苦參堿誘導(dǎo)宮頸癌SiHa細(xì)胞凋亡的相關(guān)機(jī)制研究*

周美英 魏林珍 王海琳# 張愛(ài)笠 甄潔玉

（1甘肅省人民醫(yī)院婦產(chǎn)科 蘭州 730000；2甘肅中醫(yī)藥大學(xué) 蘭州 730000）

論著

苦參堿誘導(dǎo)宮頸癌SiHa細(xì)胞凋亡的相關(guān)機(jī)制研究*

周美英1魏林珍1王海琳1#張愛(ài)笠2甄潔玉1

（1甘肅省人民醫(yī)院婦產(chǎn)科 蘭州 730000；2甘肅中醫(yī)藥大學(xué) 蘭州 730000）

目的：觀察苦參堿體外誘導(dǎo)宮頸癌SiHa細(xì)胞凋亡效應(yīng)并對(duì)其可能的作用機(jī)制進(jìn)行初步探討。方法：將不同濃度（0.00、0.25、0.50、1.00、2.00 mg/ml）的苦參堿分別作用于體外培養(yǎng)的宮頸癌細(xì)胞，在不同時(shí)間點(diǎn)（24、48、72 h），采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞的增殖情況；采用Annexin-Ⅴ和PI雙染法在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)細(xì)胞的凋亡率；采用Western blot檢測(cè)細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3的表達(dá)。結(jié)果：各組苦參堿對(duì)SiHa細(xì)胞的增殖均有抑制作用，MTT和流式細(xì)胞結(jié)果顯示，不同濃度的苦參堿對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率與對(duì)照組相比存在明顯差異（P＜0.05），呈劑量效應(yīng)正相關(guān)及時(shí)間效應(yīng)正相關(guān)。加入Caspase-3抑制劑Z-DEVD-FMK后，各組細(xì)胞凋亡率與只加苦參堿組相比凋亡率下降。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示Caspase-3蛋白水平隨苦參堿濃度的提高而增加（P＜0.05）。結(jié)論：苦參堿可誘導(dǎo)宮頸癌SiHa細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡，其作用機(jī)制可能與提高Caspase-3活性有關(guān)。

苦參堿；宮頸癌；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡；Z-DEVD-FMK；Caspase-3

對(duì)鼻咽癌、胃癌、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、上皮性卵巢癌和大腸癌等都有不同程度的誘導(dǎo)凋亡的作用［3］?？鄥A抗腫瘤機(jī)制較為復(fù)雜，具體的凋亡作用機(jī)制因細(xì)胞種類不同而異。目前，苦參堿對(duì)宮頸癌SiHa細(xì)胞的影響及分子機(jī)制尚未見報(bào)道。本研究擬觀察苦參堿是否具有誘導(dǎo)宮頸癌SiHa細(xì)胞凋亡的效應(yīng)，同時(shí)通過(guò)觀察Caspase-3的變化情況，初步探討苦參堿對(duì)SiHa細(xì)胞的作用機(jī)制，為苦參堿治療宮頸癌的臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料宮頸癌細(xì)胞株購(gòu)自于蘭州大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院科研中心；苦參堿購(gòu)自寶雞市方晟生物開

發(fā)有限公司（純度98%）；DMEM為Gibco公司產(chǎn)品；胎牛血清購(gòu)自Hyclone公司；四單甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）、DMSO購(gòu)自Sigma公司；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（包括Annexin-Ⅴ-FITC，PI等）購(gòu)自美國(guó)BioLegend公司；兔抗人Caspase-3抗體購(gòu)自Sant Cruz公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體為中山金橋公司產(chǎn)品；Caspase-3抑制劑Z-DEVD-FMK購(gòu)于Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與藥物配置將凍存的宮頸癌SiHa細(xì)胞37℃快速溶解，常規(guī)復(fù)蘇和傳代。細(xì)胞接種在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)液中（含100 U/ml青霉素和100 U/ml鏈霉素），在37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁80%時(shí)傳代，1周大約2次。苦參堿采用無(wú)血清DMEM配制成濃度為32 mg/ml儲(chǔ)存液，0.22 μm一次性濾器過(guò)濾后，-20℃避光保存?zhèn)溆茫褂脮r(shí)分別配為終濃度為0.25～2.00 mg/ml溶液。經(jīng)前期預(yù)試驗(yàn)證實(shí)，25 μmol/L的Z-DEVD-FMK不影響腫瘤細(xì)胞增殖，但可顯著減弱苦參堿誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞的凋亡。

