散養(yǎng)雞鼠傷寒沙門氏菌的分離·鑒定·耐藥性研究

沈?qū)W懷，翟銀建，張丹俊*，潘孝成，趙瑞宏，戴 銀，胡曉苗

(1.安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，安徽合肥 230031；2.安徽省阜南縣畜牧獸醫(yī)局，安徽阜南 236300)

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散養(yǎng)雞鼠傷寒沙門氏菌的分離·鑒定·耐藥性研究

沈?qū)W懷1，翟銀建2，張丹俊1*，潘孝成1，趙瑞宏1，戴 銀1，胡曉苗1

(1.安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，安徽合肥 230031；2.安徽省阜南縣畜牧獸醫(yī)局，安徽阜南 236300)

從疑似感染的成年散養(yǎng)雞蛋殼和發(fā)病雛雞的肝臟、脾臟中分離到2株細(xì)菌，通過培養(yǎng)特性、鏡檢結(jié)果、生化鑒定、血清學(xué)分型等，2株分離細(xì)菌均被鑒定為鼠傷寒沙門氏菌，分別命名為AH-DY01 和AH-DY02。藥物敏感性檢測結(jié)果表明，AH-DY01對氟苯尼考、左氧氟沙星和環(huán)丙沙星敏感，對其他12種抗生素耐藥；AH-DY02對阿米卡星、氟苯尼考、左氧氟沙星、復(fù)方新諾明、慶大霉素、鏈霉素、環(huán)丙沙星和大觀霉素敏感，對其他7種藥物耐藥，2株沙門氏菌均表現(xiàn)多重耐藥性。動物回歸試驗(yàn)結(jié)果表明，2株鼠傷寒沙門氏菌均可致死雛雞。對分離菌的16S rDNA進(jìn)行測序與遺傳進(jìn)化分析，結(jié)果表明AH-DY01與標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC-1592和ATCC13311的同源性最高，而AH-DY02與日本分離株之間的親緣關(guān)系最近。

散養(yǎng)雞；鼠傷寒沙門氏菌；耐藥性；遺傳進(jìn)化

沙門氏菌(Salmonella)為革蘭氏陰性、兼性厭氧、無芽孢的小桿菌，目前發(fā)現(xiàn)的約有2 600多種血清型，其中絕大部分血清型對動物和人類具有致病性，是重要的人畜共患病原菌[1]。沙門氏菌部分血清型能引起禽類傳染病，可導(dǎo)致家禽大批死亡、使其生長發(fā)育減緩、間接降低其商品價值，給養(yǎng)殖業(yè)造成較大危害，帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2-3]。雞源沙門氏菌可同時通過水平方式和垂直方式進(jìn)行傳播，不僅可以引起不同階段的雞發(fā)病，還可通過污染環(huán)境、肉蛋等，引起人類食物中毒[4]。

安徽定遠(yuǎn)某散養(yǎng)土雞場自繁自養(yǎng)并對外供應(yīng)雞苗，近期種蛋的孵化率偏低，弱雛數(shù)量增加，向外供應(yīng)的雞苗育雛期死亡率在10%左右，產(chǎn)蛋雞并未發(fā)現(xiàn)明顯的臨床癥狀。對引進(jìn)該廠雞苗的養(yǎng)殖戶5日齡發(fā)病雛雞進(jìn)行臨床檢查，病雞主要表現(xiàn)為精神沉郁、拉稀、脫水；剖檢病變主要為肝周炎，肝臟有白色壞死點(diǎn)。筆者從該散養(yǎng)土雞場采集成年雞血液樣品、雞蛋以及發(fā)病雛雞的臟器，進(jìn)行病原分離、鑒定與耐藥性研究。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1病料采集。從疑似發(fā)病的定遠(yuǎn)散養(yǎng)某散養(yǎng)土雞場采集產(chǎn)蛋雞群的血液樣品與雞蛋以及發(fā)病雛雞的肝臟、脾臟、心臟等。

1.1.2主要試劑。15種K-B藥敏紙片和6種生化鑒定管，均購自杭州微生物試劑有限公司；麥康凱瓊脂、SS 瓊脂、三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基、沙門氏菌顯色培養(yǎng)基均購自青島海博生物技術(shù)公司；DNA提取試劑盒、PCR Master Mix、膠回收純化試劑盒均購自天根生化科技有限公司；PCR 引物由上海生物工程技術(shù)公司合成；雞白痢、雞傷寒多價染色平板凝集試驗(yàn)抗原和陽性血清均購自北京中海生物科技公司；沙門氏菌血清型診斷試劑盒購自寧波天潤生物藥業(yè)有限公司。

