煙草化學(xué)誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)的建立

代麗娟 鄭唐春 劉彩霞 劉 軼 由香玲 曲冠證

(1.東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150040； 2.東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150040)

煙草化學(xué)誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)的建立

代麗娟1鄭唐春1劉彩霞1劉 軼1由香玲2*曲冠證1

(1.東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150040；2.東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150040)

化學(xué)誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)對(duì)植物功能基因的研究及植物基因工程應(yīng)用有重要意義。XVE是以雌激素為基礎(chǔ)的用于誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因植物中目的基因表達(dá)的一種系統(tǒng)，能夠在可調(diào)控方式下誘導(dǎo)基因的表達(dá)。目前，以煙草為遺傳轉(zhuǎn)化材料進(jìn)行XVE系統(tǒng)研究的詳細(xì)報(bào)道還未見(jiàn)發(fā)表。本文以煙草作為研究對(duì)象，利用PCR技術(shù)從本實(shí)驗(yàn)保存的質(zhì)粒pROKII-GFP中擴(kuò)增出GFP基因。構(gòu)建雌激素誘導(dǎo)型植物表達(dá)載體(pER8-GFP)并利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤(pán)法將外源基因?qū)胍吧蜔煵葜?；?jīng)潮霉素抗性篩選出轉(zhuǎn)化植株后，用PCR鑒定出陽(yáng)性轉(zhuǎn)化植株，將陽(yáng)性轉(zhuǎn)化植株利用不同濃度和不同時(shí)間的雌激素進(jìn)行處理，并結(jié)合定量PCR和NightSHADE植物活體成像系統(tǒng)對(duì)轉(zhuǎn)基因植株的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明誘導(dǎo)pER8-GFP載體在煙草中表達(dá)的最適雌激素濃度為25 μmol·L-1，最適時(shí)間為48 h；同時(shí)在煙草胚軸與根尖細(xì)胞中檢測(cè)到熒光信號(hào)，表明XVE化學(xué)誘導(dǎo)系統(tǒng)在煙草中也可以高效、嚴(yán)格的依賴(lài)雌激素的誘導(dǎo)來(lái)控制目的基因表達(dá)。本研究將為煙草相關(guān)的化學(xué)誘導(dǎo)表達(dá)研究提供技術(shù)支持與解決方案。

雌激素誘導(dǎo)；基因表達(dá)；XVE；煙草

植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)是研究植物基因功能強(qiáng)有力的工具。至今，轉(zhuǎn)基因的策略已經(jīng)從組成型表達(dá)策略轉(zhuǎn)換成更精確的時(shí)空控制策略[1]。Zuo等[2]建立了一個(gè)基于ER的誘導(dǎo)系統(tǒng)，命名為XVE系統(tǒng)。在植物生物學(xué)研究和生物技術(shù)的應(yīng)用中，化學(xué)誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)(XVE)在一個(gè)可調(diào)控方式下對(duì)于基因的表達(dá)是非?？扇〉摹Ｅc組成型啟動(dòng)子相比，誘導(dǎo)型啟動(dòng)子在各種應(yīng)用中提供了許多優(yōu)點(diǎn)和潛力[3～5]。XVE是以雌激素為基礎(chǔ)的用于誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因物種目的基因表達(dá)的一種系統(tǒng)，屬于嵌合式轉(zhuǎn)錄激活劑。它由3個(gè)轉(zhuǎn)錄單元組成，第一個(gè)轉(zhuǎn)錄單元是人工合成的G10-90強(qiáng)組成型啟動(dòng)子[6]，它能調(diào)控XVE融合轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄。XVE由細(xì)菌阻遏物L(fēng)exA的DBD(X)，VP16的酸性反式激活結(jié)構(gòu)域(V)和人雌激素受體調(diào)控區(qū)(E)所融合而成。第二個(gè)轉(zhuǎn)錄單元是選擇性抗性標(biāo)記基因；最后一個(gè)轉(zhuǎn)錄單元是最小-46 35S啟動(dòng)子與8拷貝的LexA操縱子融合來(lái)控制目的基因的轉(zhuǎn)錄[7]。XVE誘導(dǎo)系統(tǒng)僅受化學(xué)誘導(dǎo)劑(17-β-雌二醇)嚴(yán)格而特定的誘導(dǎo)和調(diào)控，對(duì)植物無(wú)毒害和生理影響，并且在無(wú)雌激素時(shí)，存在于細(xì)胞質(zhì)中，目的基因不表達(dá)；雌激素存在時(shí)，與受體結(jié)合，進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，結(jié)合到嵌合啟動(dòng)子上，激活下游基因的表達(dá)。因此，XVE系統(tǒng)是比較理想的操縱基因表達(dá)和研究基因功能的化學(xué)調(diào)控系統(tǒng)。

