栗現(xiàn)芳, 姚 瑞, 趙瑞華, 陳國(guó)梁, 陳宗禮
(1.陜西省紅棗重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,陜西延安 716000;2.延安大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,陜西延安 716000)
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棗果纖維素酶對(duì)裂果發(fā)生的影響
栗現(xiàn)芳1,2, 姚 瑞1, 趙瑞華1, 陳國(guó)梁1,2, 陳宗禮1,2
(1.陜西省紅棗重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,陜西延安 716000;2.延安大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,陜西延安 716000)
[目的]針對(duì)棗裂果問題,探討棗果纖維素酶對(duì)裂果發(fā)生的影響。[方法]以陜北主栽品種木棗、駿棗和團(tuán)棗的不同成熟期棗果的果皮和果肉為材料,采用還原糖法(DNS法),通過酶液提取和酶活性測(cè)定,分析不同樣品中的纖維素酶活性,探討不同裂果性品種、不同時(shí)期以及棗果不同組織中纖維素酶活性的動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)。[結(jié)果]抗裂性木棗不同成熟期纖維素酶活性變化差異顯著,其中脆熟期活性最高;極易裂性駿棗不同時(shí)期酶活性變化也呈顯著差異,裂果后活性明顯下降;較易裂性團(tuán)棗不同時(shí)期酶活性變化差異不顯著。不同組織間纖維素酶活性變化趨勢(shì)基本相同,差異均不顯著。不同品種間易裂性駿棗纖維素酶活性高于抗裂性木棗和較易裂性團(tuán)棗。[結(jié)論]易發(fā)生裂果的脆熟期酶活性高,抗裂性好,而裂果一旦發(fā)生會(huì)導(dǎo)致酶活性降低,并且裂果現(xiàn)象的發(fā)生與組織間的酶活性變化沒有關(guān)系。
棗;裂果;纖維素酶
紅棗,為鼠李科木本植物棗的果實(shí)[1],是我國(guó)陜北地區(qū)的一大特產(chǎn),其味甜可口,營(yíng)養(yǎng)豐富,富含多種氨基酸、維生素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[2],素有“活維生素C丸”的美譽(yù)[3]。紅棗還具有重要的藥用價(jià)值,對(duì)于脾胃虛弱、氣血不足、心悸失眠等癥狀有很好的緩解[4-6]。大棗富含的環(huán)磷腺苷對(duì)預(yù)防和治療心肌梗塞、冠心病等心腦血管疾病有很大的作用,同時(shí)還有防癌抗癌的功效[7]。
紅棗的適宜生態(tài)條件是干燥少雨、陽光充足的氣候,它適應(yīng)能力特別強(qiáng),耐寒(-30 ℃)、耐高溫(43 ℃)、耐鹽堿、耐貧瘠,特別是在干旱地區(qū)的棗樹結(jié)出的果實(shí),品質(zhì)尤佳。陜北黃河、洛河沿岸一帶,氣候、土壤條件均適宜棗樹生長(zhǎng),因此許多市縣的農(nóng)民都以種植紅棗為經(jīng)濟(jì)來源,種植面積達(dá)30萬hm2,正常年景的產(chǎn)量在20萬t左右[8]。但近年來陜北紅棗面臨嚴(yán)重的裂果問題。一般年份裂果、爛果率達(dá)15%左右,成熟期多雨的年份,裂果率達(dá)到50%~80%,嚴(yán)重的年份裂果率高達(dá)95%以上[9]。據(jù)報(bào)道,自然條件下不同品種間裂果一般與降雨時(shí)間和成熟度有關(guān)。
目前國(guó)內(nèi)已有很多學(xué)者致力于棗裂果問題的研究,且主要集中于探討果實(shí)解剖結(jié)構(gòu)、果實(shí)理化特性、遺傳特性、礦質(zhì)元素、外界環(huán)境條件等對(duì)裂果的影響,對(duì)棗裂果發(fā)生的生理機(jī)制研究較少[10-12]。解決棗裂果的方法,目前的研究較多集中在栽培方面,主要有選育抗裂品種、大棚栽培和加強(qiáng)土、肥、水綜合管理等[13]。其實(shí)果裂現(xiàn)象在水果中普遍存在,在對(duì)荔枝及油桃中抗裂性不同的品種進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn),細(xì)胞壁代謝相關(guān)酶活性與裂果密切相關(guān),其中纖維素酶活性在易裂品種中較抗裂品種活性高[14-16]。
筆者以陜北紅棗主栽品種駿棗、團(tuán)棗和木棗為材料,采用還原糖法(DNS法)測(cè)定不同裂果性品種、不同時(shí)期以及棗果不同組織中纖維素酶的活性變化,了解纖維素酶在不同品種中的時(shí)空表達(dá)模式,對(duì)于探究纖維素酶對(duì)裂果發(fā)生的影響機(jī)制提供理論參考,為后續(xù)抗裂品種的選育提供理論依據(jù)。
1.1材料
