橡膠樹(shù)MSAP反應(yīng)體系優(yōu)化及其不同開(kāi)割高度單株DNA甲基化分析

吳春太 班 碩,2 黎 瑜 曾日中*

(1.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所/農(nóng)業(yè)部橡膠樹(shù)生物學(xué)與遺傳資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/國(guó)家橡膠樹(shù)育種中心/海南省熱帶作物栽培生理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,儋州 571737； 2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,武漢 430070)

橡膠樹(shù)MSAP反應(yīng)體系優(yōu)化及其不同開(kāi)割高度單株DNA甲基化分析

吳春太1班 碩1,2黎 瑜1曾日中1*

(1.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所/農(nóng)業(yè)部橡膠樹(shù)生物學(xué)與遺傳資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/國(guó)家橡膠樹(shù)育種中心/海南省熱帶作物栽培生理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,儋州 571737；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,武漢 430070)

以‘熱研7-33-97’橡膠樹(shù)無(wú)性系幼嫩葉片為材料，通過(guò)利用單因素和正交試驗(yàn)相結(jié)合的方法，對(duì)酶切、預(yù)擴(kuò)增和選擇性擴(kuò)增3個(gè)影響甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性(MSAP)分析的關(guān)鍵步驟的反應(yīng)體系中關(guān)鍵影響因素進(jìn)行了優(yōu)化，建立橡膠樹(shù)MSAP反應(yīng)最佳體系，并用于高低割線橡膠樹(shù)基因組DNA甲基化差異分析。結(jié)果表明：在50 μL反應(yīng)體系中，750 ng基因組DNA用EcoRⅠ 20 U，HpaⅡ 20 U或MspⅠ 10 U于37℃恒溫同步酶切10 h，酶切完全。最佳預(yù)擴(kuò)增體系(20 μL)為：連接產(chǎn)物4 μL，MgCl2(25 mmol·L-1)0.15 μL，dNTPs(2.5 mmol·L-1)0.1 μL，上下游引物E-00/HM-00(10 μmol·L-1)各0.3 μL，Taq酶(5 U·μL-1)0.1 μL，10×PCR Buffer 2 μL。最佳選擇性擴(kuò)增反應(yīng)體系(20 μL)為：稀釋20倍的預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物2 μL，MgCl2(25 mmol·L-1)0.1 μL，dNTPs(2.5 mmol·L-1)0.125 μL，上下游引物E+3/HM+3(10 μmol·L-1)各0.4 μL，Taq酶(5 U·μL-1)0.1 μL，10×PCR Buffer 2 μL。高低割線樹(shù)DNA的甲基化比例分別為37.22%和36.43%，2種開(kāi)割膠樹(shù)基因組CCGG位點(diǎn)胞嘧啶全甲基化率明顯高于半甲基化率，推測(cè)橡膠樹(shù)基因組甲基化主要模式可能是CpG型。綜上表明，建立的MSAP反應(yīng)體系穩(wěn)定可靠且重復(fù)性好，為后續(xù)橡膠樹(shù)不同脅迫(割膠)程度DNA甲基化的研究奠定了基礎(chǔ)。

高低割線橡膠樹(shù)；DNA甲基化；甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性(MSAP)；體系優(yōu)化

DNA甲基化(DNA methylation)是基因組DNA主要的表觀遺傳(epigenetics)修飾形式[1]，在高等植物基因組中殘基發(fā)生甲基化的胞嘧啶約有20%～50%，其中約有90%的5mC位于CpG島或CpNpG三核苷酸對(duì)區(qū)域[2～4]。其在植物基因表達(dá)、生長(zhǎng)發(fā)育、抵御環(huán)境脅迫等方面發(fā)揮著至關(guān)重要的調(diào)控作用[4～7]。目前檢測(cè)DNA甲基化的方法有多種，其中甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性(methylation sensitive amplification polymorphism,MSAP)是檢測(cè)基因組DNA胞嘧啶甲基化位點(diǎn)最常用的方法。自1999年Xiong等[8]首次證明植物DNA甲基化MSAP檢測(cè)方法的可靠性以來(lái)，大量的研究表明，其已廣泛應(yīng)用于伴隨樹(shù)木生長(zhǎng)發(fā)育和環(huán)境脅迫響應(yīng)過(guò)程的表觀遺傳變異研究領(lǐng)域。目前，在毛竹(PhyllostachysheterocyclaVar)[9]、五月季竹(Phyllostachysbambusoides)[10]、毛白楊(Populustomentosa)[11～13]、杉木(Cunninghamialaneeolata)[14]、紅豆杉(Taxusmedia)[15]、輻射松(Pinusradiata)[16～19]、落葉松(Larixleptolepis)[20～22]、泡桐(Paulowniafortunei)[23～26]等多種喬木中都有應(yīng)用，因此對(duì)橡膠樹(shù)木生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中和割膠脅迫等不良環(huán)境中時(shí)DNA甲基化模式和水平變化的研究十分必要。