目前，XVE誘導(dǎo)系統(tǒng)已經(jīng)在擬南芥[2,8～10]、長(zhǎng)春花[11]、水稻[12～13]、柑橘[14]等植物的研究中被使用。在擬南芥中，Zuo等人[15～16]發(fā)現(xiàn)的這種高效的、嚴(yán)格依賴(lài)于動(dòng)物雌激素誘導(dǎo)的植物表達(dá)系統(tǒng)(XVE)，已經(jīng)通過(guò)化學(xué)誘導(dǎo)激活系統(tǒng)成功發(fā)現(xiàn)并分離了AP2和AGAMOUS的等位基因，這為后期的篩選突變體和鑒定其功能奠定了基礎(chǔ)。并且現(xiàn)已證明，XVE系統(tǒng)除嚴(yán)格依賴(lài)于雌激素外，還可根據(jù)雌激素的使用劑量來(lái)嚴(yán)格控制下游基因的表達(dá)水平[2]。李霞等[17]利用雌激素誘導(dǎo)Cre/loxP重組系統(tǒng)非常高效地實(shí)現(xiàn)了轉(zhuǎn)基因煙草的無(wú)標(biāo)記。同時(shí)，在水稻的研究中，Sreekala等[13]利用β-雌二醇誘導(dǎo)的Cre/loxP重組系統(tǒng)獲得了無(wú)選擇標(biāo)記基因。李琳潔等[14]將XVE系統(tǒng)和Cre/loxP位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)用于無(wú)性繁殖的木本植物柑橘，以建立無(wú)選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化體系。李芳等[10]用雌二醇誘導(dǎo)表達(dá)的XVE啟動(dòng)子超量表達(dá)細(xì)胞周期蛋白CYCD3;1，結(jié)果表明該蛋白在擬南芥中的超量表達(dá)不僅能抑制初生根的伸長(zhǎng)，而且還能抑制初生根對(duì)重力刺激的反應(yīng)能力。這與前人用組成型超量表達(dá)研究CYCD3;1相比，能更好地對(duì)基因的功能進(jìn)行定位。Xu等[11]將Bcl-2家族的一個(gè)哺乳類(lèi)凋亡成員Bax轉(zhuǎn)入長(zhǎng)春花細(xì)胞中讓其過(guò)表達(dá)，誘導(dǎo)表達(dá)后能夠產(chǎn)生超敏反應(yīng)，因此用來(lái)研究植物細(xì)胞體內(nèi)在臨床上產(chǎn)生的重要次生代謝產(chǎn)物。Petrasek等[18]利用XVE系統(tǒng)對(duì)PIN蛋白的功能進(jìn)行了相應(yīng)的研究。

綜上所述，Zuo等[2]2000年建立的XVE系統(tǒng)是一種高效嚴(yán)格依賴(lài)于動(dòng)物β-雌二醇誘導(dǎo)的植物表達(dá)載體，已經(jīng)應(yīng)用于植物基因功能研究的多方面。但以往對(duì)于煙草中的誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)的功能性研究尚不全面，到目前為止，關(guān)于雌激素誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因煙草表達(dá)最適宜的誘導(dǎo)體系還未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究對(duì)煙草中XVE系統(tǒng)應(yīng)答β-雌二醇誘導(dǎo)的模式進(jìn)行了研究，以期建立一個(gè)實(shí)用型的煙草誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)。以GFP為報(bào)告基因，參照Z(yǔ)uo等[2]人的相關(guān)研究報(bào)道，利用qRT-PCR和NightSHADE植物活體成像系統(tǒng)對(duì)轉(zhuǎn)基因植株在煙草中的表達(dá)特異性進(jìn)行分析，來(lái)驗(yàn)證轉(zhuǎn)基因煙草最佳的雌激素誘導(dǎo)濃度和時(shí)間，為以后進(jìn)行煙草XVE系統(tǒng)應(yīng)用研究提供了技術(shù)支持與理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

野生型煙草(NicotianatabacumL.)組培苗，由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 菌株及主要試劑

大腸桿菌感受態(tài)(Trans1-T1)購(gòu)自Transgene biotech有限公司；農(nóng)桿菌EHA105由本實(shí)驗(yàn)室保存；pROKII-GFP質(zhì)粒為本實(shí)驗(yàn)室保存；pER8質(zhì)粒，由東北林業(yè)大學(xué)李成浩教授惠贈(zèng)；17-β-雌二醇，潮霉素(hygromycin，Hy)，奇霉素(Spectinomycin，Spe)均購(gòu)自Sigma公司；DNA marker DL5000、PCR相關(guān)試劑、限制性?xún)?nèi)切酶XhoⅠ和SpeⅠ、rTaq酶、ExTaq酶，DNA ligase kit，dNTP Mixture、SYBR? Premix ExTaqTMⅡ均購(gòu)自TaKaRa公司(大連)；EasyPure? Plant RNA Kit、Plasmid mini Kit I、Gel extraction kit均購(gòu)自O(shè)MEGA生物技術(shù)公司(美國(guó))；其他實(shí)驗(yàn)試劑為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法1.3.1 植物表達(dá)載體pER8-GFP的構(gòu)建

