白樺BpCesA基因的生物信息學(xué)及表達(dá)分析

申婷婷 姜 靜 劉桂豐 許思佳 李慧玉* 袁紅梅,2

(1.東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150040； 2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所，哈爾濱 150086)

白樺BpCesA基因的生物信息學(xué)及表達(dá)分析

申婷婷1姜 靜1劉桂豐1許思佳1李慧玉1*袁紅梅1,2

(1.東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150040；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所，哈爾濱 150086)

從白樺45個(gè)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中分析獲得6條白樺纖維素合成酶基因，其中2條為該家族的新基因，通過(guò)生物信息學(xué)及實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)探討白樺BpCesA在不同材性白樺中的表達(dá)量情況。結(jié)果表明，6條白樺BpCesA基因的ORF長(zhǎng)度在2 958～3 312 bp，編碼的氨基酸數(shù)目在985～1 103 aa，相對(duì)分子量在110.40～124.29 kD，理論等電點(diǎn)為5.90～7.43；6條BpCesA均含有D,D,D,QXXRW保守結(jié)構(gòu)域和8個(gè)跨膜螺旋，其中2個(gè)位于N端，6個(gè)位于C端。對(duì)來(lái)自6個(gè)雙子葉植物，4個(gè)單子葉植物和1個(gè)裸子植物的52條CesA進(jìn)行了聚類分析發(fā)現(xiàn)：白樺BpCesA與同為木本的楊樹PtrCesA具有較高的同源性，其中BpCesA2與PtrCesA3同源性達(dá)到92%、另外BpCesA5與PtrCesA6、BpCesA1與PtrCesA8也具有較高的同源性，分別為89%和82%。BpCesA1、BpCesA2、BpCesA3、BpCesA5基因隨纖維素含量的增加，表達(dá)量也呈現(xiàn)增加趨勢(shì)，推測(cè)這些基因在白樺的纖維素合成中起到促進(jìn)的作用。本研究為揭示纖維素合成酶基因的功能分析提供了基礎(chǔ)。

白樺；纖維素；木質(zhì)素；生物信息學(xué)；表達(dá)量

白樺(BetulaplatyphyllaSuk.)屬樺木科(Betulaceae)樺木屬(Betula)，廣泛分布于我國(guó)東北、華北、西北、西南等14個(gè)省區(qū)。白樺形態(tài)優(yōu)美，樹皮光滑潔白，有較高的觀賞價(jià)值，適合作為城市綠化樹種[1]。20世紀(jì)90年代初白樺被列為國(guó)家科技攻關(guān)研究對(duì)象之一，目前白樺作為國(guó)家科技支撐計(jì)劃研究的樹種，我國(guó)已在其種源分析[2]、木材形成[3]、花發(fā)育調(diào)控[4]以及扦插繁殖等方面進(jìn)行了大量的研究工作，而日益成熟的生物技術(shù)也為這些研究提供了全新的思路。白樺的生長(zhǎng)速度較快，抗逆性和適應(yīng)性較強(qiáng)，纖維長(zhǎng)寬比為56.7，適合造紙使用[5]。在紙漿造紙中，木質(zhì)素被降解掉之后，留下纖維素，纖維素的長(zhǎng)度決定了紙張的硬度和彈性，纖維素越長(zhǎng)，紙張?jiān)接?，彈性也越好。?duì)白樺來(lái)說(shuō)，了解哪些基因與木材形成相關(guān)具有重大的意義和作用。

纖維素是由β-1,4糖苷鍵連接形成的不分支多糖，其重復(fù)結(jié)構(gòu)單位是纖維二糖，但是其合成機(jī)制卻非常復(fù)雜，涉及到多種酶。Pear等采用cDNA隨機(jī)測(cè)序和序列分析法，首次從棉花中克隆了編碼纖維素合成酶催化亞基的β-1,4糖苷轉(zhuǎn)移酶基因(CesA)。此后,在水稻、擬南芥、玉米、楊樹等更多的植物中分離克隆出CesA基因[6～7]。CesAs形成一個(gè)龐大的基因家族，家族內(nèi)的每個(gè)酶彼此相關(guān)，協(xié)同作用。同時(shí)，利用突變體研究已經(jīng)了解到CesA在纖維素合成中的作用及表達(dá)調(diào)控[8]。此外,在植物中還存在大量的纖維素合成酶相似蛋白，其功能還不清楚。