橡膠樹(shù)是產(chǎn)膠作物中最主要的樹(shù)種，是常見(jiàn)熱帶木本經(jīng)濟(jì)作物，膠乳量豐富，可作上萬(wàn)種工業(yè)制品的原料，應(yīng)用領(lǐng)域主要集中于商業(yè)、防御和運(yùn)輸?shù)刃袠I(yè)[27]。中國(guó)是世界第五大天然橡膠生產(chǎn)國(guó)，在海南、云南、廣東等地均有栽培，對(duì)熱區(qū)農(nóng)村經(jīng)濟(jì)發(fā)展和生態(tài)環(huán)境改善有十分重要的影響。近年來(lái)針對(duì)橡膠樹(shù)的機(jī)械傷害適應(yīng)性機(jī)制進(jìn)行了許多研究，但研究多集中于基因和蛋白表達(dá)等方面[28～30]。盡管吳春太等于2011年建立了橡膠樹(shù)的MSAP熒光標(biāo)記反應(yīng)體系，并在種植材料類型不同的‘熱研7-33-97’老幼態(tài)無(wú)性系中得到驗(yàn)證[31]，同年，李海林等通過(guò)單因素和L9(34)正交試驗(yàn)法分別對(duì)酶切體系和選擇性擴(kuò)增體系進(jìn)行優(yōu)化，建立了適宜橡膠樹(shù)MSAP分析的技術(shù)體系[32～33]，其后利用該體系分析種植材料類型不同的‘熱研8-79’老幼態(tài)無(wú)性系的DNA甲基化[34]，但關(guān)于同一林段范圍內(nèi)單一品種割線高度不同單株間橡膠樹(shù)DNA甲基化模式和水平的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。探究橡膠樹(shù)DNA甲基化模式和水平對(duì)了解橡膠樹(shù)生長(zhǎng)發(fā)育和環(huán)境脅迫適應(yīng)機(jī)理有重大意義。本研究以‘熱研7-33-97’橡膠樹(shù)品種幼嫩葉片為材料，通過(guò)優(yōu)化主要影響因素，建立橡膠樹(shù)MSAP分析的技術(shù)體系，并初步應(yīng)用于割線高度不同橡膠樹(shù)基因組DNA甲基化的變化分析，旨在為闡明橡膠產(chǎn)量形成的分子機(jī)制，以及從分子層次為橡膠樹(shù)的割面規(guī)劃、割制改革等應(yīng)用基礎(chǔ)研究提供技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

高割線和低割線橡膠樹(shù)選自中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院(儋州)試驗(yàn)場(chǎng)金富隊(duì)科技示范園8年生‘熱研7-33-97’，割齡約2年，高低割線樹(shù)開(kāi)割高度分別為1.2和0.9 m。每種割線樹(shù)隨機(jī)選擇3株，于2014年3月采集健康的古銅期嫩葉，采集后裝入冰盒迅速帶回實(shí)驗(yàn)室，置于-80℃冰箱備用。

1.2 基因組DNA提取

首先從兩種割線樹(shù)各隨機(jī)抽取3個(gè)單株，共6個(gè)單株，采用改良CTAB法[35]分別提取各單株基因組DNA，RNases處理后，利用1%瓊脂糖凝膠電泳和核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)DNA的質(zhì)量和濃度；然后從每個(gè)樣品中取等量的DNA混合，用于橡膠樹(shù)MSAP分析技術(shù)反應(yīng)體系的建立，剩余的DNA樣品按割線類別混合后用于不同割線橡膠樹(shù)DNA甲基化模式與水平分析。

1.3 MSAP技術(shù)流程

MSAP基本程序按照Xiong等[8]報(bào)道的方法進(jìn)行，并針對(duì)DNA酶切體系、預(yù)擴(kuò)增體系、選擇性擴(kuò)增體系等反應(yīng)條件分別進(jìn)行篩選優(yōu)化。