以pROKII-GFP質(zhì)粒為模板，利用引物GFP-XhoⅠ-F和GFP-SpeⅠ-R(表1)進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)程序：10×ExTaqPCR Buffer 5.0 μL，dNTP Mix(10 mmol·L-1)2.0 μL，Primer-F(10 μmol·L-1)2.0 μL，Primer-R(10 μmol·L-1)2.0 μL，ExTaq(5 U·μL-1)0.25 μL，pROKII-GFP質(zhì)粒1.0 μL，加ddH2O至終體積50 μL。反應(yīng)條件：95℃ 4 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃ 7 min。PCR反應(yīng)完成后，吸2 μL進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分析。將得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行膠回收，然后用限制性?xún)?nèi)切酶XhoⅠ和SpeⅠ分別酶切目的片段和pER8載體，酶切體系：XhoⅠ 1.0 μL，SpeⅠ 1.0 μL，10×H buffer 2.0 μL，質(zhì)粒1 μg，加ddH2O至終體積20 μL。反應(yīng)條件：37℃ 2.5 h。酶切完成后用1%的瓊脂糖凝膠電泳，用膠回收試劑盒回收酶切后的目的片段，然后進(jìn)行目的片段連接重組，重組體系：Solution I 8.0 μL，pER8線(xiàn)性片段4.0 μL，GFP目的片段4.0 μL，終體積16 μL。16℃ 1 h，連接反應(yīng)完成后，立即轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含有奇霉素(Spe)的LB平板上培養(yǎng)，37℃過(guò)夜培養(yǎng)10～15 h。然后挑取單克隆進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證，并將陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子送博仕生物技術(shù)有限公司測(cè)序鑒定。最后采用液氮凍融法將pER8-GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105中，隨機(jī)挑取單克隆進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)化子。

表1本實(shí)驗(yàn)中用到的引物(下劃線(xiàn)：酶切位點(diǎn))

Table1Primersusedinthisstudy(Underline：restrictionsite)

引物名稱(chēng)Primers引物序列Sequences用途UsageGFP?XhoⅠ?F5′?ATCCTCGAGATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC?3′GFP?SpeⅠ?R5′?ATCACTAGTTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC?3′GFP基因克隆CloningofGFPgenepER8?F5′?CATCCCCTCGACGTACTGTAC?3′GFP基因驗(yàn)證VerificationofGFPgeneGFP?RT?F5′?ACAACGTCTATATCATGGCCG?3′GFP?RT?R5′?GTGCTCAGGTAGTGGTTGTC?3′實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)RealtimeRT?PCRofGFPNtactin?RT?F5′?TGTGTTGGACTCTGGTGATG?3′N(xiāo)tactin?RT?R5′?CGCTCGGTAAGGATCTTCATC?3′實(shí)時(shí)定量?jī)?nèi)參基因RealtimeRT?PCRofNtactin

1.3.2 煙草的遺傳轉(zhuǎn)化

參考Horsch等[19]的煙草遺傳轉(zhuǎn)化方法，并修改如下：將長(zhǎng)勢(shì)較好，生長(zhǎng)大約20 d左右的野生型煙草(WT)葉片，切成約1 cm2×1 cm2大小放在MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)，(25±2)℃、12 h·d-1光照下培養(yǎng)1 d；在超凈工作臺(tái)下，將EHA105[pER8-GFP]的菌種接種到20 mL含Spe抗生素的液體LB培養(yǎng)基中(50 mg·L-1Spe，50 mg·L-1Rif)，28℃，180 r·min-1振蕩培養(yǎng)至OD600=0.6～0.8；4 000 r·min-1離心5 min，濃縮菌體，讓終濃度為OD600=0.2～0.3，即可作為侵染用菌液；然后，將預(yù)培養(yǎng)2 d的煙草葉片侵染3～7 min，放置在不含抗生素的分化培養(yǎng)基(MS+0.5 mg·L-16-BA+0.05 mg·L-1NAA)上培養(yǎng)，25±2℃下共培養(yǎng)2 d后，轉(zhuǎn)置含有30 mg·L-1潮霉素(Hy)和500 mg·L-1特美汀的MS分化培養(yǎng)基上，直至分化出抗性芽。待芽長(zhǎng)到約1 cm左右時(shí)，轉(zhuǎn)置到MS生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)備用。

1.3.3 轉(zhuǎn)基因煙草的PCR檢測(cè)

為篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子株系，用CTAB法提取篩選后T1代抗性植株葉片的DNA，并將其作為模板利用表1中引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件：95℃ 4 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃ 7 min，PCR反應(yīng)完成后，取2 μL擴(kuò)增產(chǎn)物，在1%瓊脂糖凝膠中檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。

1.3.4 化學(xué)誘導(dǎo)處理

誘導(dǎo)劑17-β-雌二醇溶于二甲基亞砜(DMSO)中，以1 mmol·L-1的儲(chǔ)存液放于-20℃保存?zhèn)溆?。將在不含誘導(dǎo)物的培養(yǎng)基上篩選獲得的T2代生長(zhǎng)10 d大的3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的幼苗轉(zhuǎn)移至含有雌激素(17-β-雌二醇)終濃度分別為0、0.008、0.04、0.2、1、5、25及50 μmol·L-1培養(yǎng)基中(含Hy)培養(yǎng)16 h。同時(shí)，也將篩選獲得的T2代生長(zhǎng)10 d大的3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的幼苗分別在雌激素(17-β-雌二醇)終濃度為2 μmol·L-1培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)0、0.5、1、3、6、12、24、48和96 h。設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，快速用錫箔紙包好并作標(biāo)記，立即置于液氮中，凍于-80℃冰箱中保存。

1.3.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)

利用EasyPure?Plant RNA Kit試劑盒分別提取經(jīng)雌激素誘導(dǎo)處理的相同時(shí)間不同濃度及相同濃度不同時(shí)間的轉(zhuǎn)基因株系煙草幼苗的總RNA。并通過(guò)PrimeScript? RT reagent Kit Perfect Real Time試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，將合成的第一鏈cDNA用ddH2O稀釋10倍后用作模板。反應(yīng)總體系為20 μL；10 μL SYBR Green，0.4 μL ROX Dye II，cDNA模板2 μL，正、反向引物各0.8 μL。引物如表1所示。以煙草Ntactin基因作為內(nèi)參。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 35 s，40個(gè)循環(huán)；95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s。每個(gè)樣品進(jìn)行3次重復(fù)，并通過(guò)2-ΔΔCt法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.3.6 誘導(dǎo)植株的表達(dá)情況觀(guān)察