1.2.2 細(xì)胞增殖的測(cè)定（MTT法）分別取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SiHa細(xì)胞，以5 000個(gè)細(xì)胞接種到96孔板內(nèi)，生長(zhǎng)24 h后，加入不同濃度的苦參堿，分別為0.25、0.50、1.00、2.00 mg/ml，每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組、溶劑對(duì)照組和調(diào)零孔。分別培養(yǎng)24、48、72 h后，每孔加入新鮮配置的MTT溶液20 μl（濃度為5 g/L），37℃孵育4 h，棄上清，每孔加入DMSO 150 μl，水平振蕩器振蕩10 min（60次/min）后，用Multiskan MS ELISA reader（Labsysterms，Helsinki，F(xiàn)inland）在490 nm處檢測(cè)吸光度值（OD值）。細(xì)胞抑制率（%）=（1－實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值）×100%，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.2.3 流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡率將1×105密度的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期宮頸癌SiHa細(xì)胞，接種進(jìn)25 cm2培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)24 h后，棄去舊培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組分別加入含不同藥物濃度的苦參堿（0.5、1.0、2.0 mg/ml）干預(yù)，對(duì)照組加等量培養(yǎng)基?？鄥A作用24、48、72 h后，收集對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞（數(shù)目1～5×106個(gè)/ml），預(yù)冷PBS洗滌2次，將細(xì)胞重懸于200 μl Binding Buffer中，加入10 μl AnnexinV一FITC和5 μl PI，輕輕混勻，室溫避光孵育5 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡率。另外，用25 μmol/L Caspase-3抑制劑Z-DEVD-FMK處理各組細(xì)胞1 h后，然后加入不同濃度苦參堿（0.5、1.0、2.0 mg/ml），24 h后觀察各組凋亡率。流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.2.4 Western blotting分析Caspase-3蛋白的表達(dá)

SiHa細(xì)胞經(jīng)0.0、0.5、1.0、2.0 mg/ml濃度苦參堿處理24 h后，收集細(xì)胞提取蛋白，BCA法定量，12% SDS-PAGE凝膠電泳，蛋白上樣量為40 μg，濕法轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉溶于TBST液中封閉1 h，一抗（1∶500）4℃過(guò)夜，TBST洗5 min，3次，二抗（1∶2 000）室溫孵育1 h，TBST洗5 min，3次，ECL系統(tǒng)顯影，以β-actin為內(nèi)參照。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS16.0軟件進(jìn)行單因素方差分析及兩個(gè)獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以（±s）表示。

2 結(jié)果

2.1 苦參堿對(duì)人宮頸癌細(xì)胞增殖的影響不同濃度的苦參堿作用宮頸癌SiHa細(xì)胞不同時(shí)間后，MTT法檢測(cè)抑制細(xì)胞增殖的作用結(jié)果見表1。隨著苦參堿濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，SiHa細(xì)胞的數(shù)量逐漸減少，呈劑量和時(shí)間效應(yīng)關(guān)系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在0.25～2.00 mg/ml濃度范圍的苦參堿對(duì)宮頸癌SiHa細(xì)胞具有抑制作用，與空白對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 不同濃度苦參堿作用后各時(shí)點(diǎn)SiHa細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率比較（±s）

表1 不同濃度苦參堿作用后各時(shí)點(diǎn)SiHa細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05。

24 h48 h72 h 0.10±0.09 4.67±0.87*16.71±1.63*35.10±2.82*50.06±1.05*0.21±0.13 15.27±2.79*27.99±2.94*54.40±4.16*73.93±0.56*0.30±0.19 19.40±3.18*37.27±2.58*69.30±2.17*83.47±0.40*組別濃度（mg/ml）0.00 0.25 0.50 1.00 2.00對(duì)照組苦參堿組

2.2 苦參堿對(duì)宮頸癌SiHa細(xì)胞凋亡率的影響經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，苦參堿誘導(dǎo)SiHa細(xì)胞凋亡的作用隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)和給藥劑量的增加，細(xì)胞凋亡率增高，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。其中，2.0 mg/ml的苦參堿作用72 h時(shí)SiHa細(xì)胞凋亡率最高為70.08%。見圖1。0.5、1.0、2.0 mg/ml的苦參堿作用于SiHa細(xì)胞48 h后，SiHa細(xì)胞凋亡率分別為（7.42±0.43）%、（22.94±0.83）%、（39.34±0.74）%，空白對(duì)照組為（0.57±0.21）%。見圖2。與空白對(duì)照組比較，隨著苦參堿濃度的增強(qiáng)細(xì)胞晚期凋亡率增高。

