MRL/lpr狼瘡虛熱證小鼠模型的建立與評價

姚曉霞　田文慧　李飛艷　袁　強?

MRL/lpr狼瘡虛熱證小鼠模型的建立與評價

姚曉霞田文慧李飛艷袁強?

目的 探討建立MRL/lpr狼瘡虛熱證小鼠模型的方法。方法 取MRL/lpr狼瘡小鼠隨機分為兩組，模型組給予長時間灌胃附子、肉桂、干姜（1∶1∶1）水煎液，空白對照組灌胃同次數(shù)等量生理鹽水，造模結(jié)束后，檢測MRL/lpr狼瘡小鼠血清中T3、T4、E2、T、COR的變化。結(jié)果 造模結(jié)束后，模型組MRL/lpr狼瘡小鼠血清中T3、T4、E2、COR的含量均高于空白對照組，T的含量低于空白對照組，出現(xiàn)中醫(yī)虛熱證的臨床表現(xiàn)。結(jié)論 利用溫熱中藥水煎劑灌胃造模復(fù)制MRL/lpr狼瘡虛熱證小鼠模型的方法是可行的。

虛熱證 MRL/lpr狼瘡小鼠 模型

虛熱證動物模型是中醫(yī)證候動物模型中研究較多的一種。虛熱證以陰液虧虛，虛熱內(nèi)生為主［1］。梁月華等［2］根據(jù)中醫(yī)理論探索給大鼠長期大量服用溫熱藥復(fù)制虛熱證動物模型，并在此基礎(chǔ)上，進行大量基礎(chǔ)研究［2-4］，結(jié)果顯示溫熱藥有提高交感神經(jīng)-腎上腺系統(tǒng)機能的作用。系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）是一種全身性自身免疫性疾病，活動期約99%的患者在病程過程中出現(xiàn)各種熱型的發(fā)熱，其臨床表現(xiàn)與伏氣溫病“邪伏陰分、陰虛化熱”的病機相合，屬陰虛型發(fā)熱。2014年4月至5月作者在MRL/lpr狼瘡小鼠陰虛發(fā)熱的基礎(chǔ)上采用溫熱中藥造模，探討虛熱證對神經(jīng)-內(nèi)分泌系統(tǒng)的影響。

1　材料與方法

1.1動物 清潔級雌性MRL/lpr小鼠20只，體重27～31g，購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司。實驗于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心實驗室。

1.2藥品與試劑 附子，肉桂，干姜均購自浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片廠，經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院宋捷民教授鑒定。小鼠三碘甲狀腺原氨酸（T3）ELISA試劑盒，小鼠甲狀腺素（T4）ELISA試劑盒，小鼠雌二醇（E2）ELISA試劑盒，小鼠睪酮（T）ELISA試劑盒，大鼠皮質(zhì)醇（COR）ELISA試劑盒均購自上海信帆生物科技有限公司。

1.3儀器 80-2B型離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠；Power wave 340型酶標儀，美國BioTek儀器有限公司；HH-S型水浴鍋，鞏義市英峪予華儀器廠；DL-1型電子體溫計，江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司。

1.4方法 （1）造模方法：將小鼠隨機分為空白對照組和模型組，每組各10只，適應(yīng)性飼養(yǎng)3d后，均無異常表現(xiàn)即納入實驗。模型組中附子、肉桂、干姜以1∶1∶1比例，常規(guī)制成200%濃度水煎劑（附子先煎），灌胃1.6ml/（100g·d），連續(xù)給藥28d。空白對照組灌胃同次數(shù)等量生理鹽水。（2）指標檢測方法：體溫為肛溫。飲水和進食量以組為單位，計量給飼料和飲水，過若干天后減去剩余量，再平均為這段時間本組每只動物每天飲水量和進食量。于造模結(jié)束后采眼眶血0.3ml，分離血清，用ELISA試劑盒檢測小鼠血清中T3、T4、E2、T、COR。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件。計量數(shù)據(jù)以（x±s）表示，采用方差分析及t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1一般狀態(tài)觀察 實驗過程中，空白對照組整體外觀良好，毛色干凈，反應(yīng)靈敏。模型組MRL/lpr狼瘡小鼠脫毛現(xiàn)象嚴重，較狂躁，灌胃時掙扎明顯，腋下淋巴結(jié)腫大較空白組明顯，受激排便較空白對照組增多，且舌象較空白對照組偏紅。

2.2MRL/lpr狼瘡小鼠體重、體溫的變化 空白對照組和模型組MRL/lpr狼瘡小鼠在實驗前體重和體溫無明顯差異，實驗過程中，空白對照組體重增長較快，模型組體重下降，空白對照組小鼠體重明顯高于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；造模結(jié)束時，模型組體溫明顯高于空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)有意義（P＜0.01）。見表1、表2。