為了進(jìn)一步研究雌激素(17-β-雌二醇)對(duì)GFP基因誘導(dǎo)的表達(dá)情況，選取表達(dá)量較高的轉(zhuǎn)基因植株用于熒光觀(guān)察。將生長(zhǎng)10 d大的幼苗在雌激素濃度為25 μmol·L-1培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h，然后，放置于載玻片上，在激光共聚焦顯微鏡下觀(guān)察其葉片、胚軸和根尖的表達(dá)情況，同時(shí)，并將植株轉(zhuǎn)移至NightSHADE植物活體成像系統(tǒng)中，選擇Luminescence(發(fā)光檢測(cè))，輸出偽彩色圖像，進(jìn)而分析GFP基因的表達(dá)特異性，拍照保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物表達(dá)載體pER8-GFP的構(gòu)建

XVE載體的示意圖如圖1所示，為了研究這個(gè)系統(tǒng)，我們?cè)赬VE載體(pER8)的靶基因表達(dá)盒插入了一個(gè)cDNA編碼的綠色熒光蛋白(GFP)，具體構(gòu)建步驟如下：利用PCR技術(shù)從pROKII-GFP載體中擴(kuò)增出帶有XhoⅠ和SpeⅠ酶切位點(diǎn)的目的片段(圖2:A)，利用限制性?xún)?nèi)切酶分別對(duì)PCR擴(kuò)增出的目的片段和pER8載體雙酶切(圖2:B)，酶切產(chǎn)物進(jìn)行膠回收，然后用DNA ligase kit進(jìn)行連接。隨后，在含有Spe抗生素的平板上隨機(jī)挑選8個(gè)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌液PCR檢驗(yàn)(圖2:C)，并將陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果表明插入序列未發(fā)生堿基突變，至此植物表達(dá)載體pER8-GFP構(gòu)建完成。隨后將pER8-GFP的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入EHA105菌液中，隨機(jī)挑取單菌落進(jìn)行PCR驗(yàn)證(圖2:D)。

圖1 XVE載體的示意圖 PG10-90.組成型強(qiáng)啟動(dòng)子；LexA. DNA結(jié)合域；VP16.轉(zhuǎn)錄激活域；hER.人類(lèi)雌激素受體調(diào)節(jié)域；TE9. rbcS E9 ploy(A)尾巴；PNOS.胭脂堿合酶啟動(dòng)子；Hpt.潮霉素抗性基因；TNOS.胭脂堿合酶終止子；OLexA. LexA操縱基因序列的8個(gè)拷貝；-46. -46 35S最小啟動(dòng)子；MCS.靶基因的多克隆位點(diǎn)；T3A. rbcsS 3A ploy(A)尾巴 箭頭表示轉(zhuǎn)錄的方向Fig.1 Schematic of plant expression vector pER8 PG10-90. A strong constitutive promoter; LexA. DNA binding domain; VP16. Transcription activation domain; hER. Regulatory region of the human estrogen receptor; TE9. rbcS E9 ploy(A) addition sequence; PNOS. Nopaline synthase promoter; Hpt. Hygromycin resistance gene; TNOS. Nopaline synthase terminator; OLexA. Eight copies of the LexA operator sequence; -46. The -46 35S minimal promoter; MCS. Multiple cloning sites for target genes; T3A. rbcsS 3A ploy(A) addition sequence Arrows indicate the direction of transcription.

圖2 植物表達(dá)載體pER8-GFP的構(gòu)建 A.GFP基因的克?。篗. DNA marker DL5000；1. GFP基因的PCR產(chǎn)物 B.GFP片段和pER8載體的雙酶切：M. DNA marker DL5000；1. PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的酶切結(jié)果；2. pER8載體的酶切結(jié)果 C.植物表達(dá)載體pER8-GFP菌液PCR產(chǎn)物：M. DNA marker DL5000；1～7. pER8-GFP轉(zhuǎn)化子的菌液PCR檢測(cè)；8.陰性對(duì)照 D. pER8-GFP在農(nóng)桿菌中的菌液PCR驗(yàn)證：M. DNA marker DL5000；1～7. pER8-GFP轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌的菌液PCR產(chǎn)物；8.陰性對(duì)照Fig.2 The construction of pER8-GFP vector A. The cloning of GFP gene: M. DNA marker DL5000; 1. PCR product of GFP geneB. Double enzyme analysis of GFP fragments and pER8 vectors: 1. Digested result of GFP fragments; 2. Digested result of pER8 vector C. PCR products of plant expression vector pER8-GFP: M. DNA marker DL5000; 1～7. PCR detection of pER8-GFP transformants; 8. negative control D. PCR validation of pER8-GFP transformants in EHA105: M. DNA marker DL5000; 1～7. PCR products of pER8-GFP transformants in EHA105; 8. Negative control