在前期研究中，以控制授粉獲得的49個(gè)白樺家系建立的6年生子代為材料，對(duì)其材性進(jìn)行了遺傳變異分析，并對(duì)這49個(gè)家系的紙漿材材性進(jìn)行評(píng)估。本研究從材性評(píng)價(jià)高、中、低的6個(gè)家系：0628、0655、0616、0617、0613、0630中各選取一個(gè)單株進(jìn)行無(wú)性繁殖，分別提取木質(zhì)部和韌皮部的總RNA，參考已知的楊樹的研究結(jié)果，選擇了6條與白樺纖維素合成相關(guān)的白樺基因，通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR分析這些基因在白樺木材形成中的作用，篩選直接參與木材形成的基因，為林木遺傳改良提供優(yōu)良的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

用于材性分析的白樺來(lái)自東北林業(yè)大學(xué)帽兒山實(shí)驗(yàn)林場(chǎng)6年生的白樺控制授粉子代，根據(jù)前期材性評(píng)估結(jié)果，分別從材性高、中、低的6個(gè)家系(0628、0655、0616、0617、0613、0630)中選擇一個(gè)單株(材性高：5、6；材性中：3、4；材性低：1、2)，取同一方向的一級(jí)側(cè)枝進(jìn)行材性測(cè)定。

實(shí)時(shí)定量PCR分析的試驗(yàn)材料為從上述6個(gè)單株上取的芽外植體消毒后，進(jìn)行無(wú)性擴(kuò)繁，生根苗在培養(yǎng)缽中生長(zhǎng)一年后，分別取其木質(zhì)部和韌皮部，經(jīng)過(guò)液氮速凍后，放入-80℃冰箱中備用。

1.2 材性測(cè)定方法

纖維長(zhǎng)度測(cè)定方法采用Taylor精確測(cè)定法[9～10]。用于測(cè)定相應(yīng)含量的試樣先研磨后過(guò)篩按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 26771-93處理。木質(zhì)素和纖維素含量按照ANKOM公司的A2000i型全自動(dòng)纖維分析儀進(jìn)行的測(cè)定，即濾袋法進(jìn)行測(cè)定。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行方差和多重比較分析。

1.4白樺纖維素合成酶基因的獲得及生物信息學(xué)分析

利用本團(tuán)隊(duì)已有的45個(gè)白樺的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，通過(guò)NCBI進(jìn)行比對(duì)搜索，篩選獲得6條纖維素合成相關(guān)基因：BpCesA1、BpCesA2、BpCesA3、BpCesA4、BpCesA5、BpCesA6。利用NCBI在線尋找程序(ORF founder)確定該基因的開放讀碼框；對(duì)蛋白質(zhì)的分子量和理論等電點(diǎn)進(jìn)行了在線計(jì)算(http://web.expasy.org/protparam/)；用BioEdit中的ClustalW進(jìn)行氨基酸的多序列比對(duì)；選取白樺、擬南芥和楊樹的CesA基因進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析；在NCBI和TAIR數(shù)據(jù)庫(kù)搜索已知的CesA蛋白質(zhì)序列，使用MEGA 5.1繪制系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，Bootstrap分析進(jìn)行1 000個(gè)重復(fù)，以默認(rèn)參數(shù)構(gòu)建鄰接樹(Neighbor-joining tree,NJ-tree)[11]，借助MEGA軟件完成作圖[12]。

1.5 實(shí)時(shí)定量熒光PCR分析

用植物總RNA提取試劑盒(離心柱型)提取總RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性。并使用TOYOBO的ReverTra Ace? qPCR RT Master Mix with gDNA Removerr試劑盒進(jìn)行cDNA合成。