3　討論

中醫(yī)證候動物模型是現(xiàn)代中醫(yī)動物實驗的代表，其在受試動物身上體現(xiàn)中醫(yī)理論和證候特點。虛熱證是中醫(yī)證候動物模型中研究較多的一種，關(guān)于虛熱證造模的方法研究較多，主要分為中藥水煎劑灌胃造模、注射致熱物質(zhì)造模、形勞傷陰造模、氣候造模等。本實驗選用的中藥水煎劑灌胃造模，是目前較常用的中醫(yī)虛熱證造模方法，造模后動物不僅有熱證表現(xiàn)，且有一定的虛證表現(xiàn)。通過多次溫熱藥復(fù)方進行虛熱證預(yù)試造模后，本實驗最終選用陳氏復(fù)方，采用附子、肉桂、干姜水煎液按1∶1∶1比例灌胃給藥，確定灌胃給藥劑量及造模時間。

造模結(jié)束后，驗證虛熱證模型是否成功是很重要的。在中醫(yī)辨證論治的基礎(chǔ)上，從不同層面不同角度對虛熱證模型進行探討，才能準確的反映虛熱證的本質(zhì)。客觀上的中醫(yī)指標主要有毛色、外觀、大小便、舌象、體溫、體重、飲水量、進食量等，這些指標體現(xiàn)了中醫(yī)的整體觀，為虛熱證提供了一定的依據(jù)，但其不足之處是在觀測過程中容易受人為因素和實驗條件的影響。本實驗進一步通過相關(guān)血液生化指標T3、T4、E2、T、COR的檢測，分析相關(guān)指標的含量變化，進一步說明該造模方法的可靠性。

虛熱證是在“虛證”的基礎(chǔ)上，又有“熱證”的表現(xiàn)，主要表現(xiàn)為形體消瘦、口燥咽干、發(fā)熱、舌紅等癥狀［5］。造模結(jié)束時，與空白對照組比較，模型組小鼠長期大量灌胃溫熱中藥附子、干姜、肉桂后出現(xiàn)脫毛現(xiàn)象嚴重，較狂躁，舌象偏紅，體重降低，飲水量增加，進食量減少等現(xiàn)象。此外，模型組體溫較空白對照組明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，以上結(jié)果均與虛熱證的臨床表現(xiàn)相符。

有研究表明［6］，虛熱證時內(nèi)分泌變化以甲狀腺功能變化為主，主要表現(xiàn)為甲狀腺功能亢進，并提示血清T3、T4含量的變化可以作為中醫(yī)虛熱證的有效指標。甲狀腺激素T3、T4主要調(diào)節(jié)物質(zhì)代謝，能促進體內(nèi)絕大多數(shù)組織細胞內(nèi)的物質(zhì)代謝氧化，提高耗氧率，增加產(chǎn)熱，使基礎(chǔ)代謝增高，體溫升高。陳群等［7］臨床觀察血清甲狀腺激素與中醫(yī)實熱證、虛熱證的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)虛熱證組患者的T3、T4水平均明顯高于正常對照組。徐志偉等［8］研究發(fā)現(xiàn)，虛熱證造模大鼠血清中T3、T4水平顯著升高。崔淑蘭等［9］研究結(jié)果表明，模型對照組大鼠血漿T3、T4明顯高于空白對照組。本實驗結(jié)果顯示，造模結(jié)束后，模型組MRL/ lpr狼瘡小鼠血清中T3、T4的含量均高于空白對照組，這與相關(guān)文獻報道一致。本實驗結(jié)果表明，與空白對照組相比，模型組小鼠血清中E2、COR含量升高，T含量降低。模型組小鼠COR、E2升高，T降低，這主要表現(xiàn)為下丘腦-垂體-性腺軸或下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸失調(diào)致使E2在體內(nèi)增多，通過負反饋抑制腺垂體的分泌功能，從而影響下丘腦-垂體-性腺軸或下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸的功能，致使T相對不足［10］。

綜上所述，MRL/lpr狼瘡小鼠長期大量灌胃溫熱中藥附子、干姜和肉桂，可出現(xiàn)與中醫(yī)虛熱證患者相一致的表現(xiàn)癥狀，表明該方法可以成功的復(fù)制MRL/ lpr狼瘡虛熱證小鼠模型。

［1］ 粱月華.寒熱本質(zhì)研究進展.中醫(yī)雜志，1996，37（12）:747-750.

［2］ 梁月華，王晶，謝竹藩.寒涼藥與溫熱藥對交感神經(jīng)腎上腺及代謝機能的影響.北京大學(xué)學(xué)報，1987，19（1）:54-57.

［3］ 楊勇，梁月華，汪長中，等.虛寒、虛熱證大鼠神經(jīng)、內(nèi)分泌、免疫與血液流變學(xué)的時相性研究.中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2002，8（2）:109-112.