1.1.3對照菌株。鼠傷寒沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(CVCC2213)和大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(CVCC3367)，均購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.1.4試驗(yàn)動物。1日齡土雞雞苗，購自安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所疫病凈化試驗(yàn)示范場。

1.2方法

1.2.1血清沙門氏菌抗體檢測。將冷藏的30份血液樣品，3 000 r/min離心，取血清，備用。在白瓷反應(yīng)板反應(yīng)孔中加入50 μL檢測液，另加入50 μL待檢血清，振蕩混勻后置于25 ℃恒溫箱中反應(yīng)10 min，讀取結(jié)果，樣品孔中出現(xiàn)顆粒狀物質(zhì)即判定為陽性，反之則判為陰性。

1.2.2細(xì)菌分離與培養(yǎng)。將雞蛋表面用無菌生理鹽水清洗后的液體和發(fā)病雛雞的肝臟、脾臟等分別接種到SC 增菌培養(yǎng)液中，37 ℃下過夜增菌；在無菌條件下接種到麥康凱瓊脂平板和SS瓊脂平板上，37 ℃下培養(yǎng)24 h。在麥康凱瓊脂和SS瓊脂平板上挑取無色到灰白、半透明、圓形光滑的細(xì)小菌落，再接種到沙門氏菌顯色培養(yǎng)基在顯色培養(yǎng)基上呈現(xiàn)紫色小菌落，則為疑似沙門氏菌菌落。挑取單菌落進(jìn)行純培養(yǎng)和細(xì)菌涂片，經(jīng)過革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察其菌落形態(tài)。

1.2.3生化試驗(yàn)。挑取可疑菌落用生理鹽水制成菌液，按照杭州微生物試劑有限公司生化鑒定管的說明書進(jìn)行操作，依次向靛基質(zhì)、賴氨酸、硫化氫、尿素、氰化鉀、氰化鉀對照生化管中加入15 μL菌液，用石蠟封口后置于37 ℃細(xì)菌培養(yǎng)箱中，18～24 h內(nèi)觀察并記錄結(jié)果。參照GB 4789.4—2010《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 沙門氏菌檢驗(yàn)》進(jìn)行結(jié)果判定。

1.2.4PCR檢測。將疑似菌落置于5 mL LB 培養(yǎng)基中，37 ℃下振蕩培養(yǎng)8 h，使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，按照說明書提取分離菌株和對照菌株的基因組DNA。根據(jù)沙門氏菌特異性基因fimY設(shè)計(jì)1對特異性引物，上游fimY-F為5′-TATCACTTCCAACGCCGCAGATA -3′，下游fimY-R為5′-TGCGCTAAAGTTTCAATCATCAAC -3′。沙門氏菌的PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系：PCR Premix 12.5 μL，上下游引物各1 μL，DNA模板0.5 μL，補(bǔ)水至25 μL；PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，65 ℃退火25 s，72 ℃延伸30 s，共30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。預(yù)期擴(kuò)增的沙門氏菌特異性條帶為497 bp。將PCR 產(chǎn)物經(jīng)過1.5%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像儀中觀察并記錄結(jié)果。

1.2.5血清型診斷。參照血清型診斷試劑盒使用說明書，測定分離菌株的血清型。

1.2.6藥敏試驗(yàn)。對分離菌株進(jìn)行氨芐西林、氟苯尼考、頭孢噻肟、多西環(huán)素、磷霉素、左氧氟沙星、復(fù)合磺胺、呋喃唑酮、阿米卡星、慶大霉素、鏈霉素、阿奇霉素、環(huán)丙沙星、頭孢曲松、大觀霉素等藥物的敏感性檢測，按照WHO提供的Kirby-Bauer紙片擴(kuò)散方法操作，以抑菌圈直徑大小作為評定敏感度強(qiáng)弱的依據(jù)，結(jié)果按照藥敏紙片說明書進(jìn)行判定。