根據(jù)6條BpCesA基因序列，利用primer5.0設(shè)計(jì)定量PCR引物，由博仕生物公司合成，引物序列見表1。18SrRNA為本研究中選擇的內(nèi)參基因。

將合成的第一鏈cDNA加去離子水稀釋10倍，作為模版，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為：SYBR? Premix ExTaqTMⅡ(2×)6 μL，引物各0.48 μL(10 μmol·L-1)，水3.6 μL，模板2 μL，Rox DyeⅡ 0.24 μL，反應(yīng)參數(shù)為：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火延伸34 s，循環(huán)40次，繪制熔解曲線，溫度由95℃ 15 s，60℃ 1 min，至95℃ 15 s止，所有試樣均進(jìn)行3次技術(shù)重復(fù)，反應(yīng)結(jié)束后，獲取數(shù)據(jù)并通過(guò)-△△Ct法進(jìn)行基因表達(dá)分析。

表1 實(shí)時(shí)定量PCR引物

2 結(jié)果與分析

2.1 優(yōu)良單株的材性分析

對(duì)6個(gè)白樺單株的纖維素的4個(gè)相關(guān)性狀進(jìn)行了方差分析，由表2可以看出，6個(gè)單株纖維素和綜纖維素含量方面的差異都達(dá)到了極顯著水平，半纖維素差異顯著，纖維長(zhǎng)寬比差異不顯著，進(jìn)一步進(jìn)行了多重比較(Duncan)(表3)。

表2白樺株系間生長(zhǎng)性狀方差分析

Table2VarianceanalysisofeachgrowthtraitofB.platyphyllastrains

性狀TraitdfMSF值FvalueSig值Sig．value纖維素Contentofcellulose(%)5403．043280．8570．000半纖維素Contentofhemicellulose(%)54．2723．8800．025綜纖維素Contentofholocellulose(%)5456．030208．2530．000纖維長(zhǎng)寬比Ratiooffiberlengthtowidth548．5150．8010．570

注：Sig.中0.000代表P>F0.01，差異極顯著。

Note：Sig.0.000 representativesP>F0.01，the difference was significant.

表3 白樺各株系纖維素相關(guān)性狀的多重比較結(jié)果

由表3可以看出，來(lái)自白樺材性優(yōu)良家系的單株5、6與分別來(lái)自材性中及差家系的單株3、4、2、1的纖維素及綜纖維素含量差異顯著，單株5、6的纖維素及綜纖維素含量顯著高于其他4個(gè)株系，分別比含量最低的1株系提高290%、282%和99%、88%。在半纖維素含量方面，單株5與其他5個(gè)單株的半纖維素含量差異顯著，較單株3的半纖維素含量提高了15%。

2.2 白樺纖維素合成酶基因的生物信息學(xué)分析2.2.1 白樺BpCesA基因的特性分析

利用本團(tuán)隊(duì)已有45個(gè)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，獲得白樺CesA家族共6條全長(zhǎng)基因，其中BpCesA1、BpCesA2、BpCesA3、BpCesA4與NCBI已提交的4條BpCesA基因相同，BpCesA5、BpCesA6為白樺纖維素合成酶基因家族的新基因。我們對(duì)白樺6個(gè)BpCesA基因的特性進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)：這6個(gè)基因ORF長(zhǎng)度范圍在2 958～3 312 bp，編碼的氨基酸數(shù)目在985～1 103 aa，相對(duì)分子質(zhì)量在110.40～124.29 kD，理論等電點(diǎn)的范圍在5.90～7.43。

表4 白樺BpCesA基因特性分析

圖1 白樺纖維素合成相關(guān)基因的氨基酸序列比對(duì) 藍(lán)色：D,D,D,QXXRW序列的結(jié)構(gòu)域；綠色：RING-finger domain；紅色：Zinc-finger motifsFig.1 Amino acid sequence alignment of B.platyphylla cellulose synthesis related genes Blue:Domain of D,D,D,QXXRW sequence; Green:RING-finger domain; Red:Zinc-finger motifs

