綠原酸等四種物質(zhì)采用不同進樣方法制訂HPLC標準曲線的比較

焦興蘋 昝珂 過立農(nóng)++鄭健 馬雙成

【摘要】目的：比較高效液相色譜法制作標準曲線時，對照品稀釋法和不同進樣量法的異同。方法：采用高效液相色譜法，以綠原酸、連翹酯苷B、毛蕊花糖苷和木犀草苷對照品作為研究對象，采用對照品稀釋法和進樣不同體積法，測定峰面積，計算標準曲線。結(jié)果：木犀草苷兩種方法結(jié)果線性關(guān)系良好，而綠原酸、連翹酯苷B、毛蕊花糖苷僅稀釋法線性關(guān)系良好。結(jié)論：建議采用稀釋法測定標準曲線，不同進樣量法需慎重。

【關(guān)鍵詞】高效液相色譜法；線性；對照品稀釋法；不同進樣量法

【中圖分類號】R9141【文獻標志碼】 A【文章編號】1007-8517（2016）18-0013-04

[JP2]在建立藥品質(zhì)量標準時，分析方法需經(jīng)驗證；在藥品生產(chǎn)工藝變更、制劑的組分變更、原分析方法進行修訂時，質(zhì)量標準分析方法也需進行驗證。線性是藥品質(zhì)量標準分析方法驗證的必需項目之一[1]。在建立中藥含量測定方法時，高效液相色譜法是最常采用的方法。常用的標準曲線制作方法有兩種，一是配置一系列濃度的標準物質(zhì)，以峰面積對被測物質(zhì)濃度進行線性擬合[2-8]；另外一種方法是同一對照品溶液，進樣不同體積，以峰面積對被測物質(zhì)進樣量（μg）進行線性回歸計算[9-15]。本研究采用綠原酸（1）、連翹酯苷B（2）、毛蕊花糖苷（3）、木犀草苷（4）四個對照品（結(jié)構(gòu)式見圖1）按上述兩種線性制作方法進行試驗，比較二者的異同。結(jié)果顯示，4個對照品溶液按照對照品稀釋法試驗，線性關(guān)系均良好；采用不同進樣量法試驗，僅木犀草苷線性關(guān)系良好，綠原酸、連翹酯苷B、毛蕊花糖苷三個化合物隨進樣量增大，峰面積響應(yīng)值偏低，線性關(guān)系呈類拋物線型。[JP]

1儀器與材料

11儀器安捷倫1260型高效液相色譜儀（二極管陣列檢測器，二元泵，自動進樣器，脫氣機）；MSA125P型電子天平（賽多利斯）。

[JP2]12材料綠原酸對照品（批號：[KG-*3/5]110753-201314）、連翹酯苷B（批號：[KG-*3/5]111811-201102）、木犀草苷（批號：[KG-*3/5]111720-201408）購自中國食品藥品檢定研究院；毛蕊花糖苷（批號：[KG-*3/5]M-011-150318北京中科質(zhì)檢生物技術(shù)有限公司）。磷酸（批號20140305，國藥集團化學(xué)試劑有限公司），甲醇和乙腈為色譜純（Fisher公司），水為Milli-Q超純水。[JP]

2方法和結(jié)果

21色譜條件色譜柱：Waters XSelect HSS T3（46mm×250mm，5μm）；流動相：乙腈-05%磷酸溶液 （18∶[KG-*3/5]82）；流速：10mL/min；柱溫：25℃；檢測波長：332nm。

22對照品溶液的配制分別取綠原酸、連翹酯苷B、毛蕊花糖苷和木犀草苷對照品約10mg，精密稱定，分別置于10mL棕色量瓶中，以乙腈溶解并定容至10mL，即得各對照品儲備液。分別吸取上述儲備液01、02、03、05、08mL分別置于25mL容量瓶中，用流動相稀釋至25mL，用045μm濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得對照品溶液濃度分別約為4、8、12、20、32μg/mL。

23不同進樣量法試驗精密吸取22項下對照品混合溶液（20μg/mL），分別進樣1、 2、 5、 10 、15μL，記錄峰面積。以峰面積（Y）為縱坐標，以相應(yīng)進樣量（X）為橫坐標，繪制標準曲線，結(jié)果見表1，線性圖見圖2。

結(jié)果表明，不同進樣量法測定的木犀草苷線性關(guān)系良好，而綠原酸、連翹酯苷B和毛蕊花糖苷三個成分隨進樣量增大，響應(yīng)值沒有線性增加，呈類拋物線型。

23對照品稀釋法測定線性分別精密吸取上述22項下一系列濃度的對照品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，按21項下色譜條件測定，以各對照品進樣量（μg）為X軸，以峰面積積分值為Y軸，進行線性回歸，各對照品回歸方程和線性范圍見表2，線性圖見圖3。

結(jié)果表明，采用對照品稀釋法，所測四個成分線性關(guān)系均良好。

3結(jié)果與討論

本實驗采用高效液相色譜法，以綠原酸、連翹酯苷B、毛蕊花糖苷以及木犀草苷四個對照品為研究對象，通過對照品稀釋法和進樣不同體積法對質(zhì)量標準分析方法驗證中的線性進行試驗。結(jié)果表明，采用對照品稀釋法，四個化合物的線性關(guān)系均良好，采用進樣不同體積法僅木犀草苷的線性關(guān)系良好，而綠原酸、連翹酯苷B和毛蕊花糖苷三個成分隨進樣量增大，峰面積響應(yīng)值沒有線性增加，呈類拋物線型。其原因可能是流動相中加入了磷酸溶液，對照品溶液為甲醇配制，隨著進樣量增大，注入的不同體積的對照品溶液對流動相的pH值造成了波動。

綠原酸、連翹酯苷B和毛蕊花糖苷結(jié)構(gòu)中均含有咖啡酸酯類，在含水量較高的流動相中容易產(chǎn)生電離，使色譜峰拖尾變寬，加入磷酸等酸性抑制劑抑制了此類化合物的電離，改善色譜峰的峰形。流動相不同pH值對化合物的峰形具有顯著影響，導(dǎo)致峰面積不完全成線性關(guān)系[16]。而進樣相同體積不同濃度的對照品溶液對流動相pH值的影響是一致的，峰面積和濃度呈線性關(guān)系。

由于本實驗儀器是采用自動進樣，木犀草苷的線性均良好，表明進樣器準確性和性能良好。實驗選用的進樣量范圍1～15μL為常用進樣量范圍，進樣體積并不過大。由于不同進樣量法較為簡便，課題組先采用不同進樣量法進行線性試驗，重復(fù)3次，結(jié)果均與本文報道一致，綠原酸、連翹酯苷B和毛蕊花糖苷3個化合物線性不佳，后改用稀釋法進行試驗，線性良好。

因此，進行中藥質(zhì)量標準驗證時，標準曲線的制備一般應(yīng)采用稀釋法進行，慎重使用不同進樣體積法。

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（編輯：梁志慶）