1.2.7動物致病性試驗(yàn)。將30羽1日齡雛雞隨機(jī)分為AH-DY01接種組、AH-DY02接種組和生理鹽水對照組，每組10 羽。用滅菌生理鹽水將沙門氏菌分離株配制成2×109CFU/mL的懸液，備用。接毒組雛雞經(jīng)頸部皮下注射接種制備的細(xì)菌懸液，劑量為0.3 mL/羽，對照組接種等量的生理鹽水。保證一致的常規(guī)飼養(yǎng)管理，感染后每天觀察并記錄雛雞的臨床癥狀、死亡時間和死亡數(shù)，剖檢并觀察死亡試驗(yàn)雛雞的病變，并對心血、肝臟、腦組織進(jìn)行細(xì)菌分離與鑒定。

1.2.8遺傳進(jìn)化分析。使用細(xì)菌16S rDNA 通用引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，27F為5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492R為5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃變性5 min；94 ℃變性30 s，52 ℃退火50 s，72 ℃延伸90 s，共32個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃下保存。PCR 擴(kuò)增片段預(yù)期大小為1 465 bp，將PCR產(chǎn)物通過1.5%瓊脂凝膠電泳進(jìn)行檢測，使用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。利用凝膠片段回收試劑盒將陽性條帶回收并純化，并送至上海生工進(jìn)行測序。將測序結(jié)果通過NCBI網(wǎng)站的Blast檢索系統(tǒng)進(jìn)行同源性分析，使用MEGA 4.0軟件對從GenBank數(shù)據(jù)庫中獲得的序列相似性較高的菌株進(jìn)行同源性分析，并構(gòu)建分支系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2　結(jié)果與分析

2.1血清沙門氏菌抗體檢測產(chǎn)蛋雞血清的沙門氏菌抗體檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，30份血清樣品中陽性樣品為27份，陽性率為90%，其中19份樣品為強(qiáng)陽性，說明雞群存在較嚴(yán)重的沙門氏菌感染。

2.2細(xì)菌分離與培養(yǎng)接種在麥康凱瓊脂平板和SS瓊脂平板，37 ℃下培養(yǎng)24 h后，在麥康凱瓊脂和SS瓊脂平板上出現(xiàn)無色到灰白、半透明、圓形光滑的細(xì)小菌落。挑取單個菌落接種顯色培養(yǎng)基，出現(xiàn)紫色小菌落，挑取菌落涂片進(jìn)行革蘭氏染色與鏡檢，革蘭氏染色呈陰性，鏡檢可見兩端鈍圓的短桿菌，單個或成對存在。分別從病料和雞蛋殼表面分離到2 株細(xì)菌，分別命名為AH-DY01 和AH-DY02。

2.3生化鑒定對分離的2株沙門氏菌疑似菌株進(jìn)行生化鑒定。由表1可知，AH-DY01 和AH-DY02的生化反應(yīng)相同，H2S和賴氨酸脫羧酶結(jié)果呈陽性，而靛基質(zhì)、尿素和氰化鉀結(jié)果呈陰性，參考GB 4789.4—2010《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 沙門氏菌檢驗(yàn)》，判定2株分離菌株為典型的沙門氏菌屬。

表1　分離菌株的生化鑒定結(jié)果

注：“+”表示陽性；“-”表示陰性。

Note：“+”indicated positive；and “-”indicated negative.

2.4PCR鑒定結(jié)果采用沙門氏菌fimY基因的特異性引物對分離菌進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。從圖1可以看出，所擴(kuò)增的DNA 片段大小約為497 bp，與預(yù)期片段大小一致，說明分離菌株為沙門氏菌。

注：M.DL2000 DNA Marker；PC.陽性對照；NC.陰性對照；1.AH-DY01;2.AH-DY02。Note：M.DL2000 DNA Marker；PC.Positive control；NC.Negative control；1.AH-DY01;2.AH-DY02.圖1　分離菌株fimY基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1　PCR amplification of isolated strain fimY gene

2.5血清學(xué)診斷對分離的2株沙門氏菌進(jìn)行血清型鑒定并分群。由表2可知，AH-DY01 和AH-DY02的血清型鑒定結(jié)果相一致，O抗原為1，4，[5]，12，H抗原第1相為i，第2相為1，2，屬于B亞群，從抗原式來看2株沙門氏菌均為鼠傷寒沙門氏菌。這表明該土雞場沙門氏菌流行菌株為鼠傷寒沙門氏菌。