2.2.2 白樺BpCesA基因的多序列比對(duì)

我們對(duì)這6條白樺BpCesA基因的氨基酸序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)白樺BpCesA均含有纖維素合成酶保守的結(jié)構(gòu)域：3個(gè)保守的天冬氨酸殘基和QXXRW motif，構(gòu)成含有D，D，D，QXXRW序列的保守結(jié)構(gòu)域(圖1)，研究發(fā)現(xiàn)該結(jié)構(gòu)域在細(xì)胞質(zhì)膜表面形成糖基轉(zhuǎn)移酶活性位點(diǎn)。通過(guò)軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)6個(gè)白樺BpCesA均含有8個(gè)跨膜螺旋，其中2個(gè)位于N端，6個(gè)位于C端。有研究表明，8個(gè)跨膜螺旋在D,D,D,QXXRW序列的結(jié)構(gòu)域處形成通道，將葡聚糖鏈分泌出去[13]。除此之外，在蛋白的N端還含有1個(gè)Zinc-finger motifs和RING-finger domain。Zinc-finger motifs包含4個(gè)保守的半胱氨酸殘基(X3CX2-4CX12-15CX2C)，而RING-finger domain含有一系列的保守的半胱氨酸殘基及組氨酸殘基(CX2CX9-39CX1-3HX2-3C/HX2CX4-48CX2C)(圖1)。它們分別具有DNA-binding特性和將2個(gè)鋅原子結(jié)合到N端的“cross-brace”上的作用[14]。

2.2.3 白樺纖維素合成相關(guān)基因的聚類分析

我們對(duì)來(lái)自6個(gè)雙子葉植物，4個(gè)單子葉植物和1個(gè)裸子植物的52條CesA進(jìn)行了聚類分析。有研究報(bào)道高等植物的纖維素合成酶基因共分為6類，這些基因參與植物的初生或次生細(xì)胞壁形成[15]，我們的研究結(jié)果與之一致，從圖2中可以看出：BpCesA1與PtrCesA1，BpCesA4與PtrCesA4、AtCesA4具有較高的同源性，同屬于一個(gè)亞類；BpCesA2與PtrCesA5、AtCesA3屬于一個(gè)亞類；BpCesA3與PtrCesA2、AtCesA7屬于一個(gè)亞類；BpCesA5與PtrCesA6屬于一個(gè)亞類；整體上看，白樺CesA與同為木本植物的楊樹CesA具有較高的同源性，其中BpCesA2與PtrCesA3同源性達(dá)到91%，另外BpCesA5與PtrCesA6、BpCesA1與PtrCesA8也具有較高的同源性，分別為89%和81%。

圖2 白樺BpCesA與其他植物CesA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹 Bp.白樺；At.擬南芥；Gh.棉花；Hv.大麥；Os.水稻；Pr.松樹；Ptr.楊樹；St.馬鈴薯；Ta.小麥；Ze.百日草；Zm.玉米Fig.2 Phylogenetic tree of B.platyphylla BpCesA with some other plants CesA sequence Bp.Betula platyphylla Suk; At.Arabidopsis thaliana; Gh.Gossipium hirsutum; Hv.Hordeum vulgare; Os.Oryza sativa; Pr.Pinus radiata; Ptr.Populus tremuloides; St.Solanum tuberosum; Ta.Triticum aestivum; Ze.Zinnia elegans; Zm.Zea mays

2.3 實(shí)時(shí)定量qRT-PCR分析

我們以材性不同的白樺為試材，通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)，研究這些纖維素及木質(zhì)素合成相關(guān)基因在白樺木材形成中的作用。