圖1 AnnexinV2FITC/PI雙標(biāo)法檢測(cè)苦參堿對(duì)宮頸癌細(xì)胞凋亡的影響

圖2 苦參堿作用SiHa細(xì)胞48 h流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果

2.3 苦參堿對(duì)SiHa細(xì)胞Caspase-3蛋白表達(dá)的影響對(duì)不同濃度的苦參堿處理后的SiHa細(xì)胞進(jìn)行Caspase-3蛋白水平的檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，隨著苦參堿濃度的增加，細(xì)胞中Caspase-3蛋白水平也逐漸增加。見圖3。對(duì)Western blot結(jié)果進(jìn)行灰度掃描分析后，經(jīng)β-actin內(nèi)參的校正，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，0.5、1.0、2.0 mg/ml的苦參堿處理后，細(xì)胞內(nèi)的Caspase-3蛋白水平與對(duì)照組細(xì)胞比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖4。

圖3 不同濃度的苦參堿處理后的SiHa細(xì)胞進(jìn)行Caspase-3蛋白水平的檢測(cè)

圖4 不同濃度的苦參堿處理后的SiHa細(xì)胞進(jìn)行Caspase-3蛋白水平的檢測(cè)（β-actin內(nèi)參的校正）

3 討論

宮頸癌是位居第二位危害婦女健康的惡性腫瘤，化療是當(dāng)前主要治療手段之一。然而由于化療藥物的毒副作用及耐藥性的產(chǎn)生，尋求新的高效、低毒的抗腫瘤藥物成為科研工作者面臨的新挑戰(zhàn)。研究證實(shí)苦參堿對(duì)體內(nèi)多種腫瘤具有明顯抑制作用且未發(fā)現(xiàn)明顯的不良反應(yīng)，逐漸成為研究的焦點(diǎn)。

本研究發(fā)現(xiàn)不同濃度苦參堿（0.25、0.50、1.00、2.00 mg/ml）作用于宮頸癌SiHa細(xì)胞24、48、72 h后，抑制率與對(duì)照組比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示苦參堿抗腫瘤機(jī)制之一是抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，且隨著藥物劑量的增加，作用時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制率增高。進(jìn)一步應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡，結(jié)果顯示分別用苦參堿0.5、1.0、2.0 mg/ml作用于SiHa細(xì)胞24、48、72 h后，抑制率具有時(shí)間劑量依賴性。0.5、1.0、2.0 mg/ml的苦參堿作用于SiHa細(xì)胞48 h后，與對(duì)照組相比細(xì)胞晚期凋亡率明顯增加，可見苦參堿誘導(dǎo)Siha細(xì)胞晚期凋亡率亦隨著給藥劑量的增加而增高，說(shuō)明苦參堿能夠同時(shí)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞晚期凋亡，發(fā)揮其抗腫瘤作用。

目前，大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為凋亡相關(guān)基因的激活與腫瘤的增殖受抑相關(guān)，其中以Caspase家族最為關(guān)注［4～5］。Caspase為半胱氨酸天門冬氨酸蛋白酶的簡(jiǎn)稱，是一組具有相似氨基酸序列的半胱氨酸蛋白酶，迄今已發(fā)現(xiàn)16個(gè)成員［6～7］。所有的Caspase均以無(wú)活性的酶原形式存在，一經(jīng)激活將產(chǎn)生Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［8］。Caspase蛋白酶在組織分布及降解已知底物的功能上彼此有重疊現(xiàn)象，但在不同細(xì)胞或同一細(xì)胞受不同刺激誘發(fā)凋亡過(guò)程中，激活的Caspase不盡相同。但普遍認(rèn)為該家族成員Caspase-3是哺乳動(dòng)物細(xì)胞凋亡中的關(guān)鍵蛋白酶［9］。激活的Caspase-3能使許多與細(xì)胞結(jié)構(gòu)、細(xì)胞周期及DNA修復(fù)等有關(guān)的蛋白或激酶失活，從而使細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，0.5、1.0、2.0 mg/ml苦參堿分別作用SiHa細(xì)胞24 h，結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，隨著藥物濃度的增加，宮頸癌細(xì)胞Caspase-3蛋白表達(dá)量也增加（P＜0.05），提示在苦參堿作用組中Caspase-3高表達(dá)，可使腫瘤細(xì)胞對(duì)凋亡更敏感，更易發(fā)生凋亡，這可能是苦參堿誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、發(fā)揮抗腫瘤作用的重要機(jī)制之一。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示苦參堿作用24 h后，不同濃度實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率均高于對(duì)照組（P＜0.05），而用Caspase-3特異性抑制劑Z-DEVD-FMK預(yù)處理，均可使細(xì)胞凋亡率下降。進(jìn)一步證實(shí)，苦參堿可通過(guò)激活Caspase-3的表達(dá)誘導(dǎo)SiHa細(xì)胞凋亡，發(fā)揮其抗腫瘤作用。