1.3.1 酶切體系

為確定最佳酶切方式，利用對(duì)甲基化敏感的同裂酶HpaⅡ和MspⅠ與限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ對(duì)基因組DNA分別進(jìn)行單酶切、分步雙酶切和同步雙酶切：①選用EcoRⅠ、HpaⅡ和MspⅠ三種內(nèi)切酶分別對(duì)基因組DNA進(jìn)行單酶切。單酶切反應(yīng)體系中分別加入EcoRⅠ 20 U、HpaⅡ 10 U、MspⅠ 20 U，濃度為250 ng·μL-1的模板DNA 3 μL，10×CutSmart Buffer緩沖液5 μL，加滅菌去離子水至50 μL，混勻后放入水浴鍋中37℃恒溫酶切，將EcoRⅠ、HpaⅡ和MspⅠ的酶切時(shí)間分別設(shè)定為4、10、10 h。②選用HpaⅡ/EcoRⅠ和MspⅠ/EcoRⅠ兩組內(nèi)切酶分別對(duì)基因組DNA進(jìn)行分步雙酶切。50 μL體系中，先加入10 UEcoRⅠ，5 μL 10×CutSmart Buffer，基因組DNA模板750 ng，再加入加滅菌ddH2O至50 μL，混勻后用水浴鍋37℃恒溫酶切4 h，最后分別加入HpaⅠ 20 U或MspⅠ 10 U酶切10 h。③選取HpaⅡ/EcoRⅠ和MspⅠ/EcoRⅠ兩組內(nèi)切酶分別對(duì)基因組DNA進(jìn)行同步雙酶切。50 μL體系中包括：750 ng基因組DNA，10×CutSmart Buffer緩沖液5 μL，MspⅠ 10 U，HpaⅡ和EcoRⅠ各20 U，ddH2O補(bǔ)至50 μL，37℃恒溫酶切10 h。所有體系酶切完畢后，均65℃滅活20 min，并取6 μL酶切產(chǎn)物于1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.3.2 連接體系

連接反應(yīng)體系包括24 μL上述完全雙酶切產(chǎn)物，以EcoRⅠ/HpaⅡ同步酶切組合為標(biāo)準(zhǔn)(下同)，1 μLEcoRⅠ(5 μmol·L-1)或HpaⅡ(50 μmol· L-1)接頭，接頭在加入反應(yīng)體系之前先合為雙鏈(95℃變性5 min，緩慢降至室溫)，3 μL 10×T4ligase Buffer，T4連接酶(350 U·μL-1)用量為350 U，加滅菌ddH2O至30 μL，混勻后于水浴鍋中16℃連接過(guò)夜(12～16 h)。連接產(chǎn)物70℃滅活15 min，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 預(yù)擴(kuò)增正交反應(yīng)體系

用E-00/HM-00引物組合對(duì)連接產(chǎn)物進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增，反應(yīng)總體積為20 μL。為確定MSAP預(yù)擴(kuò)增體系中連接產(chǎn)物用量和Mg2+、dNTPs、引物、TaqDNA聚合酶的濃度5個(gè)因素的最佳水平，根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)單因子考察結(jié)果，初步設(shè)定預(yù)擴(kuò)增的各因素水平范圍，試驗(yàn)采用L16(45)正交設(shè)計(jì)，各因素反應(yīng)條件和L16(45)設(shè)計(jì)方案分別見(jiàn)表1～2。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，56℃退火1 min，72℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。預(yù)擴(kuò)后取5 μL預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，凝膠分析系統(tǒng)記錄保存結(jié)果。剩余產(chǎn)物-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

表1橡膠樹(shù)MSAP預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)體系各因素體積水平

Table1FactorsandtheirvolumelevelsofMSAPpre-amplificationreactionsystemforH.brasiliensis(μL)

水平Levels因素FactorsMg2+(25mmol·L-1)dNTPs(2．5mmol·L-1)引物(10μmol·L-1)TaqDNA聚合酶(5U·L-1)模版DNA10．0750．0750．10．1120．10．10．20．2230．1250．1250．30．3340．150．150．40．44

表2橡膠樹(shù)MSAP預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)體系各因素水平L16(45)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

Table2L16(45)orthogonaldesignoffactorsandtheirvolumelevelsinreactionsystemforMSAPpre-amplificationfromH.brasiliensis