2.6藥物敏感性試驗(yàn)由表3可知，AH-DY01株對氟苯尼考敏感，對左氧氟沙星和環(huán)丙沙星中敏，對其他12種抗生素表現(xiàn)耐藥。AH-DY02株對阿米卡星敏感，對氟苯尼考、左氧氟沙星、復(fù)方新諾明、慶大霉素、鏈霉素、環(huán)丙沙星和大觀霉素中敏，對其他7種抗生素表現(xiàn)耐藥。因此，建議使用氟苯尼考、阿米卡星、左氧氟沙星和環(huán)丙沙星等藥物進(jìn)行治療。

2.7動物致病性試驗(yàn)對健康雛雞的致病性試驗(yàn)結(jié)果表明，AH-DY01和AH-DY02接種組雛雞在接種菌液后第2天出現(xiàn)臨床癥狀，主要表現(xiàn)為精神沉郁、食欲下降、羽毛松亂、雙翼下垂、拉稀、脫水、迅速消瘦等沙門氏菌感染癥狀；接種組發(fā)病率均為100%，AH-DY01和AH-DY02接種組均在接種后第3天出現(xiàn)死亡，死亡率分別為20%和30%。剖檢可觀察到肝臟腫大、表面有暗紅色出血條紋，部分分布有黃白色壞死點(diǎn)，氣囊混濁；心、腦、脾臟、胸腺、法氏囊、腎組織未見明顯病變。對照組各器官組織無明顯肉眼可見的病理變化。從發(fā)病和死亡雛雞的肝臟組織、脾臟中均分離到鼠傷寒沙門氏菌。

表2　分離株的血清型鑒定

表3　分離株的藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2.8遺傳進(jìn)化分析將PCR擴(kuò)增后的16S rDNA片段進(jìn)行測序，將結(jié)果在NCBI網(wǎng)站的Blast檢索系統(tǒng)進(jìn)行同源性檢測，結(jié)果與鼠傷寒沙門氏菌的基因序列同源性均為100%，由此可見2株沙門氏菌均為鼠傷寒沙門氏菌，與血清學(xué)診斷結(jié)果相一致。從NCBI數(shù)據(jù)庫中選擇16組鼠傷寒沙門氏菌的16S rDNA基因序列使用MEGA 4軟件進(jìn)行進(jìn)化距離分析和構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。從圖2和圖3可以看出，AH-DY01和AH-DY02的親緣關(guān)系很近。此外，AH-DY01與標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC-1592(CP007531.1)和ATCC13311(CP009102.1)的進(jìn)化距離最近，與鼠傷寒沙門氏菌108株(JQ694626.1)和391株(JQ694627.1)的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，而AH-DY02與日本分離株(AB594754.1、AB594759.1和AB594763.1)的親緣關(guān)系最近，處于進(jìn)化樹的同一分支。

3　討論與結(jié)論

沙門氏菌的血清型眾多，部分血清型可以同時感染人和多種畜禽，給家禽養(yǎng)殖業(yè)和食品安全造成較大的危害[1]。近年來的研究表明，鼠傷寒沙門氏菌感染禽類發(fā)病呈現(xiàn)多發(fā)態(tài)勢，由此引發(fā)的食物中毒現(xiàn)象也時有發(fā)生[5]。目前，鼠傷寒沙門氏菌和腸炎沙門氏菌是全世界流行的主要沙門氏菌，并且在混合養(yǎng)殖場中禽類和其他家畜更容易感染鼠傷寒沙門氏菌[6]。筆者通過對疑似感染雞群進(jìn)行血清抗體檢測以及菌株培養(yǎng)特性、染色鏡檢、生化鑒定和血清型鑒定等確定為鼠傷寒沙門氏菌感染，血清抗體檢測與菌株分離結(jié)果一致，因此血清抗體的檢測可作為沙門氏菌流行病學(xué)的調(diào)查手段之一。筆者從成年雞的蛋殼表面和發(fā)病雛雞中均分離出菌株，說明在散養(yǎng)土雞中存在禽致病性鼠傷寒沙門氏菌的感染。動物回歸試驗(yàn)結(jié)果表明，該鼠傷寒沙門氏菌分離株對雛雞有較強(qiáng)的致病性，由于鼠傷寒沙門氏菌屬于人畜共患病原菌并且在雞蛋殼表面同樣分離到菌株，因此相關(guān)的蛋肉產(chǎn)品可能會威脅食品安全。