由圖3可以看出，在白樺的木質(zhì)部中，基因的表達(dá)量隨白樺材性的提高并未看到規(guī)律的變化。在白樺的韌皮部中，除單株5外，BpCesA1基因的表達(dá)量與白樺纖維素含量呈正相關(guān)，該基因在單株6中表達(dá)量最高。BpCesA2、BpCesA3及BpCesA5基因的表達(dá)趨勢(shì)與BpCesA1相似，除個(gè)別單株外，均呈現(xiàn)隨白樺纖維素含量提高，表達(dá)量上升的趨勢(shì)，3個(gè)基因在單株5中的表達(dá)量最高，分別比表達(dá)量最低的株系提高了。BpCesA4基因在單株1、2、3、4中的表達(dá)量呈現(xiàn)與纖維素含量負(fù)相關(guān)的趨勢(shì)，但在單株6表達(dá)量最高。BpCesA6基因的單株在表達(dá)量上呈現(xiàn)不規(guī)則變化，纖維素含量中等的單株4表達(dá)量最高。綜合材性及基因表達(dá)量分析的結(jié)果可以看出，隨著白樺纖維素及綜纖維素含量的提高，6個(gè)白樺纖維素合成相關(guān)基因的表達(dá)量發(fā)生變化，尤其BpCesA1、BpCesA2、BpCesA3及BpCesA5隨纖維素含量的增加，表達(dá)量也呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)，說(shuō)明這些基因在白樺的纖維素合成中起到促進(jìn)作用。

圖3 纖維素合成相關(guān)基因的表達(dá) A. BpCesA1；B. BpCesA2；C. BpCesA3；D. BpCesA4；E. BpCesA5；F. BpCesA6Fig.3 RNA expression level of cellulose synthesis related genes A. BpCesA1; B. BpCesA2; C. BpCesA3; D. BpCesA4; E. BpCesA5; F. BpCesA6

3 討論

纖維素合成酶為多基因家族,現(xiàn)在己知植物的纖維素合成酶基因家族包括很多成員，擬南芥基因組中含有10個(gè)CesA基因，楊樹中至少含有18個(gè)，玉米[16]中含有13個(gè)基因，水稻[17～18]至少11個(gè)基因[19]，我們從白樺中克隆出6個(gè)BpCesA基因。所有的白樺纖維素合成酶基因均含有保守的3個(gè)天冬氨酸殘基和8個(gè)跨膜螺旋。根據(jù)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)模型，3個(gè)天冬氨酸殘基位點(diǎn)接近，并且與QXXRW motif在質(zhì)膜表面形成活性位點(diǎn)。其中D1和D2殘基協(xié)助UDP結(jié)合，而D3為糖苷鏈延伸的催化位點(diǎn)[20]。也有研究將纖維素合成酶的保守結(jié)構(gòu)域分為A和B兩個(gè)區(qū)，其中2個(gè)天冬氨酸旋殘基位于A區(qū)，2個(gè)跨膜螺旋位于A區(qū)前面；而B區(qū)含有另外一個(gè)天冬氨酸殘基和6個(gè)跨膜螺旋[21]。在白樺纖維素合成酶N端的2個(gè)跨膜螺旋前面含有23氨基酸殘基(X3CX2CX12CX2C)，該區(qū)域?yàn)镈NA-binding位點(diǎn)。

