質(zhì)量濃度的ETP標(biāo)準(zhǔn)溶液，密封后，置于恒溫?fù)u床中，以室溫25 ℃、160 r/min的速率振蕩6 h，取出并進(jìn)行離心，取上清液1 mL經(jīng)0.22 μm的有機(jī)濾膜過濾，用HPLC檢測(cè)。根據(jù)吸附前后標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度改變，計(jì)算不同質(zhì)量濃度水平條件下ETP-MIPs和ETP-NIPs的結(jié)合量。以ETP標(biāo)準(zhǔn)溶液的初始質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以單位質(zhì)量ETPMIPs、ETP-NIPs對(duì)ETP的結(jié)合量Q為縱坐標(biāo)，繪制等溫吸附曲線。

根據(jù)Scatchard模型[22]對(duì)ETP-MIPs的結(jié)合性能進(jìn)行分析研究，其方程如式（3）所示：

式中：Q為單位質(zhì)量ETP-MIPs對(duì)ETP的結(jié)合量/（μg/mg）；C為達(dá)到吸附平衡后ETP的質(zhì)量濃度/（μg/mL）；Qmax為最大表觀結(jié)合量/（μg/mg）；Kd為結(jié)合位點(diǎn)的平衡離解常數(shù)/（μg/mL）。

以單位質(zhì)量ETP-MIPs對(duì)ETP的結(jié)合量Q為橫坐標(biāo)，以Q/C為縱坐標(biāo)作圖，進(jìn)行線性擬合，并求得結(jié)合位點(diǎn)的Kd與Qmax。

2 結(jié)果與分析

2.1 ETP-MIPs制備條件的優(yōu)化

2.1.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1.1 致孔劑種類的選擇

表2 致孔劑種類對(duì)MIPs印跡效果的影響Table 2 Influence of different porogens on the adsorption efficiency of MIPs

如表2所示，致孔劑為乙腈時(shí)，MIPs印跡效果最好，選擇乙腈做致孔劑制備MIPs。

2.1.1.2 功能單體用量的選擇

表3 功能單體用量對(duì)MIPs印跡效果的影響Table 3 Influence of functional monomer dosage on the adsorption efficiency of MIPs

如表3所示，NOBE用量為2 mmol時(shí)，ETP-MIPs印跡效果最好，而NOBE用量為6 mmol時(shí)ETP-MIPs印跡效果最差，這是由于過量的功能單體使得ETP-MIPs特異吸附能力降低。因此選擇ETP與NOBE物質(zhì)的量比為1∶2制備MIPs。

2.1.1.3 交聯(lián)劑用量的選擇如表4所示，當(dāng)EGDMA用量為20 mmol時(shí)，ETPMIPs印跡效果最好；用量為10、20 mmol時(shí)，印跡效果均不理想，這是由于交聯(lián)劑用量不足或過量都會(huì)引起MIPs

表4 交聯(lián)劑用量對(duì)MIPs印跡效果的影響Table 4 Influence of crosslinking agent dosage on the adsorption efficiency of MIPs

中的有效印跡空穴變少，從而導(dǎo)致吸附能力變差。因此選擇ETP與EGDMA物質(zhì)的量比為1∶20制備MIPs。

2.1.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

表5 ETP-MIPs制備的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 5 Results of orthogonal array experiments for optimization of ETP-MIPs preparation

ETP-MIPs制備條件的優(yōu)化結(jié)果如表5所示。通過正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)ETP-NOBE物質(zhì)的量比、ETP-EGDMA物質(zhì)的量比和致孔劑種類3 個(gè)因素進(jìn)行考察，得到了理想MIPs的制備條件。

表5表明：3 個(gè)因素影響主次順序?yàn)镃＞A＞B，即致孔劑種類＞ETP-NOBE物質(zhì)的量比＞ETP-EGDMA物質(zhì)的量比；較優(yōu)組合水平為A2B2C2，即當(dāng)致孔劑為乙腈、ETP-NOBE-EGDMA的物質(zhì)的量比為1∶2∶20時(shí)，所制備的ETP-MIPs印跡效果最佳。

通過表6方差分析可知，因素A、C對(duì)指標(biāo)影響顯著，顯著性水平為α=0.05，因素B對(duì)指標(biāo)影響不顯著。通過正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，可得較優(yōu)組合水平為A2B2C2，增加驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)對(duì)正交結(jié)果加以確認(rèn)?；谧顑?yōu)組合水平，即選擇乙腈做致孔劑、ETP-NOBE-EGDMA的物質(zhì)的量比1∶2∶20，其他條件不變，制備ETP-MIPs和ETPNIPs，通過對(duì)其吸附性能進(jìn)行測(cè)試，平行測(cè)定3 次取平均值，得到ETP-MIPs的印跡效果為2.804。