編號(hào)Codes因素FactorsMg2+(25mmol·L-1)dNTPs(2．5mmol·L-1)引物(10μmol·L-1)Taq聚合酶(5U·L-1)模版DNA10．0750．0750．10．1120．0750．10．20．2230．0750．1250．30．3340．0750．150．40．4450．10．0750．20．3460．10．10．10．4370．10．1250．40．1280．10．150．30．2190．1250．0750．30．42100．1250．10．40．31110．1250．1250．10．24120．1250．150．20．13130．150．0750．40．23140．150．10．30．14150．150．1250．20．41160．150．150．10．32

表3橡膠樹(shù)MSAP選擇性擴(kuò)增反應(yīng)體系因素及水平數(shù)

Table3FactorsandtheirlevelnumbersofMSAPselectiveamplificationreactionsystemforH.brasiliensis

水平Levels因素FactorsMg2+(25mmol·L-1)dNTPs(2．5mmol·L-1)引物(10μmol·L-1)TaqDNA聚合酶(5U·L-1)預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋倍數(shù)10．0750．0750．10．11020．10．10．20．22030．1250．1250．30．33040．150．150．40．440

表4橡膠樹(shù)MSAP選擇性擴(kuò)增反應(yīng)體系各因素水平L16(45)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

Table4L16(45)orthogonaldesignoffactorsandtheirlevelsinreactionsystemforMSAPselectiveamplificationfromH.brasiliensis

編號(hào)Codes因素FactorsMg2+(25mmol·L-1)dNTPs(2．5mmol·L-1)引物(10μmol·L-1)TaqDNA聚合酶(5U·L-1)預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋倍數(shù)10．0750．0750．10．11020．0750．10．20．22030．0750．1250．30．33040．0750．150．40．44050．10．0750．20．34060．10．10．10．43070．10．1250．40．12080．10．150．30．21090．1250．0750．30．420100．1250．10．40．310110．1250．1250．10．240120．1250．150．20．130130．150．0750．40．230140．150．10．30．140150．150．1250．20．410160．150．150．10．320

1.3.4 選擇性擴(kuò)增正交反應(yīng)體系

在前期預(yù)實(shí)驗(yàn)單因子考察的基礎(chǔ)上，選用E+3/HM+3引物組合對(duì)稀釋后的預(yù)擴(kuò)增最佳組合的產(chǎn)物進(jìn)行選擇性擴(kuò)增，反應(yīng)總體積為20 μL，包含不同稀釋倍數(shù)的預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物1.0 μL。并仍采用L16(45)正交試驗(yàn)確定選擇性擴(kuò)增反應(yīng)中的預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋倍數(shù)和Mg2+、dNTPs、引物、TaqDNA聚合酶的濃度5個(gè)因素的最佳反應(yīng)條件。各因素水平和正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分別見(jiàn)表3～4。PCR反應(yīng)采用Touchdown程序：95℃ 5 min；94℃ 30 s，65℃ 30 s(每循環(huán)下降0.7℃)，72℃ 1 min，共12個(gè)循環(huán)；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，共24個(gè)循環(huán)；最后于72℃延伸10 min。取5 μL選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.4 橡膠樹(shù)基因組DNA的MSAP分析

選用E-ATT+H/M-TAA，E-ATT+H/M-TAT，E-ATT+H/M-TAG，E-ATT+H/M-TAC，E-ATT+H/M-TTA，E-ATT+H/M-TTT，E-ATT+H/M-TTG，E-ATT+H/M-TTC，E-ATT+H/M-TGA，E-ATT+H/M-TGT，E-ATT+H/M-TGG，E-ATT+H/M-TGC，E-ATT+H/M-TCA，E-ATT+H/M-TCT，E-ATT+H/M-TCG和E-ATT+H/M-TCC 12對(duì)選擇性擴(kuò)增引物，利用優(yōu)化后的選擇性擴(kuò)增體系分別對(duì)高割線樹(shù)和低割線樹(shù)葉片進(jìn)行MSAP分析，選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物變性后取5.0～8.0 μL進(jìn)行6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，銀染后獲得指紋圖譜，用以研究2種不同割線橡膠樹(shù)之間DNA甲基化的變化情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 橡膠樹(shù)葉片基因組DNA質(zhì)量檢測(cè)

