口服生化黃腐酸抗炎鎮(zhèn)痛作用初步研究

高金崗，石習(xí)霞，周連寧，郝清玉

（海南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 熱帶動(dòng)植物生態(tài)學(xué)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南?？?71158）

生化黃腐酸（biochemical fulvic acid ，BFA）是模擬自然界腐殖酸形成環(huán)境，將特定的多種微生物菌種接種到植物培養(yǎng)基中，生成的高純度腐植酸制劑。1992年，我國(guó)出現(xiàn)以秸桿為原料的發(fā)酵黃腐酸（生化黃腐酸）。與礦源黃腐酸（MFA）相比，其分子量更小，因生產(chǎn)中未經(jīng)高溫、高壓、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿等處理，保留了多種氨基酸、多糖、核酸和微量元素，故生物活性更高［1－2］。動(dòng)物試驗(yàn)表明，BFA 作為飼料添加劑能明顯提高動(dòng)物的抗炎能力［3－4］，尤其對(duì)奶牛乳房炎、隱性乳房炎的防治效果特別明顯，有效率達(dá)100%，治愈率達(dá)80%［5］。在臨床上，馬慶凱等［6］用黃腐酸鈉來(lái)進(jìn)行灌腸治療慢性非特異性結(jié)腸炎，其臨床短期療效肯定，總有效率達(dá)96.1%。

由于BFA出現(xiàn)的時(shí)間較MFA晚，目前主要是作為外敷輔助抗炎制劑和飼料添加劑使用，而作為口服制劑用于抗炎及鎮(zhèn)痛的研究報(bào)道尚不多見(jiàn)。因此，本文通過(guò)建立動(dòng)物炎癥模型，觀察口服BFA對(duì)小鼠急慢性炎癥模型的影響及小鼠在鎮(zhèn)痛扭體試驗(yàn)中的反應(yīng)，初步研究口服BFA的抗炎鎮(zhèn)痛作用，從而為BFA的抗炎鎮(zhèn)痛研究提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 試驗(yàn)選用健康同齡純種小鼠80只，其中，雌雄各40只，體重18 g～20 g，由第一軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。小鼠隨機(jī)分為8組，每組10只，雌雄各半。其中，1組～4組為添加BFA的試驗(yàn)組（二甲苯致小鼠耳廓腫脹試驗(yàn)；小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性試驗(yàn)；小鼠瓊脂肉芽腫試驗(yàn)；小鼠鎮(zhèn)痛扭體試驗(yàn)）；5至8組為相應(yīng)添加生理鹽水對(duì)照組。

1.1.2 主要藥品和試劑 BFA由河北深州市特種化工廠出產(chǎn)，純度為99%以上；伊文思藍(lán)為Fluka進(jìn)口分裝品。

1.1.3 主要儀器 紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)（UV－2000，上海尤尼科），電子天平（TP－214，德國(guó)賽多利斯），離心機(jī)（RI－2C，湖南星科）等。

1.2 方法

將小鼠按照分組在普通級(jí)實(shí)驗(yàn)室條件下分籠（雌雄分開(kāi)）飼養(yǎng)30 d。試驗(yàn)組和對(duì)照組均正常飲水及喂食。30 d后，對(duì)4組試驗(yàn)組小鼠灌胃給藥［7］。每只給BFA溶液0.2 mL，用量為每天50 mg／kg（經(jīng)預(yù)試驗(yàn)確定），每天1次，連續(xù)給藥10 d。對(duì)照組小鼠平行灌胃給等量的生理鹽水溶液。然后，進(jìn)行以下試驗(yàn)。

1.2.1 二甲苯致小鼠耳廓腫脹試驗(yàn) 試驗(yàn)小鼠在末次灌胃給藥30 min后，對(duì)照組和BFA組均用0.03 mL二甲苯均勻涂抹在小鼠右耳廓兩面致炎，左耳不涂為對(duì)照，致炎1 h后，可見(jiàn)右耳廓增厚、微紅，略微透明。用8 mm打孔器沿耳緣打下相應(yīng)部位的左右耳片，在電子分析天平上稱(chēng)重，計(jì)算腫脹度和抑制率。計(jì)算公式［8］如下：

1.2.2 小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性試驗(yàn) 試驗(yàn)小鼠在末次灌胃給藥1 h后，對(duì)照組和BFA組均腹腔注射6 mL／L醋酸溶液0.2 mL／只，在醋酸的刺激下形成腹腔內(nèi)炎癥，導(dǎo)致腹腔內(nèi)毛細(xì)血管通透性增加。30 min后給尾靜脈注射20 g／L依文思藍(lán)溶液，0.1 mL／10 g。20 min后頸椎脫臼處死小鼠，打開(kāi)腹腔，用10 mL生理鹽水分多次沖洗小鼠腹腔，收集沖洗液合并后加入生理鹽水至10 mL，離心，取上清液于590 nm比色，以吸光度（OD）值判斷小鼠腹腔毛細(xì)血管的通透性［9］。