表6 ETP-MIPs制備正交試驗(yàn)方差分析表Table 6 Analysis of variance for optimization of ETP-MIPs preparation

2.2 傅里葉紅外光譜檢測(cè)結(jié)果

圖1 活化硅膠、硅烷化硅膠的紅外圖譜Fig.1 Infrared spectra of activated silica gel and silylation silica gel

如圖1所示，觀察活化硅膠譜帶，在810 cm－1附近出現(xiàn)Si—O—Si鍵的對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰，450 cm－1處出現(xiàn)Si—O鍵的彎曲振動(dòng)峰；1 260 cm－1處是Si—OH鍵的面內(nèi)彎曲振動(dòng)峰；在3 650 cm－1處出現(xiàn)的吸收峰為尖峰，且峰形比較寬，這是由于硅膠經(jīng)活化后在其表面形成呈締合狀態(tài)的羥基發(fā)生伸縮振動(dòng)所致。觀察硅烷化硅膠譜帶，接枝硅烷基后，硅膠微粒的透光率減弱，Si—O—Si骨架的峰形變寬，吸收峰強(qiáng)度顯著增強(qiáng)；在950 cm－1處為一尖峰，這可能由于硅膠表面Si—OH被接枝C＝C后，造成Si—O骨架局部不對(duì)稱，發(fā)生伸縮振動(dòng)所致；1 500 cm－1處為C＝C骨架的伸縮振動(dòng)峰，這表明C＝C已接枝到硅膠表面；3 650 cm－1處仍存在—OH的吸收峰，說明活化硅膠表面呈締合狀態(tài)的羥基—OH未被全部接枝C＝C。

圖2 ETP-MIPs、ETP-NIPs的紅外圖譜Fig.2 Infrared spectra of ETP-MIPs and ETP-NIPs

如圖2所示，ETP-MIPs的吸收峰強(qiáng)度比ETP-NIPs低，ETP-MIPs的透光率略差于ETP-NIPs；ETP-MIPs和ETP-NIPs的譜帶比較類似，說明二者分子結(jié)構(gòu)是相似的，ETP-MIPs中的模板分子ETP已被完全洗脫干凈。圖譜中存在Si—O—Si鍵的對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰和Si—O骨架的彎曲振動(dòng)峰；2 920 cm－1處為烷烴—C—H的對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰，主要來自NOBE、EGDMA的—CH3和—CH2—，以及KH-570硅烷偶聯(lián)劑的—CH2CH3；1 260 cm－1處為—C—O—的伸縮振動(dòng)峰，1 740 cm－1處出現(xiàn)較強(qiáng)的酯羰基C＝O伸縮振動(dòng)峰，表明ETP-MIPs、ETP-NIPs的分子結(jié)構(gòu)中存在來自功能單體NOBE的基團(tuán)—C—O— C＝O；1 150 cm－1處為C—H鍵面內(nèi)彎曲振動(dòng)；ETP-MIPs譜帶中3 400 cm－1處為分子間氫鍵—O—H的伸縮振動(dòng)峰，對(duì)比ETP-NIPs譜帶，此處ETP-MIPs的—OH吸收峰較弱，并且發(fā)生一定程度的藍(lán)移現(xiàn)象，這是由于ETP-MIPs制備過程中，ETP與NOBE之間發(fā)生氫鍵作用，引起—OH吸收峰的強(qiáng)度及位移變化。

上述分析表明，ETP與NOBE之間通過氫鍵，在引發(fā)劑AIBN的引發(fā)聚合作用下，ETP、NOBE和EGDMA在硅膠表面發(fā)生共聚，屬于非共價(jià)印跡，成功合成ETP-MIPs。