通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳和核酸蛋白測(cè)定儀對(duì)采用改良CTAB法提取的葉片基因組DNA的完整性和純度進(jìn)行檢測(cè)。從圖1可以看出，基因組DNA帶型完整，銳度好，上樣孔處無(wú)蛋白質(zhì)和多糖殘留，泳道無(wú)拖尾，無(wú)RNA，沒(méi)有DNA降解；純度檢測(cè)結(jié)果顯示，D260/D280值在1.78～1.80，D320值在0.002～0.004，說(shuō)明提取的DNA完整性好、純度高，完全符合橡膠樹(shù)MSAP技術(shù)對(duì)DNA質(zhì)量的要求。

圖1 橡膠樹(shù)全基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)圖 1～6.橡膠樹(shù)基因組總DNA；M. 2000的分子量標(biāo)準(zhǔn)Fig.1 Agarose gel electrophoresis of total genomic DNA extraction from H.brasiliensis 1-6.Total genomic DNA of H.brasiliensis; M. Molecular weight standard

2.2 橡膠樹(shù)基因組DNA的MSAP體系優(yōu)化2.2.1 酶切體系

為考察EcoRⅠ、MspⅠ和HpaⅡ酶切的效果，分別用此三種限制性內(nèi)切酶對(duì)基因組DNA進(jìn)行單酶切、分步酶切和同步酶切。酶切產(chǎn)物電泳檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2。從圖2可看出，EcoRⅠ、MspⅠ和HpaⅡ單酶切后的泳道上主條帶消失，條帶皆為彌散狀態(tài)，且分布特征與高頻酶和低頻酶相符，表明酶切完全。而且分步酶切和同步酶切泳道內(nèi)均呈彌散狀，沒(méi)有單一分子量的DNA條帶出現(xiàn)，表明酶切充分，其片段大小均滿足MSAP技術(shù)對(duì)DNA的要求，可進(jìn)行后續(xù)的連接反應(yīng)。但由于同步酶切較分步酶切節(jié)約酶切時(shí)間4 h，避免因水浴時(shí)間過(guò)長(zhǎng)而導(dǎo)致的模板DNA的降解，故選擇同步酶切為最佳酶切體系，最終的50 μL同步酶切體系中含有模板DNA 750 ng、EcoRⅠ 20 U、MspⅠ 10 U/HpaⅡ 20 U，酶切時(shí)間為10 h。

圖2 不同方式酶切的橡膠樹(shù)基因組DNA電泳圖譜 1.EcoRⅠ/HpaⅡ分步酶切；2.EcoRⅠ/MspⅠ分步酶切；3.陽(yáng)性對(duì)照；4.HpaⅡ單酶切；5.MspⅠ單酶切；6.EcoRⅠ單酶切；7.EcoRⅠ/HpaⅡ同步酶切；8：EcoRⅠ/MspⅠ同步酶切；M. 2000的分子量標(biāo)準(zhǔn)Fig.2 Agarose gel electrophoresis of Hevea brasiliensis genomic DNA digested with enzyme by different ways 1.Fractional digestion of EcoRⅠ/HpaⅡ; 2.Fractional digestion of EcoRⅠ/MspⅠ; 3.Positive control; 4.HpaⅡ single enzyme digestion; 5.MspⅠ single enzyme digestion; 6.EcoRⅠ single enzyme digestion; 7.Synchronous digestion of EcoRⅠ/HpaⅡ; 8.Synchronous digestion of EcoRⅠ/MspⅠ; M.Molecular weight standard

2.2.2 預(yù)擴(kuò)增

對(duì)16個(gè)處理的預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物電泳(圖3)分析表明，PCR擴(kuò)增結(jié)果存在明顯差異。從圖3中可見(jiàn)，1～16泳道中第1、2、6、8、11、12、15、16泳道的預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物主要集中在500～1 000 bp，產(chǎn)物片段過(guò)大，不符合MSAP對(duì)預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物的要求。而第5、9、10、13泳道的預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物的量相對(duì)較少，可能會(huì)導(dǎo)致后續(xù)的選擇性擴(kuò)增不能順利進(jìn)行。盡管第3、7泳道的預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物片段主要集中在100～750 bp，條帶彌散且產(chǎn)物的量足以進(jìn)行選擇性擴(kuò)增，但是這兩個(gè)體系在100～500 bp擴(kuò)增產(chǎn)物量太少，同樣也不利于后續(xù)試驗(yàn)。處理4和14預(yù)擴(kuò)增體系的條帶主要集中在100～750 bp，呈彌散狀，預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物濃度相對(duì)較高，符合MSAP對(duì)預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物的要求。最終確定處理14為最佳預(yù)擴(kuò)增體系，即20 μL總體積中，含連接產(chǎn)物4 μL，MgCl2(25 mmol·L-1)0.15 μL，dNTPs(2.5 mmol·L-1)0.1 μL，預(yù)擴(kuò)增引物(10 μmol·L-1)0.3 μL，TaqDNA聚合酶(5 U·μL-1) 0.1 μL，10×PCR Buffer 2 μL。