2.2 pER8-GFP在煙草中的遺傳轉(zhuǎn)化及PCR鑒定

將生長(zhǎng)大約3周左右的野生型煙草組培苗葉片切成約1 cm2×1 cm2大小，然后對(duì)煙草進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。經(jīng)過(guò)2 d的共培養(yǎng)后將葉片放入含有30 mg·L-1Hy的MS分化培養(yǎng)基上進(jìn)行抗性篩選(圖3:A)，經(jīng)過(guò)大約15 d左右的篩選，等抗性芽長(zhǎng)出葉片后，將其切下放在含有抗生素的分化培養(yǎng)基上進(jìn)行二次篩選分化(圖3:B)。經(jīng)過(guò)多次篩選后，將伸長(zhǎng)至1 cm左右的莖段轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基中，進(jìn)行生根培養(yǎng)(圖3:C)。待生根培養(yǎng)20 d后，提取不同株系的幼葉DNA，利用表1中的pER8-F和GFP-SpeⅠ-R引物進(jìn)行PCR檢測(cè)(圖3:D)。最后，在所有抗性苗中共獲得了12株轉(zhuǎn)基因植株。

圖3 pER8-GFP在煙草中的遺傳轉(zhuǎn)化及PCR鑒定 A.煙草葉片的抗性篩選；B.抗性芽的二次篩選；C.抗性芽的生根培養(yǎng)；D.抗性苗的PCR檢測(cè)；M. DNA marker DL5000；1～12. 12株抗性苗的PCR產(chǎn)物；13.陰性對(duì)照Fig.3 Genetic transformation and identification of GFP in tobacco A. Resistance screening of tobacco leaves; B. Resistance screening of resistant buds; C. Rooting of resistant seedlings; D. PCR detection of resistant seedlings; M. DNA marker DL5000; 1～12. 12 PCR products of resistant seedlings; 13.Negative control

2.3 誘導(dǎo)植株的qRT-PCR檢測(cè)

為了研究煙草GFP基因的誘導(dǎo)表達(dá)水平，分別提取不同濃度和不同時(shí)間用雌激素誘導(dǎo)處理的3個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因株系(L1、L2和L3)煙草幼苗的總RNA，利用qRT-PCR檢測(cè)GFP基因的表達(dá)水平，結(jié)果如圖4所示。不同濃度的雌激素誘導(dǎo)處理24 h后，3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系均對(duì)不同的誘導(dǎo)劑濃度處理產(chǎn)生應(yīng)答反應(yīng)，而未被誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因株系和野生型植株中沒(méi)有檢測(cè)到GFP的表達(dá)。此外，GFP在0.008 μmol·L-1的雌激素誘導(dǎo)下開(kāi)始表達(dá)，至25 μmol·L-1時(shí)達(dá)到飽和，當(dāng)繼續(xù)增大誘導(dǎo)濃度，表達(dá)水平?jīng)]有顯著的增加(圖4:A)。不同時(shí)間處理下，GFP的誘導(dǎo)表達(dá)隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，表達(dá)量顯著上調(diào)，但處理時(shí)間至48 h時(shí)達(dá)到最高水平，隨后GFP的轉(zhuǎn)錄水平隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)開(kāi)始下降(圖4:B)。上述結(jié)果表明化學(xué)誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)pER8-GFP在煙草中表達(dá)的最適雌激素濃度為25 μmol·L-1，最適時(shí)間為48 h。

圖4 GFP基因在煙草中對(duì)雌二醇的應(yīng)答情況 A. GFP基因?qū)Υ贫紳舛鹊捻憫?yīng)；B. GFP基因?qū)Υ贫?濃度為2 μmol·L-1)時(shí)間的響應(yīng)；35S-1，35S-2.兩個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因株系(35S::GFP)；WT.野生型Fig.4 Response of GFP gene to estradiol in tobacco A. Response of GFP gene to estradiol concentrations; B. Response of GFP gene to estradiol(concentration 25 μmol·L-1) times; 35S-1,35S-2. Two independent transgenic lines(35S::GFP); WT. Wild type

2.4 GFP基因在煙草中的誘導(dǎo)表達(dá)分析

為了進(jìn)一步研究雌激素(17-β-雌二醇)對(duì)GFP基因誘導(dǎo)的表達(dá)情況，選取3個(gè)生長(zhǎng)10 d左右在雌激素濃度為25 μmol·L-1培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h后的幼苗，放置于載玻片上進(jìn)行鏡檢觀(guān)察，均出現(xiàn)了相似的表達(dá)結(jié)果。圖5則表明了轉(zhuǎn)基因株系L3表達(dá)結(jié)果。結(jié)果表明GFP基因在葉片、胚軸和根尖均有較強(qiáng)的熒光(圖5)。同時(shí)，將誘導(dǎo)后的幼苗轉(zhuǎn)移至NightSHADE植物活體成像系統(tǒng)中，輸出偽彩色圖像，進(jìn)而分析GFP基因的表達(dá)特異性。圖6顯示，在GFP基因煙草植株的下胚軸及根尖均有熒光信號(hào)檢出，其中根尖區(qū)熒光信號(hào)最高。

圖5 雌二醇誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因煙草中GFP表達(dá) 35S::GFP.陽(yáng)性對(duì)照；WT.陰性對(duì)照；pER8-GFP.經(jīng)雌二醇誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因植株Fig.5 Estradiol-induced GFP expression in transgenic tobacco 35S::GFP. Positive control; WT. Negative control; pER8-GFP. Transgenic plants induced by estradiol