1.1.1原料。供試材料均采樣自延安延川當(dāng)?shù)?,有白熟期、半紅期、脆熟期、裂果后和完熟期5個(gè)時(shí)期的木棗、駿棗和團(tuán)棗,采集的棗果放入自封袋中保存,并立即放置于冰盒中,帶回實(shí)驗(yàn)室后于-80 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩F渲?,木棗為抗裂性品種,團(tuán)棗為較易裂性品種,駿棗為易裂性品種[17-18]。
1.1.2主要儀器。紫外分光光度計(jì)(UV2600),日本島津;高速冷凍離心機(jī)(HC-3614R)、電熱恒溫水浴鍋(HH-S4),北京科偉永新儀器有限公司;電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(DHG-9140A),上海齊欣科學(xué)儀器有限公司;超低溫冰箱,德國(guó);優(yōu)普系列超純水機(jī)(UPK-110),成都超純科技有限公司;電子天平(FA1004N),上海精密科學(xué)儀器有限公司。
1.1.3主要試劑及配制方法。濃度為1 mg/mL 的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液:將葡萄糖在恒溫干燥箱中105 ℃下干燥至恒重,準(zhǔn)確稱取100 mg 于100 mL 小燒杯中,用少量蒸餾水溶解后,移入100 mL 容量瓶中用蒸餾水定容,充分混勻。4 ℃冰箱中保存(可用12~15 d)。3,5-二硝基水楊酸(DNS)溶液:準(zhǔn)確稱取DNS 6.3 g 于500 mL 大燒杯中,用少量蒸餾水溶解后,加入2 mol/L NaOH 溶液262 mL,再加到500 mL 含有185 g 酒石酸鉀鈉(C4H4O6KNa·4H2O,MW=282.22)的熱水溶液中,再加5 g結(jié)晶酚(C6H5OH,MW=94.11)和5 g無水亞硫酸鈉(Na2SO3,MW=126.04),攪拌溶解,冷卻后移入1 000 mL 容量瓶中用蒸餾水定容,充分混勻。貯于棕色瓶中,室溫放置7 d后使用。0.1 mol/L pH 6.0的醋酸鈉緩沖液;1%甲基纖維素。
1.2方法
1.2.1葡萄糖(G)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。取8 支洗凈烘干的20 mL 具塞刻度試管,編號(hào)后按表1 加入標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖(G)溶液和蒸餾水,配制成一系列不同濃度的葡萄糖溶液。充分搖勻后,向各試管中加入1.5 mL DNS溶液,搖勻后沸水浴5 min,取出冷卻后用蒸餾水定容至20 mL,充分混勻。在540 nm 波長(zhǎng)下,以1號(hào)試管溶液作為空白對(duì)照,調(diào)零點(diǎn),測(cè)定其他各管溶液的光密度值并記錄結(jié)果。以葡萄糖含量(mg)為橫坐標(biāo),以對(duì)應(yīng)的光密度值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
表1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制作
1.2.2纖維素酶的提取。參照寧正祥的方法[19],取0.5 g樣品于預(yù)冷的研缽中,加入4 mL冷的0.1 mol/L pH 6.0的醋酸鈉緩沖液和少量石英砂,冰浴研磨勻漿,用3 mL醋酸鈉緩沖液迅速?zèng)_洗研缽研棒,一并轉(zhuǎn)移至離心管;低溫(4 ℃)下提取1 h;然后在低溫(4 ℃)下,10 000 r/ min離心20 min,上清液作為待測(cè)粗酶液。
1.2.3纖維素酶的活性測(cè)定。取2 mL 1%的甲基纖維素加0.5 mL的酶液(空白管此時(shí)不加酶液),于37 ℃下保溫60 min,加入2.5 mL DNS終止反應(yīng),混合均勻(空白管加0.5 mL酶液)。立即放入沸水浴中顯色5 min,流水冷卻,加入20 mL H2O稀釋,搖勻后于540 nm波長(zhǎng)下比色測(cè)定OD值。然后用3,5-二硝基水楊酸還原法測(cè)定生成的還原糖含量。
酶活力單位:1 mL酶液37 ℃,pH 6.0條件下,1 h分解甲基纖維素產(chǎn)生1 μmol葡萄糖為一個(gè)酶活單位(U)。
酶活力(U/g)=[葡萄糖含量(mg)×酶液定容總體積(mL)×稀釋倍數(shù)×5.56]/[反應(yīng)液中酶液加入量(mL)×樣品重(g)×?xí)r間(h)]
式中,5.56為1 mg葡萄糖的μmoL數(shù)(1 000/180=5.56)。
1.3數(shù)據(jù)處理利用Excel數(shù)據(jù)分析功能進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和統(tǒng)計(jì)分析。