綜上所述，苦參堿能抑制SiHa細(xì)胞的增殖而誘導(dǎo)凋亡，呈劑量時(shí)間依賴性。應(yīng)用Caspase-3特異性抑制劑Z-DEVD-FMK預(yù)處理后，細(xì)胞凋亡率有所下降，但還存在凋亡。表明苦參堿能明顯誘導(dǎo)體外培養(yǎng)宮頸癌細(xì)胞的凋亡，該作用可能通過(guò)激活Caspase-3的表達(dá)，除Caspase-3外，可能尚有其它凋亡通路被激活，值得進(jìn)一步探討。參考文獻(xiàn)

［1］張麗華，陳邦恩，潘明佳.苦參堿藥理作用研究進(jìn)展［J］.中草藥，2009，40（6）：1000-1003

［2］楊鈺萍，沈祥春.氧化苦參堿藥理作用的研究進(jìn)展［J］.中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2009，29（5）：405-407

［3］熊小春，安春妹.苦參堿抗腫瘤研究概況［J］.中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2009，6（33）：10-12

［4］LoMY，KimHT.Chondrocyte apoptosis inducedby hydrogen peroxide requires caspase activation but not mitochondrial pore transition［J］.Journal of Orthopaedic Research，2004，22（5）：1120-1125［5］Liang CZ，Zhang JK，Shi Z，et al.Matrine induces caspase-dependent apoptosis in human osteosarcoma cells in vitro and in vivo through the upregulation of Bax and Fas/FasL and downregulation of Bcl-2［J］.Cancer Chemother Pharmacol，2012，69（2）：317-331

［6］MarksN，BergMJ.Recentadvancesonneuronalcaspasesin development and neurodegeneration［J］.Neurochem Int，1999，35（3）：195-220

［7］Leist M，Jaattela M.Four deaths and a funeral：from caspases to alternative mechanisms［J］.Nat Rev Mol Cell Biol，2001，2（8）：589-598［8］Degterev A，Boyce M，Yuan J.A decade of caspases［J］.Oncogene，2003，22（53）：8543-8567

［9］Lakhani SA，Masud A，Kuida K，et al.Caspases 3 and 7：key mediators of mitochondrial events of apoptosis［J］.Science，2006，311（5762）：847-851

Effects of Matrine on Apoptosis of Human Cervical Cancer Cell SiHa and Its Mechanism

ZHOU Mei-ying1，WEI Lin-zhen1，WANG Hai-lin1#，ZHANG Ai-li2，ZHEN Jie-yu1
（1Department of Obstetrics and Gynecology，Gansu Provincial Hospital，Lanzhou730000；2Gansu University of Traditional Chinese Medicine，Lanzhou730000）

Objective：To observe the role of matrine（Mat）induced apoptosis of human cervical cancer SiHa cells and its mechanism.Methods：SiHa cells were exposed to the concentrations of matrine 0.00，0.25，0.50，1.00 and 2.00 mg/ml for 24，48，72 h.Cell proliferation was detected by MTT assay.Apoptosis was determined by double stained assay with Annexin-Ⅴand PI.Caspase-3 protein level was determined with western blot assay.Results：After SiHa cells were cocultured with matrine in vitro，the cell proliferation was inhibited in time and dose dependent manner.When the SiHa cells were cultured for 24，48，72 h by matrine 0.50，1.00，2.00 mg/ml，the total apoptosis rate was increased，which had ststistical significance compared with control group（P＜0.05）.The addition of the caspase-3 inhibitor Z-DEVD-FMK，the apoptotic rate and increase of matrine group decreased apoptosis rate.And the caspase-3 protein level increased with the increase of the concentration of matrine（P＜0.05）.Conclusion：Matrine can inhibit the proliferation and induce the apoptosis of SiHa cells in vitro，one of its possible mechanisms is that matrine increasing caspase-3 activity.

Matrine；Cervical cancer；Proliferation；Apoptosis；Z-DEVD-FMK，Caspase-3

R285.5

B

10.13638/j.issn.1671-4040.2016.08.001苦參堿（Matrine）是從中藥苦參的干燥根中提取出的具有藥理作用的一種中草藥，其具有抗心率失常、抗動(dòng)脈粥樣硬化、解熱鎮(zhèn)痛、升高白細(xì)胞、抗炎殺菌、治療乙型肝炎等作用［1～2］。隨著研究深入，發(fā)現(xiàn)苦參堿還具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡作用，

2016-06-23）

國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：H1621）；甘肅省自然基金（編號(hào)：1208RJZA109）

#通訊作者：王海琳，E-mail：wanghailinyx@163.com