圖6 GFP基因的表達(dá)特性分析 35S::GFP.陽(yáng)性對(duì)照；WT.陰性對(duì)照；1,2.經(jīng)雌二醇誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因株系Fig.6 Expression characteristics analysis of GFP gene 35S::GFP. Positive control; WT. Negative control; 1,2. Transgenic plants induced by estradiol

3 討論

隨著植物生物技術(shù)的發(fā)展，轉(zhuǎn)基因技術(shù)以其巨大的應(yīng)用價(jià)值，正逐步成為一種常規(guī)育種手段。傳統(tǒng)方法是將目的基因在轉(zhuǎn)基因植株中過(guò)量表達(dá)或抑制基因表達(dá)，但是組培過(guò)程中產(chǎn)生的體細(xì)胞自身突變或目的基因的隨機(jī)插入都可能引起表型變化，進(jìn)而干擾對(duì)目的基因的功能鑒定?；瘜W(xué)誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)通過(guò)誘導(dǎo)處理與非誘導(dǎo)處理的對(duì)比，可以區(qū)分基因引起的表型變化的原因，方便、準(zhǔn)確地鑒定研究基因的功能。誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)還可以解決組成型表達(dá)所引起的致死或不育等問(wèn)題，經(jīng)誘導(dǎo)后進(jìn)而研究這些相關(guān)基因的功能?；瘜W(xué)誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)具有廣闊的應(yīng)用范圍，例如應(yīng)用XVE化學(xué)調(diào)控系統(tǒng)的質(zhì)粒pER8，Zuo等[2]建立的XVE化學(xué)誘導(dǎo)系統(tǒng)是對(duì)GVG誘導(dǎo)系統(tǒng)的改善，GVG在多種植物中都會(huì)引起生長(zhǎng)缺陷。而XVE系統(tǒng)不存在與GVG相似的生長(zhǎng)缺陷。本研究采用了相似的XVE誘導(dǎo)系統(tǒng)和Cre/loxP重組系統(tǒng)。Cre重組酶為雌激素誘導(dǎo)表達(dá)型，其啟動(dòng)子采用LexA+35S(-46區(qū))啟動(dòng)區(qū)，LexA調(diào)控區(qū)受XVE蛋白的調(diào)控，在無(wú)雌激素的情況高效阻遏基因的表達(dá)，但有雌激素存在時(shí)，它與雌激素結(jié)合又可高效啟動(dòng)基因表達(dá)[8]。Zuo等2000年在擬南芥中研究證明，該化學(xué)誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)可用于改善轉(zhuǎn)基因植物引起生長(zhǎng)缺陷的問(wèn)題[2]。Curtis[20]等使用XVE系統(tǒng)建立了的克隆載體用于植物中高通量基因功能分析。Zuo等[8,21～23]使用依賴(lài)雌二醇誘導(dǎo)的XVE系統(tǒng)激活標(biāo)簽，建立了擬南芥突變體庫(kù)，獲得大量擬南芥功能性突變體。Arroyo-Herrera等[24]利用該系統(tǒng)在轉(zhuǎn)基因可可(Coffea canephora)中建立體細(xì)胞胚胎的重復(fù)發(fā)生和生產(chǎn)體系，并從可可的子葉中誘導(dǎo)產(chǎn)生異源分生組織；另外，Bruce等報(bào)道了另一個(gè)以ER為基礎(chǔ)的誘導(dǎo)系統(tǒng)，利用ER-C嵌合因子，使兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子CRC(C1和R的融合因子)和P過(guò)表達(dá)，進(jìn)而鑒定出大量的下游靶基因[25]。此外，將XVE誘導(dǎo)系統(tǒng)用于轉(zhuǎn)基因水稻的研究中卻發(fā)現(xiàn)，基因不能在整株植株中表達(dá)，只能在根部才能檢測(cè)到報(bào)告基因的表達(dá)，表明此系統(tǒng)在轉(zhuǎn)基因水稻中經(jīng)誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)后表達(dá)不具有穩(wěn)定性[26]。而與其相比，本文在轉(zhuǎn)基因煙草中的研究所用的雌激素誘導(dǎo)的啟動(dòng)子能定時(shí)定量、嚴(yán)謹(jǐn)高效地表達(dá)報(bào)告基因，同時(shí)通過(guò)誘導(dǎo)與非誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因植株相比，排除了轉(zhuǎn)基因操作本身對(duì)植株的影響，能更加清晰準(zhǔn)確地研究煙草中XVE系統(tǒng)應(yīng)答β-雌二醇誘導(dǎo)的模式。