圖2　分離株AH-DY01和AH-DY02 16S rDNA片段的同源性比較Fig.2　Homologous comparison of16S rDNA gene of isolated strains AH-DY01 and AH-DY02

圖3　16S rDNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹分析Fig.3　Phylogenetic tree of 16S rDNA gene sequence

細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生的主要是由于大量抗菌藥物的濫用，導(dǎo)致細(xì)菌在藥物選擇壓力下發(fā)生的耐藥性突變或通過質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、整合子等可移動元件獲得的耐藥性[7]。沈海燕等[8]對上海地區(qū)分離的禽源沙門氏菌進(jìn)行耐藥性檢測發(fā)現(xiàn)，其中大部分的分離株表現(xiàn)為多重耐藥，最高達(dá)14重耐藥。戴建華等[9]和查華等[10]也得出類似的研究結(jié)果。研究表明，目前國內(nèi)禽源沙門氏菌對常用抗生素的耐藥情況較為嚴(yán)重，對藥物的敏感性越來越低，耐藥譜不斷擴(kuò)大[8-12]。該試驗(yàn)中分離到的2株鼠傷寒沙門氏菌多重耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重，分別表現(xiàn)為7重和10 重耐藥，這可能與養(yǎng)殖場的抗生素使用有關(guān)，因此臨床上不能單憑以往的所謂“經(jīng)驗(yàn)”來用藥，必須根據(jù)藥敏檢測結(jié)果來選擇治療用抗菌藥物。

筆者對2株分離菌的16S rDNA 進(jìn)行序列測定和系統(tǒng)進(jìn)化分析，結(jié)果表明2 個分離株之間具有較高的同源性，細(xì)菌16S rDNA 基因序列比對結(jié)果與血清型鑒定結(jié)果一致。與GenBank 中的16 個不同來源鼠傷寒沙門氏菌的序列比對結(jié)果表明，AH-DY01與標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC-1592和ATCC13311的進(jìn)化距離最近，AH-DY02與日本分離株之間的親緣關(guān)系最近。該研究結(jié)果進(jìn)而確定了分離菌株的遺傳進(jìn)化地位，為進(jìn)一步開展病原分子生物學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。

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Identification and Drug Resistance Analysis ofSalmonellatyphimuriumfrom Free-range Chicken

SHEN Xue-huai1, ZHAI Yin-jian2, ZHANG Dan-jun1*et al

(1. Institute of Animal and Veterinary Science, Anhui Academy of Agricultural Science, Hefei, Anhui 230031; 2. Animal Husbandry and Veterinary Bureau of Funan County in Anui Province, Funan, Anhui 236300)AbstractTwo bacterial strains were isolated from the eggshells of free-range hens and the liver and spleen of diseased chicks.Salmonellatyphimuriumstrains AH-DY01 and AH-DY02 were identified according to culture characteristics, microscopic examination, biochemical characteristics, serological typing and so on. Drug sensitive test showed that the AH-DY01 was sensitive to florfenicol, levofloxacin and ciprofloxacin, and was resistant to other 12 antibiotics. AH-DY02 was sensitive to amikacin, florfenicol, levofloxacin, ciprofloxacin, Trimethoprim-Sulfamethoxazole(TMP-SMZ), gentamicin, streptomycin and spectinomycin, and was resistant to other 7 antibiotics. Two strains ofSalmonellatyphimuriumshowed multi-drug resistant. Animal experimental results showed that the two strains both could cause chicken death. 16S rDNA sequencing and phylogenetic analysis showed that homology of AH-DY01 with standard strain ATCC-1592 and ATCC 13311 was the highest, while there was the highest homology between AH-DY02 and Japan isolated strains.

Free-range chicken;Salmonellatyphimurium; Drug-resistance; Genetic evolution

安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院院長青年創(chuàng)新基金項(xiàng)目(15B0414)；國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目(CARS-41)；安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(11C0404)。

沈?qū)W懷(1986- )，男，安徽合肥人，實(shí)習(xí)研究員，碩士，從事禽類傳染病研究。*通訊作者，研究員，從事禽類傳染病研究。

2016-07-20

S 858.31

A

0517-6611(2016)27-0110-04