肉牛黃體期和卵泡期陰道菌群結(jié)構(gòu)的比較研究

劉暢，王軍，劉紅羽，呂文發(fā)

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林長春130118）

肉牛黃體期和卵泡期陰道菌群結(jié)構(gòu)的比較研究

劉暢，王軍，劉紅羽，呂文發(fā)

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林長春130118）

為了研究生殖激素對陰道菌群的影響，選取7頭健康肉牛，分別采集黃體期和卵泡期陰道分泌物，提取細(xì)菌總DNA，根據(jù)DGGE克隆測序結(jié)果，選擇5種特異性細(xì)菌，利用熒光定量PCR技術(shù)檢測各細(xì)菌數(shù)量。結(jié)果表明，總菌、大腸桿菌、鞘氨醇單胞菌和睡眠嗜血桿菌菌群數(shù)量在兩組間無顯著差異（P＞0.05），但黃體期鏈球菌屬數(shù)量顯著高于卵泡期（P＜0.01），卵泡期乳桿菌屬數(shù)量顯著高于黃體期（P＜0.05）。結(jié)果提示，肉牛黃體期與卵泡期的陰道菌群結(jié)構(gòu)存在顯著差異。

肉牛；黃體期和卵泡期；陰道；Real-time PCR；菌群

機(jī)體生殖道菌群是一個(gè)復(fù)雜的微生態(tài)系統(tǒng)，由于細(xì)菌培養(yǎng)手段的局限性，傳統(tǒng)細(xì)菌分離鑒定方法使得我們對其結(jié)構(gòu)知之甚少。利用傳統(tǒng)細(xì)菌分離方法研究發(fā)現(xiàn)，牛陰道內(nèi)菌群主要由鏈球菌屬、葡萄球菌屬、腸桿菌屬和乳桿菌屬組成［1-2］，對人和某些哺乳動(dòng)物陰道菌群進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)乳桿菌屬是主要組成成分，乳桿菌屬可以保護(hù)機(jī)體免受病原菌侵入［3-4］。

Cowley等對發(fā)情周期不同階段小鼠陰道菌群的研究發(fā)現(xiàn)，處于卵泡期小鼠陰道細(xì)菌數(shù)量較黃體期多［5］；而Koiter等卻發(fā)現(xiàn)小鼠黃體期陰道細(xì)菌數(shù)量高于卵泡期［6］。上述結(jié)果提示，不同生理時(shí)期生殖激素對陰道菌群有影響。前期本實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用PCR-DGGE技術(shù)檢測出黃體期與卵泡期肉牛陰道細(xì)菌有：氣球菌、綠色氣球菌、睡眠嗜血桿菌、多動(dòng)物鏈球菌、嗜冷桿菌、大腸桿菌、鞘氨醇單胞菌，但不能準(zhǔn)確判斷細(xì)菌數(shù)量上的差異。根據(jù)前期試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)不同細(xì)菌特異性引物，應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)對健康肉牛黃體期和卵泡期陰道菌群進(jìn)行定量分析，比較不同生理時(shí)期肉牛陰道菌群差異，為進(jìn)一步開發(fā)微生態(tài)制劑奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1主要試劑QIAamp DNA MiniKit、膠回收試劑盒，購自QIAGEN公司；DL-2 000 Marker、TaqDNA聚合酶、pMD18-T質(zhì)粒、SYBR@GreenIPremix-ExTaqTM等，均購自TaKaRa公司；Primer synthesis、50×TAE緩沖液，購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒，購自Axygen公司。

1.2基因組DNA提取選取15頭西門塔爾雜交肉牛開展同期發(fā)情，篩選7頭母牛，分別采集黃體期（L1-L7）和卵泡期（F1-F7）陰道樣品，采用QIAamp DNA Mini Kit試劑盒［7-8］按說明書提取細(xì)菌基因組DNA。應(yīng)用NanDrop 2 000檢測濃度，對每個(gè)樣品進(jìn)行不同濃度的稀釋，最終達(dá)到20 mg/L。

1.3引物的設(shè)計(jì)與合成總菌及5種菌屬特異性引物根據(jù)PCR-DGGE及16S rDNA基因序列設(shè)計(jì)。將6對引物用BLAST軟件進(jìn)行在線核實(shí)其特異性后由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。引物序列見表1。

表1熒光定量PCR特異性引物

1.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作檢測各個(gè)特異性引物最佳反應(yīng)條件，之后將各標(biāo)準(zhǔn)菌株P(guān)CR產(chǎn)物切膠、回收后所得的產(chǎn)物進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化，將陽性菌液提取的質(zhì)粒作為熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)品，測定OD值及濃度，換算為各標(biāo)準(zhǔn)品1 μL的拷貝數(shù)，用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5待測樣品定量分析采用兩步法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將待測肉牛黃體期與卵泡期樣品提取的DNA分別進(jìn)行總菌及5種細(xì)菌16S rDNA熒光定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系20 μL：SYBR GreenⅠ10 μL，上下游引物（10 mmol/L）各0.8 μL，ROX Reference DyeⅡ0.4 μL，DNA模板2 μL，補(bǔ)ddH2O至20 μL；反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 min，不同退火（如表1）溫度復(fù)性34 s，40個(gè)循環(huán)；95℃15 s，60℃1 min，95℃15 s，1個(gè)循環(huán)。每次試驗(yàn)同時(shí)設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品校正和ddH2O代替DNA模板的陰性對照，每個(gè)樣品均同時(shí)做3個(gè)平行復(fù)孔。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS18.0軟件對熒光定量結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩個(gè)樣本均數(shù)的比較根據(jù)正態(tài)分布檢驗(yàn)結(jié)果采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2結(jié)果