2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線制作按照表1所示進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線制作,根據(jù)所測(cè)結(jié)果,以葡萄糖含量為橫坐標(biāo),以吸光度為縱坐標(biāo),利用Excel 2010繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得出回歸方程及相關(guān)系數(shù)(圖1);對(duì)測(cè)得的結(jié)果進(jìn)行F檢驗(yàn),F(xiàn)值=47.909 46,P=0.000 083(P<0.01),差異極顯著。R接近于1,說明兩個(gè)相關(guān)性比較大。
圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Glucose standard curve
2.2木棗不同時(shí)期果皮、果肉纖維素酶活性通過對(duì)木棗品種不同成熟期取材、酶液提取、酶活性測(cè)定及比較分析(圖2),結(jié)果表明,木棗果皮、果肉纖維素酶活性在不同時(shí)期的變化趨勢(shì)基本相同,從白熟期到脆熟期纖維素酶活性逐漸上升,而脆熟期到完熟期呈降低趨勢(shì)。不同時(shí)期間方差分析P≈0.04(0.01
0.05),同一時(shí)期果肉和果皮纖維素酶活性沒有顯著差異。
注:A.白熟期;B.半紅期;C.脆熟期;D.裂果后;E.完熟期;M-1.木棗果皮;M-2.木棗果肉。Note:A.White ripe season; B.Half red stage; C.Full red stage; D.After dehiscent fruit; E.Stage of complete ripeness; M-1.Pericarp of Mu jujube; M-2.Sarcocarp of Mu jujube.圖2 木棗(M)不同時(shí)期不同組織纖維素酶活性變化Fig.2 The change of different organizations,different periods of cellulase activity in ‘Mu’ jujube
注:B.半紅期;C.脆熟期;D.裂果后;E.完熟期;J-1.駿棗果皮;J-2.駿棗果肉。Note:B.Half red stage; C.Full red stage; D.After dehiscent fruit; E.Stage of complete ripeness; J-1.Pericarp of Jun jujube; J-2.Sarcocarp of Jun jujube.圖3 駿棗(J)不同時(shí)期不同組織纖維素酶活性變化Fig.3 The change of different organizations,different periods of cellulase activity in ‘Jun’ jujube
2.3駿棗不同時(shí)期果皮、果肉纖維素酶活性通過對(duì)駿棗不同時(shí)期不同組織酶活性比較分析(圖3),結(jié)果表明,駿棗果皮、果肉纖維素酶活性在不同時(shí)期的變化趨勢(shì)也基本相同,從半紅期到裂果后纖維素酶活性逐漸下降,此時(shí)間段果皮和果肉纖維素酶活性趨勢(shì)基本相同。裂果后到完熟期酶活性上升,且果肉纖維素酶活性高于果皮,上升趨勢(shì)也較為明顯。不同時(shí)期間方差分析P≈0.011(0.01
0.05),同一時(shí)期果肉和果皮纖維素酶活性沒有顯著差異。2.4團(tuán)棗不同時(shí)期果皮、果肉纖維素酶活性通過對(duì)團(tuán)棗不同時(shí)期不同組織酶活性比較分析(圖4),結(jié)果表明,團(tuán)棗果皮、果肉纖維素酶活性在不同時(shí)期的變化趨勢(shì)基本相同,從白熟期到半紅期呈上升趨勢(shì),此時(shí)間段果肉纖維素酶活性高于果皮。半紅期到裂果后果皮、果肉纖維素酶活性均呈下降趨勢(shì),在脆熟期后果肉纖維素酶活性低于果皮。不同時(shí)期間方差分析P≈0.11(P>0.05),不同組織間方差分析P≈0.69(P>0.05),纖維素酶活性變化在團(tuán)棗各個(gè)時(shí)期間和果皮果肉間均沒有顯著差異。
注:A.白熟期;B.半紅期;C.脆熟期;D.裂果后; T-1.團(tuán)棗果皮;T-2.團(tuán)棗果肉。Note:A.White ripe season; B.Half red stage; C.Full red stage; D.After dehiscent fruit; T-1.Pericarp of Tuan jujube; T-2.Sarcocarp of Tuan jujube.圖4 團(tuán)棗(T)不同時(shí)期不同組織纖維素酶活性變化Fig.4 The change of different organizations,different periods of cellulase activity in ‘Tuan’ jujube
2.5不同品種棗果纖維素酶活性比較分析從總體水平上比較不同品種、不同時(shí)期、不同組織酶活性的變化趨勢(shì)(圖5),表現(xiàn)為3個(gè)品種不同棗果組織間纖維素酶活性變化趨勢(shì)均表現(xiàn)一致,沒有顯著差異;木棗和團(tuán)棗纖維素酶酶活性變化趨于平穩(wěn),且木棗酶活性高于團(tuán)棗,駿棗不同成熟期棗果纖維素酶活性變化幅度較大,在裂果后表現(xiàn)明顯降低,除該時(shí)期外,均高于木棗和團(tuán)棗。