1.2.3 小鼠瓊脂肉芽腫試驗(yàn) 對(duì)照組和BFA組的試驗(yàn)小鼠在末次灌胃給藥前，均于背部皮下注入經(jīng)高壓滅菌的20 g／L瓊脂（0.2 mL／只）。于末次灌胃給藥1 h后，頸椎脫臼處死小鼠，剪開(kāi)背部皮膚，剝離出瓊脂肉芽腫塊，在電子分析天平上稱(chēng)重，計(jì)算肉芽濕重（mg／10 g）和抑制率。公式［10］如下：

1.2.4 小鼠鎮(zhèn)痛扭體試驗(yàn) 對(duì)照組和BFA組試驗(yàn)小鼠在末次灌胃給藥1 h后，均腹腔注射6 mL／L醋酸溶液0.2 mL／只，在醋酸的刺激下會(huì)形成腹腔內(nèi)炎癥，導(dǎo)致滲出，而使小鼠產(chǎn)生疼痛扭體反應(yīng)（腹部收縮內(nèi)凹、臀部抬高、扭動(dòng)等）。觀察記錄小鼠20 min內(nèi)的扭體次數(shù)，作為試驗(yàn)鎮(zhèn)痛指標(biāo)并計(jì)算鎮(zhèn)痛百分率。計(jì)算公式如下：

1.2.6 統(tǒng)計(jì)方法 試驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 13.0軟件作統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉX±s）表示，顯著性差異用兩樣本平均數(shù)差異t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)結(jié)果以P＜0.05代表差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 二甲苯致小鼠耳廓腫脹試驗(yàn)

根據(jù)公式（1）計(jì)算的小鼠耳廓腫脹度見(jiàn)表1。試驗(yàn)結(jié)果顯示，添加BFA的試驗(yàn)組耳廓腫脹度明顯低于對(duì)照組，腫脹度平均值分別為1.96 mg和3.78 mg；根據(jù)公式（2）計(jì)算的腫脹度抑制率為34.06%。數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，BFA試驗(yàn)組與對(duì)照組相比差異顯著（P＜0.05），表明BFA對(duì)二甲苯所致小鼠耳廓腫脹有顯著地抑制作用（表1）。

表1 BFA對(duì)二甲苯所致小鼠耳腫脹的影響Table1 Effect of BFA on Xylene－induced ear swelling in mice

2.2 小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性試驗(yàn)

試驗(yàn)結(jié)果顯示，添加BFA試驗(yàn)組的腹腔液的OD值明顯低于對(duì)照組，OD值平均值分別為0.195和0.306。數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，BFA試驗(yàn)組與對(duì)照組相比差異顯著（P＜0.05），表明BFA對(duì)醋酸所致小鼠腹腔毛細(xì)血管的通透性增高有明顯抑制作用（表2）。

2.3 小鼠瓊脂肉芽腫試驗(yàn)

根據(jù)公式（3）計(jì)算的小鼠肉芽濕重見(jiàn)表3。試驗(yàn)結(jié)果顯示，添加BFA的試驗(yàn)組肉芽腫濕重明顯低于對(duì)照組，肉芽濕重平均值分別為0.157和0.208；根據(jù)公式（4）計(jì)算的肉芽抑制率為24.52%。數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，BFA試驗(yàn)組與對(duì)照組相比差異顯著（P＜0.05），表明BFA對(duì)瓊脂所致的慢性皮下肉芽腫的形成具有一定的抑制作用（表3）。

2.4 小鼠鎮(zhèn)痛扭體試驗(yàn)

如表4所示，添加BFA試驗(yàn)組小鼠的扭體次數(shù)明顯少于對(duì)照組，扭動(dòng)次數(shù)的平均值分別為26.10和44.20；根據(jù)公式（5）計(jì)算的BFA鎮(zhèn)痛百分率為40.95%。數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，BFA試驗(yàn)組與對(duì)照組相比有顯著性差異（P＜0.05），表明BFA對(duì)醋酸所致小鼠疼痛有明顯鎮(zhèn)痛作用。

表2 BFA對(duì)小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性的影響Table2 Effect of BFA on celiac capillary permeability in mice

表3 BFA對(duì)小鼠皮下瓊脂肉芽腫生成的影響Table3 Effect of BFA on weight of agar granuloma in mice（mg／10g）

表4 BFA對(duì)小鼠鎮(zhèn)痛試驗(yàn)中扭體次數(shù)的影響Table4 Effect of BFA on writhing times in analgesic experiments in mice

3 討論

二甲苯致小鼠耳廓腫脹試驗(yàn)是研究動(dòng)物早期急性炎癥的常用方法。試驗(yàn)結(jié)果顯示，預(yù)防給藥的BFA試驗(yàn)組耳廓腫脹度明顯低于對(duì)照組（P＜0.05）。表明BFA對(duì)二甲苯所致小鼠耳廓腫脹有顯著地抑制作用。