2.3 DSC檢測(cè)結(jié)果

圖3 ETP-MIPs、ETP-NIPs的DSC曲線Fig.3 DSC curves of ETP-MIPs and ETP-NIPs

圖3可以反映出ETP-MIPs、ETP-NIPs在50～350 ℃范圍內(nèi)的熱穩(wěn)定性及其相態(tài)轉(zhuǎn)變的情況。據(jù)觀察，ETPMIPs和ETP-NIPs的吸熱與放熱過程基本一致，相態(tài)轉(zhuǎn)變相似；但ETP-NIPs出現(xiàn)相態(tài)轉(zhuǎn)變較快，其熱穩(wěn)定性不如ETP-MIPs。觀察ETP-MIPs曲線，50 ℃時(shí)發(fā)生吸熱反應(yīng)，之后達(dá)到基線平衡，這可能是由于樣品干燥不完全引起的，在150～215 ℃范圍內(nèi)，隨著溫度升高，ETPMIPs發(fā)生放熱反應(yīng)，形成冷結(jié)晶，其玻璃化溫度達(dá)到215 ℃，此后開始吸熱，當(dāng)溫度達(dá)到280 ℃左右時(shí)，ETPMIPs開始分解。而ETP-NIPs的玻璃化溫度為160 ℃，分解溫度僅為225 ℃左右，其熱穩(wěn)定性較差。

2.4 掃描電鏡檢測(cè)結(jié)果

圖4 ETP-MIPs、ETP-NIPs的掃描電鏡圖Fig.4 Scanning electron micrographs of silicon, ETP-MIPs and ETP-NIPs

如圖4所示，低倍（×500）時(shí)顯示ETP-MIPs基本保持了與硅烷化硅膠類似的結(jié)構(gòu)，分散性比較好，而ETPNIPs呈現(xiàn)出較復(fù)雜的無規(guī)則結(jié)構(gòu)，團(tuán)聚現(xiàn)象較為嚴(yán)重。放大到10 000倍后，可以清晰地看到硅烷化硅膠、ETPMIPs和ETP-NIPs的表面形貌，其中硅烷化硅膠表面比較均勻致密；由于多孔結(jié)構(gòu)的存在，ETP-MIPs表面粗糙不平；二者圖像很相似，差別不大，這主要是因?yàn)镸IPs在硅膠表面的膜層很薄，與沒有接枝的硅膠的區(qū)別不大。而ETP-NIPs顆粒形狀不規(guī)則，粒徑不均一，微粒間由于發(fā)生不規(guī)則的團(tuán)聚現(xiàn)象導(dǎo)致黏連成塊，分散性較差，并且表面比較光滑，凹凸感不強(qiáng)，沒有孔穴出現(xiàn)，這是由于在ETP-NIPs制備過程中， 沒有模板ETP參與分子印跡預(yù)組裝過程而引起的。

2.5 等溫吸附曲線的測(cè)定與Scatchard分析

圖5 ETP-MIPs和ETP-NIPs的等溫吸附曲線Fig.5 Isotherm absorption curves of ETP-MIPs and ETP-NIPs

如圖5所示，隨著ETP標(biāo)準(zhǔn)溶液初始質(zhì)量濃度的增大，ETP-MIPs、ETP-NIPs對(duì)ETP的結(jié)合量逐漸增多；質(zhì)量濃度較高時(shí)，ETP-MIPs、ETP-NIPs實(shí)現(xiàn)飽和吸附，二者吸附變化趨勢(shì)相同；對(duì)比相同質(zhì)量濃度添加條件下的吸附量，ETP-MIPs明顯高于ETP-NIPs，說明MIPs對(duì)模板分子的高度親合力和特異識(shí)別性遠(yuǎn)大于非選擇性鍵合作用[23]。這可能是由于ETP-MIPs中不僅存在能與ETP分子官能團(tuán)相匹配的結(jié)合位點(diǎn)，其表面還有能與ETP分子結(jié)構(gòu)相匹配的特定形狀的立體孔穴；印跡過程中，ETPMIPs對(duì)ETP具有一定的專一識(shí)別性，更有利于MIPs與ETP的結(jié)合，使得選擇性吸附能力增強(qiáng)；而ETP-NIPs沒有選擇性的結(jié)合位點(diǎn)，對(duì)ETP的吸附主要依靠非特異性吸附作用，導(dǎo)致其吸附容量較小[24-25]。

圖6 ETP-MIPs的Scatchard曲線Fig.6 Scatchard plot of ETP-MIPs

如圖6所示，通過Origin軟件進(jìn)行擬合，得到兩個(gè)線性擬合方程，分別為Q/C＝0.277－1.608Q（質(zhì)量濃度范圍為0.1～1 μg/mL，R2=0.958）和Q/C＝0.120－0.109Q（質(zhì)量濃度范圍為1～5 μg/mL，R2=0.965），這表明該分子印跡聚合物中存在兩種結(jié)合位點(diǎn)。根據(jù)線性擬合方程的斜率和截距，可求得ETP-MIPs中高親和位點(diǎn)與低親和位點(diǎn)的平衡離解常數(shù)Kd和最大表觀結(jié)合量Qmax，其中Kd1=1.608 μg/mL，Qmax1=1.101 μg/mg；Kd2=0.109 μg/mL，Qmax2=0.172 μg/mg。