2.1定量曲線結(jié)果根據(jù)熒光定量PCR擴(kuò)增結(jié)果，總菌及5種特異性菌標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)（R2）均大于0.98，斜率在-3～-3.5之間；通過溶解曲線，確定了總菌、鏈球菌屬、大腸桿菌、鞘氨醇單胞菌、睡眠嗜血桿菌和乳桿菌屬的Tm值分別在85.01℃、84.4℃、82.17℃、83.22℃、80.98℃和86.8℃左右。2.2特異菌群定量檢測結(jié)果不同生理時(shí)期陰道細(xì)菌結(jié)果如表2所示，用lg copies表示。結(jié)果顯示，黃體期肉牛陰道內(nèi)鏈球菌屬數(shù)量極顯著高于卵泡期（P＜0.01），而卵泡期肉牛陰道內(nèi)乳桿菌屬的數(shù)量顯著高于黃體期（P＜.05），其他細(xì)菌，兩組間差異不顯著（P＞0.05）。

表2不同生理時(shí)期細(xì)菌定量檢測結(jié)果

3討論

生殖道菌群對生殖道健康起重要作用，本試驗(yàn)應(yīng)用Real-time PCR檢測健康肉牛陰道菌群結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)生殖激素對陰道菌群有影響。前期利用DGGE技術(shù)研究了肉牛黃體期和卵泡期陰道菌群結(jié)構(gòu)，研究并未發(fā)現(xiàn)乳桿菌屬，但基于DGGE技術(shù)不能檢測低于1%的菌及乳桿菌屬的重要價(jià)值，本研究利用Real-time PCR測定了乳桿菌數(shù)量，研究發(fā)現(xiàn)，牛陰道中確實(shí)存在乳桿菌，但數(shù)量低于1%，且顯著低于哺乳動(dòng)物陰道乳桿菌所占比例，結(jié)果與Rodriguez等對奶牛和肉牛黃體期陰道乳

斑點(diǎn)熱（spotted fever）是由斑點(diǎn)熱群立克次體（Spotted fever group rickettsia，SFGR）所引起的一組疾病的總稱。SFGR為專性細(xì)胞內(nèi)寄生，是人獸共患的一大類自然疫源性疾病。蜱作為保菌宿主，SFGR在蜱種維持著持久的感染循環(huán)，可經(jīng)卵垂直傳遞立克次體以保持其種群的連續(xù)性。近年來，世界范圍內(nèi)新發(fā)及再發(fā)立克次體并逐年上升［2］。從病原學(xué)和WHO立克次體研究中心證實(shí)我國至少存在3種斑點(diǎn)熱立克次體，而從病人分離出病原體以及從基因檢測證據(jù)表明，我國至少存在10桿菌屬的分離相一致［13］。黃體期總菌數(shù)量比卵泡期多，但差異不顯著；黃體期鏈球菌屬數(shù)量極顯著高于卵泡期，這與H.M.COWLEY［5］研究小鼠陰道總菌及鏈球菌屬數(shù)量黃體期比卵泡期少相反，這種結(jié)果的差異可能是由于試驗(yàn)動(dòng)物和研究方法不同導(dǎo)致的?；谝陨?，提示發(fā)情周期不同階段陰道菌群存在變化并與生殖激素的分泌密切相關(guān)，但具體機(jī)制尚不清楚還有待于進(jìn)一步研究。

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Comparison of vaginal micro flora structureof beef cattlebetween luteal and follicular phase

LIU Chang，WANG Jun，LIU Hong-yu，LV Wen-fa
（College of Animal Science and Technology，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China）

In order to investigate the effect of hormones on the vaginal flora，vaginal swab samples from seven cattle were collected during the luteal and follicular phase.Total bacterial DNA was extracted for real-time PCR.Following the DGGE cloned results，five specific bacteria species were selected.The real-time PCR was used to measure the quantity of the vaginal flora between the luteal and follicular phase，respectively.The results indicated that there was no significant difference between the luteal phase and follicular phase in total bacteria species，Escherichia coli，Sphingomonas and Haemophilus somnus（P＞0.05）.However，the Streptococcus number was significantly higher in the luteal phase than that in follicular phase（P＜0.01）.Conversely，follicular phase Lactobacillus was significantly higher than that in the luteal phase（P＜0.05）.The current results suggest that beef cattle micro flora structure differs significantly during the luteal phase and the follicular phase.

beef；luteal and follicular phase；vaginal；Rea-time PCR；flora

LV Wen-fa

S814.8

A

0529-6005（2016）08-0016-02

2015-12-31

吉林省現(xiàn)代肉牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（201534）；吉林省重大科技攻關(guān)專項(xiàng)（20140203016NY）；吉林省發(fā)改委產(chǎn)業(yè)技術(shù)研發(fā)專項(xiàng)（2013779）；國家自然科學(xué)基金（31172227）

劉暢（1990-），女，碩士，從事動(dòng)物遺傳育種與繁殖研究，E-mail：398950510@qq.com

呂文發(fā)，E-mail：wenfa2004@163.com