注:A.白熟期;B.半紅期;C.脆熟期;D.裂果后;E.完熟期;M-1.木棗果皮;M-2.木棗果肉;J-1.駿棗果皮;J-2.駿棗果肉;T-1.團(tuán)棗果皮;T-2.團(tuán)棗果肉。Note:A.White ripe season; B.Half red stage; C.Full red stage; D.After dehiscent fruit; E.Stage of complete ripeness; M-1.Pericarp of Mu jujube; M-2.Sarcocarp of Mu jujube; J-1.Pericarp of Jun jujube; J-2.Sarcocarp of Jun jujube; T-1.Pericarp of Tuan jujube; T-2.Sarcocarp of Tuan jujube.圖5 木棗、駿棗、團(tuán)棗不同時(shí)期不同組織纖維素酶活性變化Fig.5 The change of different organizations,different periods of cellulase activity in different breed
從棗果同一時(shí)期比較不同品種不同組織間酶活性的變化(圖6),在半紅期駿棗酶活性明顯高于其他2個(gè)品種;團(tuán)棗的纖維素酶活性整體水平都比較低,木棗居中,且兩者變化幅度較小,而駿棗變化幅度較大;從半紅期到脆熟期木棗果皮、果肉纖維素酶活性上升,駿棗和團(tuán)棗品種酶活性均下降;脆熟期到裂果后,木棗、駿棗和團(tuán)棗果皮、果肉纖維素酶活性都呈下降趨勢(shì)。
注:B.半紅期;C.脆熟期;D.裂果后; M-1.木棗果皮;M-2.木棗果肉;J-1.駿棗果皮;J-2.駿棗果肉;T-1.團(tuán)棗果皮;T-2.團(tuán)棗果肉。Note:B.Half red stage; C.Full red stage; D.After dehiscent fruit; M-1.Pericarp of Mu jujube; M-2.Sarcocarp of Mu jujube; J-1.Pericarp of Jun jujube; J-2.Sarcocarp of Jun jujube; T-1.Pericarp of Tuan jujube; T-2.Sarcocarp of Tuan jujube.圖6 同一時(shí)期不同品種、不同組織纖維素酶活性變化比較Fig.6 The change of different organizations,different breed of cellulase activity in the same periods
纖維素酶(β-1,4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶)是降解纖維素生成葡萄糖的一組酶的總稱,它不是單體酶,而是起協(xié)同作用的多組分酶系,是一種復(fù)合酶,作用于纖維素以及從纖維素衍生出來的產(chǎn)物,將不溶性纖維素轉(zhuǎn)化成葡萄糖。通過調(diào)查認(rèn)為,果皮中的纖維素酶可以水解果皮中的纖維素,降低果皮的機(jī)械強(qiáng)度,增加果實(shí)裂果的易發(fā)性。對(duì)于荔枝的研究表明,其易裂品種“糯米糍”果皮中的纖維素酶活性高于其抗裂品種“淮枝”。
該試驗(yàn)中同一品種果肉中的纖維素酶活性在各個(gè)時(shí)期的變化趨勢(shì)與果皮相似,差異均不顯著。對(duì)同一品種同一組織的纖維素酶活性在各個(gè)時(shí)期的變化分析可得,抗裂性木棗果皮中纖維素酶活性從白熟期到脆熟期逐漸上升,脆熟期到完熟期酶活性呈降低趨勢(shì),變化差異顯著,其中脆熟期酶活性表現(xiàn)最高;極易裂性駿棗果皮中纖維素酶活性從半紅期到裂果后逐漸下降,裂果后到完熟期酶活性上升,變化差異顯著;較易裂性團(tuán)棗果皮中纖維素酶活性從白熟期到半紅期呈上升趨勢(shì),半紅期到裂果后呈下降趨勢(shì),變化差異不顯著。對(duì)于不同品種間纖維素酶活性在各個(gè)時(shí)期的變化整體水平分析得出,在半紅期到脆熟期易裂性駿棗果皮中的纖維素酶活性高于較易裂性團(tuán)棗和抗裂性木棗,而在裂果后可能由于裂果現(xiàn)象會(huì)使纖維素酶用于分解纖維素從而導(dǎo)致極易裂性駿棗和較易裂性團(tuán)棗的纖維素酶活性均低于抗裂性木棗。因此,推測(cè)易發(fā)生裂果的脆熟期酶活性高,抗裂性好,而裂果一旦發(fā)生會(huì)導(dǎo)致供試品種酶活性降低;并且果皮和果肉間在任何一個(gè)品種任何一個(gè)時(shí)期都不存在顯著性差異,說明裂果現(xiàn)象的發(fā)生與組織間的酶活性變化沒有關(guān)系,具體作用原理還需后續(xù)試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。