小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性試驗(yàn)也是研究動(dòng)物早期急性炎癥的常用方法。給小鼠腹腔內(nèi)注射6 mL／L醋酸溶液，在H﹢的刺激下，腹腔內(nèi)毛細(xì)血管通透性增加，血液內(nèi)液體成分從血管內(nèi)滲出。當(dāng)靜脈注射20 g／L依文思藍(lán)（染料）溶液時(shí)，依文思藍(lán)可與血漿蛋白瞬間結(jié)合，且牢固不易脫落，而隨液體成分滲入腹腔。測(cè)量腹腔液OD值可表示炎性滲出量，即可間接反應(yīng)血管通透性的高低。試驗(yàn)結(jié)果表明，預(yù)防給藥的BFA試驗(yàn)組的腹腔液的OD值顯著低于對(duì)照組 （P＜0.05），說(shuō)明BFA對(duì)醋酸所致小鼠腹腔毛細(xì)血管的通透性增高有對(duì)抗作用，可減少炎癥部位血管內(nèi)容物滲出，從而減輕水腫。

小鼠瓊脂肉芽腫模型是用于研究以肉芽結(jié)締組織增生為主的慢性炎癥模型。結(jié)果顯示，預(yù)防給藥的BFA試驗(yàn)組肉芽腫濕重明顯低于對(duì)照組（P＜0.05）。表明BFA對(duì)瓊脂所致的慢性皮下肉芽腫的形成有較明顯的抑制作用。陳霞等［11］采用外敷的方法給藥，證明了黃腐酸鈉對(duì)小鼠瓊脂肉芽腫的抑制作用，當(dāng)黃腐酸鈉的濃度達(dá)10 g／L時(shí)，抑制率最高，為22%，略低于本試驗(yàn)的24.52%的抑制率。這可能是因?yàn)锽FA比MFA的生物活性更高所致，也可能是由于試驗(yàn)條件、操作方法等不同導(dǎo)致的試驗(yàn)誤差所致。至于預(yù)防口服給藥是否比外敷給藥效果更好，這有待進(jìn)一步研究確認(rèn)。其抗慢性炎癥的機(jī)理可能是：BFA一方面使胸腺增大，增加淋巴細(xì)胞數(shù)量，增強(qiáng)了機(jī)體的細(xì)胞免疫功能；另一方面，激活單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)，增加巨噬細(xì)胞的吞噬活性，增強(qiáng)機(jī)體的非特異性免疫力［12］，從而提高了動(dòng)物整體的體質(zhì)及免疫水平，減輕了慢性炎癥的反應(yīng)。

小鼠鎮(zhèn)痛扭體試驗(yàn)是一個(gè)直觀的試驗(yàn)。給小鼠腹腔內(nèi)注入6 mL／L醋酸溶液，在H﹢的刺激下形成腹腔內(nèi)炎癥，血管內(nèi)物質(zhì)滲出引起水腫，導(dǎo)致小鼠產(chǎn)生疼痛扭體反應(yīng)。本試驗(yàn)觀察到BFA試驗(yàn)組小鼠的扭體次數(shù)明顯少于對(duì)照組（P＜0.05），鎮(zhèn)痛百分率為40.95%。表明BFA對(duì)醋酸所致小鼠的疼痛有明顯鎮(zhèn)痛作用。認(rèn)為這是由于BFA可對(duì)抗腹腔毛細(xì)血管通透性增加，減少因水腫引起的壓迫性疼痛的緣故。

早在北宋末年，我國(guó)就已經(jīng)將腐植酸用于醫(yī)藥。明代《本草綱目》中記載了主要成分為腐植酸的城東朽木和烏金散殼可治療多種炎癥及鎮(zhèn)痛。本試驗(yàn)表明，灌胃給藥使用BFA，對(duì)動(dòng)物急性、慢性炎癥模型及鎮(zhèn)痛試驗(yàn)中小鼠的疼痛均有不同程度的抑制作用。提示BFA作為口服制劑用于抗炎及鎮(zhèn)痛是有效的。

自從BFA問(wèn)世以來(lái)，許多學(xué)者對(duì)其安全性進(jìn)行了全面的研究。通過(guò)對(duì)BFA急性毒性試驗(yàn)、慢性毒性試驗(yàn)、三致試驗(yàn)以及BFA對(duì)動(dòng)物血象、肝、腎功能等方面的影響的研究，發(fā)現(xiàn)BFA毒副作用極小，具有較好的安全性［13－14］。這是BFA作為口服制劑的一個(gè)必要條件，也是BFA可用于預(yù)防給藥的一個(gè)基礎(chǔ)。相信在深入研究的基礎(chǔ)上，有望開(kāi)發(fā)出BFA類(lèi)抗炎鎮(zhèn)痛的口服新藥。

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