［4］ 李良，劉國貞，梁月華.寒涼和溫熱藥對大鼠腦、垂體和腎上腺內(nèi)5-羥色胺及去甲腎上腺素神經(jīng)元和纖維的影響.中國中藥雜志，1999，24（6）:360-365.

［5］ 韓冰冰，王世軍.比較虛寒證與虛熱證模型大鼠肝全基因表達譜的差異.北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2011，34（10）:673-675.

［6］ 徐志偉，陳群，孫琪，等.中醫(yī)熱證實質(zhì)研究.中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2009，19（3）:53-56.

［7］ 陳群，徐志偉，劉亞梅.實熱證、虛熱證患者血清甲狀腺激素和促甲狀腺激素水平的對比研究.廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2003，20（3）:184-186.

［8］ 徐志偉，陳群，劉亞梅，等.實熱證、虛熱證造模大鼠甲狀腺超微結(jié)構(gòu)和功能變化的聯(lián)系.中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2001，7（3）:23-26.

［9］ 崔淑蘭，趙儉，王世軍.知母對虛熱模型大鼠血漿T3、T4含量的影響.河南中醫(yī)，2014，34（10）:1897-1898.

［10］ 李連珍，劉小青，崔一然，等.辛熱示例藥對正常大鼠基礎(chǔ)代謝及內(nèi)分泌系統(tǒng)的影響.中國中醫(yī)藥信息雜志，2011，18（3）:49-51.

Objectives This project established defi ciency-heat syndrome model in MRL/lpr lupus mouse. Methods MRL/lpr lupus mouse were randomly divided into two groups：in model group the mouse were given the decoction of three Chinese medicines，aconite，cinnamon and dried ginger by gavage for a long time，and in blank control group the mouse were given the same times and equivalent normal saline by gavage.Then detected the change of T3、T4、E2、T、COR in MRL/lpr lupus mouse serum. Results After modeling，T3、T4、E2、COR of model group mouse wwere higher than blank control group，and T of model group mouse was lower than blank control group. The MRL/lpr lupus mouse had the clinical manifestations of defi ciency-heat syndrome. Conclusions Using warm-heat TCM decoction to establish the defi ciency-heat syndrome model of MRL/ lpr lupus mouse is feasible.

Defi ciency-heat syndrome MRL/lpr lupus mouse Model

國家自然科學(xué)基金面上項目（81173570）

310053 浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院*通信作者

表1造模藥物對MRL/lpr狼瘡小鼠體重的影響［ g，（x±s）］

注：與空白對照組比較，#P＜0.01

組別n0d7d14d21d28d模型組1029.2±1.5729.6±2.3128.9±1.9127.7±1.79#27.6±1.63#空白對照組1029.3±1.6029.5±1.7530.0±2.8831.3±1.8332.5±1.56

表2造模藥物對MRL/lpr狼瘡小鼠體溫的影響［℃，（x±s）］

注：與空白對照組比較，*P＜0.05，#P＜0.01

組別n0d7d14d21d28d模型組1036.6±0.9837.6±0.6038.1±0.55*38.0±0.46* 38.5±0.56#空白對照組1036.3±0.8036.9±0.9536.3±0.3737.4±0.4237.3±0.43

2.3MRL/lpr狼瘡小鼠進食量、飲水量的變化 實驗前MRL/lpr狼瘡小鼠進食量差異無統(tǒng)計學(xué)意義，實驗過程中空白對照組和模型組均有減少趨勢，且模型組下降明顯。實驗前MRL/lpr狼瘡小鼠飲水量差異無統(tǒng)計學(xué)意義，實驗過程中模型組飲水量明顯增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.4造模后MRL/lpr狼瘡小鼠血清T3、T4含量的變化 模型組MRL/lpr狼瘡小鼠T3、T4含量均明顯高于空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見表3。

表3造模藥物對MRL/lpr狼瘡小鼠血清T3、T4含量的變化（x±s）

注：與空白對照組比較，#P＜0.01

組別nT3（pmol/L）T4（μg/L）模型組106.53±2.57#86.70±23.41#空白對照組104.82±1.2358.29±11.40

2.5造模后MRL/lpr狼瘡小鼠血清E2、T、COR含量的變化 與空白對照組比較，模型組MRL/lpr狼瘡小鼠血清E2含量升高，T含量降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），COR的含量升高，但與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表4。

表4造模藥物對MRL/lpr狼瘡小鼠血清E2、T、COR含量的變化（x±s）

注：與空白對照組比較，#P＜0.01

組別nE2（μg/L）T（nmol/L）COR（μg/L）模型組1072.87±20.54#99.65±23.17#99.78±15.59空白對照組1053.53±15.36125.52±17.5089.72±17.53