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Effect of Cellulase on Jujube Fruit Cracking
LI Xian-fang1,2,YAO Rui1,ZHAO Rui-hua1et al
(1.Shaanxi Key Laboratory of Chinese Jujube, Yan’an,Shaanxi 716000; 2.College of Life Science,Yan’an University,Yan’an,Shaanxi 716000)
[Objective] Aiming at the problem of jujube fruit cracking,the influence of cellulase on jujube fruit cracking was discussed.[Method] With the main varieties of jujube in Northern Shaanxi,Mu jujube, Jun jujube and Tuan jujube,in different fruit maturity stage and different tissue as materials,by the method of DNS,through the extraction of enzyme,the measurement of enzyme activity,enzyme activity of cellulose in different samples were analyzed,the dynamic change trend of cellulase activity in different fruit varieties,periods and tissues were discussed.[Result] The changes of cellulose activity in different mature period was significant in crack resistance jujube,which the activity of brittle ripe stage was highest; The enzyme activity changes in different periods of easy to crack of Jun jujube also showed significant difference,activity decreased significantly after cracking; The enzyme activity in different periods of easier to crack of tuan jujube was not significant.The trend of cellulase activity in different tissues was basically the same,and the difference was not significant.Among different varieties,the cellulase activity of fissility Jun jujube were higher than that of the crack resistance of the Mu jujube and Tuan jujube fissility group.[Conclusion] The enzyme activity in brittle ripe stage is highest,crack resistance is good,and cracking event will lead to reduction of enzyme activity,and there is no relationship between fruit cracking and changes of enzyme activities in tissues.
Jujube; Fruit cracking; Cellulose
陜西省教育廳專項(xiàng)科研計(jì)劃項(xiàng)目(2013JK0735);延安市科學(xué)技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2013-KN12);延安大學(xué)校級(jí)科研計(jì)劃項(xiàng)目(YDK2015-76);陜西省科技廳農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新與攻關(guān)項(xiàng)目(2016NY-138);延安市科學(xué)技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2014CGZH-09)。
栗現(xiàn)芳(1981- ),女,河北魏縣人,講師,博士,從事植物遺傳育種研究。
2016-08-07
S 665.1
A
0517-6611(2016)27-0065-04