不同纖維素合成酶參與不同細(xì)胞細(xì)胞壁的纖維素合成[22～26]。研究表明AtCesA1、AtCesA3、AtCesA6及其同源基因參與初生細(xì)胞壁中纖維素合成[27]；AtCesA4、AtCesA7、AtCesA8及其同源基因參與次生細(xì)胞壁中纖維素合成。由此可以推測(cè)，BpCesA2和BpCesA6可能參與初生細(xì)胞壁中纖維素合成；而BpCesA1、BpCesA3和BpCesA4可能在次生細(xì)胞壁中纖維素合成中起作用。研究發(fā)現(xiàn)纖維素合成酶基因具有組織特異性。AtCesA2、AtCesA5和AtCesA9在種子上表皮細(xì)胞的細(xì)胞壁中表達(dá)；水稻OsCesA5/OsCesA6與OsCesA3形成復(fù)合體，在胚芽和胚根中表達(dá)[28]；AtCesA1、AtCesA3、與AtCesA6在子葉的下胚軸中表達(dá)。AtCesA4/AtCesA7和AtCesA8相互作用形成復(fù)合體，在木質(zhì)部細(xì)胞中表達(dá)[29]。對(duì)2到12個(gè)月大的輻射松植株的莖進(jìn)行原位雜交發(fā)現(xiàn)PrCesA10在次生木質(zhì)部中表達(dá)，參與次生細(xì)胞壁的形成。與BpCesA3高度同源的PtrCesA1和PtrCesA2參與次生細(xì)胞壁的合成，且PtrCesA1在木質(zhì)部特異表達(dá)并參與應(yīng)拉脅迫應(yīng)答[30]。在本研究中，我們選取了材性不同的單株無(wú)性系，研究BpCesA基因在木質(zhì)部和韌皮部中的表達(dá)情況，可以看到在白樺韌皮部中，BpCesA3基因隨著纖維素含量的增加，其表達(dá)量也是逐漸增加。BpCesA1、BpCesA2、BpCesA4及BpCesA5基因在纖維素最高的植株中表達(dá)量也是最高，尤其是BpCesA1。說(shuō)明這些基因可能參與纖維素合成。其深層的分子調(diào)控機(jī)制及基因間的協(xié)同作用，尚有待于進(jìn)一步研究。

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National Science and Technology Planning Project of “12th Five-Year”(2012BAD21B02)； State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding Northeast Forestry University(201203)

introduction：SHEN Ting-Ting(1990—),female,master,tree genetics and breeding research.

date:2016-09-09

BioinformaticsandExpressionAnalysisofBpCesAGenesofBetulaplatyphylla

SHEN Ting-Ting1JIANG Jing1LIU Gui-Feng1XU Si-Jia1LI Hui-Yu1*YUAN Hong-Mei1,2

(1.State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding，Northeast Forestry University，Harbin 150040；2.Industrial Crops Institute of Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences,Harbin 150086)

Six cellulose synthase genes ofBetulaplatyphyllafrom 45 transcriptome data sets were obtained, in which two genes were new genes of cellulose synthase gene family. The sequence characteristic and expression levels in Birch xylem ofBpCesAwere analyzed using bioinformatics and quantitative real-time PCR. The ORF length of 6BpCesAgenes varied from 2 958-3 312 bp; Number of amino acids encoded varied from 985-1 103 aa, and relative molecular weight varied from 110.40-124.29 kD; Theoretical isoelectric point was from 5.90-7.43. SixBpCesAgenes all contained D, D, D, QXXRW conservative structure domain and eight transmembrane helices, in which two were located at the end of the N, and the others were at the end of the C. 52CesAsfrom six dicotyledonous plants, four monocotyledons, and one gymnosperms were analyzed by cluster analysis, andBpCesAshad higher homology withPtrCesA. The homology betweenBpCesA2 andPtrCesA3 reached 92%.BpCesA5 andPtrCesA6,BpCesA1 andPtrCesA8 also had high homology of 89% and 82%, respectively. The RNA level ofBpCesA1,BpCesA2,BpCesA3 andBpCesA5 was increased with the increase of cellulose content. This results suggested that these genes play a positive role in cellulose synthesis in birch. This study provides a basis for the functional analysis of cellulose synthase gene.

Betulaplatyphylla;cellulose;lignin;bioinformatics;expression quantity

“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國(guó)家科技計(jì)劃課題(2012BAD21B02)；東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金項(xiàng)目(201203)

申婷婷(1990—)，女，碩士研究生，主要從事林木遺傳育種研究。

* 通信作者：E-mail:lihuiyu0519@aliyun.com

2016-09-09

* Corresponding author：E-mail:lihuiyu0519@aliyun.com

S792.153

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2016.06.015