目前，使用化學(xué)誘導(dǎo)系統(tǒng)的研究多集中在擬南芥等植物中，但以往對(duì)于煙草中的誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)的功能性研究尚不全面，到目前為止，關(guān)于雌激素誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因煙草表達(dá)最適宜的誘導(dǎo)體系還未見(jiàn)報(bào)道。GFP是水母體內(nèi)一種天然蛋白質(zhì)，能在多種植物體內(nèi)表達(dá)綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)，可以用來(lái)作為報(bào)告基因在活體細(xì)胞中進(jìn)行圖像分析[27]。在本研究中，我們用GFP基因作為報(bào)告基因進(jìn)行XVE系統(tǒng)在煙草中的應(yīng)用研究。首先，利用qRT-PCR技術(shù)對(duì)GFP基因在煙草中的表達(dá)特異性進(jìn)行分析，驗(yàn)證轉(zhuǎn)基因煙草最佳的雌二醇誘導(dǎo)濃度和時(shí)間。研究發(fā)現(xiàn)，雌激素濃度達(dá)到0.008 μmol·L-1時(shí)，目的基因開(kāi)始表達(dá)，當(dāng)雌激素濃度達(dá)到25 μmol·L-1時(shí)達(dá)到飽和。這個(gè)結(jié)果與早期研究的最適宜誘導(dǎo)濃度2 μmol·L-1略有不同，這可能是不同的物種之間存在的差異導(dǎo)致的。同時(shí)，GFP的轉(zhuǎn)錄在誘導(dǎo)48 h時(shí)達(dá)到最高水平，然后GFP的轉(zhuǎn)錄水平開(kāi)始逐漸的下降。最后，我們采用NightSHADE植物活體成像系統(tǒng)對(duì)其進(jìn)一步的分析。結(jié)果表明在轉(zhuǎn)GFP基因的煙草植株胚軸和根尖均有熒光信號(hào)檢出，但熒光信號(hào)弱于35S組成型啟動(dòng)子，這可能是由于XVE系統(tǒng)自身特點(diǎn)及雌激素濃度和處理時(shí)間上的差異所導(dǎo)致的。此外，轉(zhuǎn)基因煙草根尖區(qū)熒光信號(hào)最高，這可能是因?yàn)楦獠课唤佑|培養(yǎng)基中的雌激素，最先激活誘導(dǎo)表達(dá)有關(guān)。綜上，通過(guò)本實(shí)驗(yàn)的初步研究，建立了適用于煙草轉(zhuǎn)基因的XVE系統(tǒng)研究，篩選出在煙草中雌激素誘導(dǎo)的最佳誘導(dǎo)濃度和誘導(dǎo)時(shí)間，這為以后進(jìn)行外源基因的可控性表達(dá)分析提供了依據(jù)。

1.Moore I,Samalova M,Kurup S.Transactivated and chemically inducible gene expression in plants[J].The Plant Journal,2006,45(4):651-683.

2.Zuo J R,Niu Q W,Chun N H.An estrogen receptor-based transactivator XVE mediates highly inducible gene expression in transgenic plants[J].The Plant Journal,2000,24(2):265-273.

3.Gatz C.Chemical control of gene expression[J].Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology,1997,48(4):89-108.

4.Gatz C,Lenk I.Promoters that respond to chemical inducers[J].Trends in Plant Science,1998,3(9):352-358.

5.Zuo J R,Niu Q W,Nishizawa N,et al.KORRIGAN,anArabidopsisendo-1,4-β-glucanase,localizes to the cell plate by polarized targeting and is essential for cytokinesis[J].The Plant Cell,2000,12(7):1137-1152.

6.Ishige F,Takaichi M,Foster R,et al.A G-box motif(GCCACGTGCC)tetramer confers high-level constitutive expression in dicot and monocot plants[J].The Plant Journal,1999,18(4):443-448.

7.Benfey P N,Ren L,Chua N H.Tissue-specific expression from CaMV 35S enhancer subdomains in early stages of plant development[J].EMBO Journal,1990,9(6):1677-1684.

8.Zuo J R,Niu Q W,M?ller S G,et al.Chemical-regulated,site-specific DNA excision in transgenic plants[J].Nature Biotechnology,2001,19(2):157-161.

9.Sun J Q,Niu Q W,Tarkowski P,et al.TheArabidopsisAtIPT8/PGA22 gene encodes an isopentenyl transferase that is involved in De Novo cytokinin biosynthesis[J].Plant Physiology,2003,131(1):167-176.

10.李芳,許穎,張姣,等.超量表達(dá)細(xì)胞D型周期蛋白CYCD3;1影響擬南芥根的發(fā)育[J].植物生理學(xué)通訊,2008,44(3):431-435.

Li F,Xu Y,Zhang J,et al.Overexpression of D-type cyclin CYCD3;1 affects root development inArabidopsisthalianaL.[J].Plant Physiology Communications,2008,44(3):431-435.

11.Xu M J,Dong J F.Enhancing terpenoid indole alkaloid production by inducible expression of mammalian Bax inCatharanthusroseuscells[J].Science in China Series C:Life Sciences,2007,50(2):234-241.

12.Okuzaki A,Konagaya K I,Nanasato Y,et al.Estrogen-inducible GFP expression patterns in rice(OryzasativaL.)[J].Plant Cell Reports,2011,30(4):529-538.

13.Sreekala C,Wu L,Gu K,et al.Excision of a selectable marker in transgenic rice(OryzasativaL.)using a chemically regulated Cre/loxP system[J].Plant Cell Reports,2005,24(2):86-94.

14.李琳潔,楊莉,李芳,等.柑橘無(wú)標(biāo)記轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化體系的建立[J].湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2010,36(6):649-652.

Li L J,Yang L,Li F,et al.Marker-free transgenic system ofCitrus[J].Journal of Hunan Agricultural University:Natural Sciences,2010,36(6):649-652.

15.Kang H G,Fang Y W,Singh K B.A glucocorticoid-inducible transcription system causes severe growth defects inArabidopsisand induces defense-related genes[J].The Plant Journal,1999,20(1):127-133.

16.Zhang S P,Chen L L,Goff S A.Regulation of gene expression by small molecules in rice[J].Novartis Foundation Symposium,2001,236:85-99.