3 結(jié)3 論

以硅膠為載體，ETP為模板分子，NOBE為功能單體，EGDMA為交聯(lián)劑，采用表面MIT制備ETP-MIPs。采用正交試驗(yàn)方法，從ETP-NOBE物質(zhì)的量比、ETPEGDMA物質(zhì)的量比和致孔劑種類3 個(gè)因素考察，對(duì)ETPMIPs的制備條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明：3 個(gè)因素影響主次順序?yàn)橹驴讋┓N類＞ETP-NOBE物質(zhì)的量比＞ETPEGDMA物質(zhì)的量比；當(dāng)致孔劑為乙腈，ETP-NOBEEGDMA的物質(zhì)的量比為1∶2∶20時(shí)，所制備的ETP-MIPs吸附效果最好，印跡效果達(dá)到2.804。采用紅外光譜、DSC以及場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡測(cè)試對(duì)其分子結(jié)構(gòu)、熱穩(wěn)定性和表面形貌進(jìn)行了研究。通過對(duì)ETP-MIPs的等溫吸附曲線進(jìn)行測(cè)定，并進(jìn)行Scatchard分析，線性擬合后發(fā)現(xiàn)存在兩類結(jié)合位點(diǎn)，求得其高親和位點(diǎn)與低親和位點(diǎn)的平衡離解常數(shù)Kd和最大表觀結(jié)合量Qmax，分別為Kd1=1.608 μg/mL，Qmax1=1.101 μg/mg；Kd2=0.109 μg/mL，Qmax2=0.172 μg/mg。研究表明，以NOBE為功能單體，采用表面分子印跡技術(shù)制備的ETP-MIPs對(duì)ETP具有一定的選擇吸附作用，這為MIT用于動(dòng)物性食品中ETP殘留的分離檢測(cè)提供了理論參考。

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Preparation and Characterization of Surface Molecularly Imprinted Polymers for Selective Adsorption of Ethopabate

ZHANG Lamei, LI Daomin*, LI Zhaozhou, LIU Erwei, LI Songbiao, CAO Li, GAO Hongli, WANG Fang, HOU Yuze
(College of Food and Bioengineering, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471003, China)

The novel functional monomer N,O-bismethacryloyl ethanolamine (NOBE) was synthesized and used to prepare molecularly imprinted polymers (ETP-MIPs) for adsorbing ethopabate by surface molecular imprinting technique using silica gel as the support matrix and ethylene glycol dimethacrylate (EGDMA) as the crosslinking agent. Three polymerization conditions including molar ratio of template to functional monomer, molar ratio of template to crosslinking agent and porogen type were optimized using an orthogonal array design. The type of porogen was the most important factor, followed by the ratio of template to functional monomer and ratio of template to crosslinking agent. The best imprinting efficiency was observed for molecularly imprinted polymers with a molar ratio of ETP to NOBE to EGDMA of 1:2:20 usin g acetonitrile as the porogen. The Scatchard analysis indicated that there were two classes of binding sites in ETP-MIPs; the equilibrium dissociation constant (Kd) and apparent maximum binding capacity (Qmax) for the high affinity sites and low affinity sites were calculated as follows: Kd1=1.608 μg/mL, Qmax1=1.101 μg/m g; and Kd2=0.109 μg/mL, Qmax2=0.172 μg/mg, respectively.

molecularly imprinted polymers; surface molecular imprinting technology; orthogonal array experiment; ethopabate

10.7506/spkx1002-6630-201604041

TS207.3

A

1002-6630（2016）04-0226-07

張臘梅, 李道敏, 李兆周, 等. 乙氧酰胺苯甲酯表面分子印跡聚合物的制備與吸附特性[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(4): 226-232.

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ZHANG Lamei, LI Daomin, LI Zhaozhou, et al. Preparation and characterization of surface molecularly imprinted polymers for selective adsorption of ethopabate[J]. Food Science, 2016, 37(4): 226-232. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201604041. http://www.spkx.net.cn

2015-06-04

河南省教育廳科學(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)項(xiàng)目（14B550015）；河南科技大學(xué)青年科學(xué)基金資助項(xiàng)目（2013QN021）

張臘梅（1989—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称钒踩珯z測(cè)。E-mail：zhanglamei89@foxmail.com

*通信作者：李道敏（1966—），女，副教授，碩士，研究方向?yàn)槭称焚|(zhì)量與安全。E-mail：dmli16@126.com