17.李霞,翁海波,韓紹印,等.轉(zhuǎn)基因植物高效刪除標(biāo)記基因的實(shí)用型雙元轉(zhuǎn)化載體[J].生物工程學(xué)報(bào),2006,22(4):550-554.

Li X,Weng H B,Han S Y,et al.A novel binary vector to get marker-free transgenic plant[J].Chinese Journal of Biotechnology,2006,22(4):550-554.

18.Petrá?ek J,Mravec J,Bouchard R,et al.PIN proteins perform a rate-limiting function in cellular auxin efflux[J].Science,2006,312(5775):914-918.

19.Horsch R B,Fry J E,Hoffmann N L,et al.A simple and general method for transferring genes into plants[J].Science,1985,227(4691):1229-1231.

20.Curtis M D,Grossniklaus U.A gateway cloning vector set for high-throughput functional analysis of genes in Planta[J].Plant Physiology,2003,133(2):462-469.

21.張健,徐金相,孔英珍,等.化學(xué)誘導(dǎo)激活型擬南芥突變體庫(kù)的構(gòu)建及分析[J].遺傳學(xué)報(bào),2005,32(10):1082-1088.

Zhang J,Xu J X,Kong Y Z,et al.Generation of chemical-inducible activation tagging T-DNA insertion lines ofArabidopsisthaliana[J].Acta Genetica Sinica,2005,32(10):1082-1088.

22.Zuo J R,Niu Q W,Frugis G,et al.TheWUSCHELgene promotes vegetative-to-embryonic transition inArabidopsis[J].The Plant Journal,2002,30(3):349-359.

23.Wang X C,Niu Q W,Teng C,et al.Overexpression ofPGA37/MYB118 andMYB115 promotes vegetative-to-embryonic transition inArabidopsis[J].Cell Research,2009,19(2):224-235.

24.Arroyo-Herrera A,Gonzalez A K,Moo R C,et al.Expression of WUSCHEL inCoffeacanephoracauses ectopic morphogenesis and increases somatic embryogenesis[J].Plant Cell,Tissue and Organ Culture,2008,94(2):171-180.

25.Bruce W,Folkerts O,Garnaat C,et al.Expression profiling of the maize flavonoid pathway genes controlled by estradiol-inducible transcription factors CRC and P[J].The Plant Cell,2000,12(1):65-79.

26.程倩倩.水稻化學(xué)誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)的建立[D].福州:福建農(nóng)林大學(xué),2013.

Cheng Q Q.Development of chemical-inducible gene expression system in rice[D].Fuzhou:Fujian Agriculture and Forestry University,2013.

27.張俊蓮,王蒂,張金文,等.用綠色熒光蛋白和洋蔥表皮細(xì)胞檢測(cè)擬南芥rd29A基因啟動(dòng)子活性的方法[J].植物生理學(xué)通訊,2005,41(6):815-819.

Zhang J L,Wang D,Zhang J W,et al.Determination of promoter activity ofrd29Agene ofArabidopsisthalianausing green fluorescent protein and onion epidermal cell[J].Plant Physiology Communications,2005,41(6):815-819.

Program for New Century Excellent Talents in University(No.NCET-12-0808)；The National Natural Science Foundation of China(No.31370661)

introduction：DAI Li-Juan(1988—),female,master student,mainly engaged in the study of tree genetics and breeding.

date:2016-06-06

EstablishmentofAChemical-inducibleGeneExpressionSysteminTobacco

DAI Li-Juan1ZHENG Tang-Chun1LIU Cai-Xia1LIU Yi1YOU Xiang-Ling2*QU Guan-Zheng1

(1.State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding,Northeast Forestry University,Harbin 150040；2.College of Life Science,Northeast Forest University,Harbin 150040)

Chemical-inducible expression system is a powerful tool for plant functional genomics and plant genetic engineering applications. XVE is a chemical-inducible expression system using estrogen for chemical induction. The detailed report about XVE using tobacco as plant material was not available yet. In this study,GFPwas amplified from the plasmid pROKII-GFPthat was preserved in this experiment by PCR. Estrogen inducible plant expression vector(pER8-GFP) was constructed and transformed into wild-type tobacco byAgrobacterium-mediated leaf disc transformation. The positive transformants were screened with hygromycin followed by a further PCR identification. The transformants were induced with different concentrations and different times of estrogen. The expression ofGFPin transgenic tobacco was tested by using qRT-PCR and NightSHADE plantsinvivoimaging system, and the results showed that the best suitable concentration of estrogen which induced the expression of pER8-GFPin tobacco was 25 μmol·L-1, and the best suitable period was 48 h. At the same time, theGFPgene appeared in the hypocotyl and root tip cells of transgenic tobacco. It showed that the XVE chemical induction system in tobacco could also be used to control the expression of the target gene efficiently by the induction of estrogen. Our study will contribute to the XVE study of tobacco in future.

estradiol-inducible;gene expression;XVE;Nicotianatabacum

教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計(jì)劃項(xiàng)目(No.NCET-12-0808)；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.31370661)資助

代麗娟(1988—)，女，博士研究生，主要從事林木遺傳育種研究。

* 通信作者：E-mail：yxiangling@yahoo.com

2016-06-06

* Corresponding author：E-mail：yxiangling@yahoo.com

Q943

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2016.06.016