2.2.3 選擇性擴(kuò)增

對(duì)所有正交處理選擇性擴(kuò)增的產(chǎn)物電泳(圖4)分析表明，PCR擴(kuò)增結(jié)果存在明顯差異。從圖3中可看出，第1、2、6、9、15、16泳道片段主要集中在250～2 000 bp，背景涂布較明顯；第5、8、10、11、12、13、14泳道存在少量的非特異性擴(kuò)增條帶；處理3、4、7選擇性擴(kuò)增體系擴(kuò)增效果好，背景無(wú)涂布現(xiàn)象，條帶清晰，主條帶亮度較高，無(wú)明顯的非特異性擴(kuò)增且擴(kuò)增的多態(tài)性條帶主要集中在100～500 bp，符合MSAP中選擇性擴(kuò)增對(duì)產(chǎn)物的要求。由于在考慮結(jié)果的同時(shí)也要兼顧試驗(yàn)成本的節(jié)約，所以最終選擇第7號(hào)體系為選擇性擴(kuò)增的最佳體系比較合理，即20 μL總體積中，含稀釋20倍的預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物2 μL，MgCl2(25 mmol·L-1) 0.1 μL，dNTPs(2.5 mmol·L-1) 0.125 μL，選擇性擴(kuò)增引物(10 μmol·L-1)各0.4 μL，TaqDNA聚合酶(5 U·μL-1)0.1 μL，10×PCR Buffer 2 μL。

2.3高低割線橡膠樹(shù)株間DNA甲基化模式與水平分析

利用優(yōu)化后的橡膠樹(shù)MSAP反應(yīng)體系，對(duì)高割線和低割線橡膠樹(shù)單株進(jìn)行了DNA甲基化多態(tài)性分析，通過(guò)6%尿素變性聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)12對(duì)引物擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖4所示。對(duì)圖4進(jìn)行直觀分析可見(jiàn)(圖5)，每對(duì)引物在2種割株中的擴(kuò)增均獲得清晰的擴(kuò)增譜帶。由MSAP電泳圖譜分析顯示(表5)，在高割線樹(shù)和低割線樹(shù)中擴(kuò)增出的條帶數(shù)分別為266和291。高割線樹(shù)和低割線樹(shù)中均有3種甲基化模式存在，I型條帶(去甲基化位點(diǎn))數(shù)目最多，約占擴(kuò)增產(chǎn)物總數(shù)的63.18%以上，Ⅲ型條帶(全甲基化位點(diǎn))占31.63%左右，Ⅱ型條帶(半甲基化位點(diǎn))相對(duì)較少約5.19%。但在2種膠樹(shù)間未檢測(cè)出有甲基化模式差異的多態(tài)性位點(diǎn)。

圖3 正交優(yōu)化預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖譜 1～16. L16(45)正交試驗(yàn)中不同處理編號(hào)；M. 2000的分子量標(biāo)準(zhǔn) 下同。Fig.3 Agarose gel electrophoresis map of optimized pre-amplification products using orthogonal designs 1-16. Treatments of orthogonal designs number 1 to 16; M. Molecular weight standard The same as below.

圖4 正交優(yōu)化選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜Fig.4 Electrophoresis map of optimized selective amplification products by orthogonal designs

圖5 高割線橡膠樹(shù)和低割線橡膠樹(shù)基因組DNA的MSAP擴(kuò)增圖譜 1、2、5、6、9、10、13、14、17、18、21、22、25、26、29、30、33、34、37、38、41、42、45、46. 高割線橡膠樹(shù)基因組DNA；3、 4、7、8、11、12、15、16、19、20、23、24、27、28、31、32、35、36、39、40、43、44、47、48. 低割線橡膠樹(shù)基因組DNA；奇數(shù)泳道. EcoRⅠ/HpaⅡ酶切與擴(kuò)增產(chǎn)物；偶數(shù)泳道. EcoRⅠ/MspⅠ酶切與擴(kuò)增產(chǎn)物；1～4.E-ATT/HM-TAA；5～8.E-ATT/HM-TAT；9～12.E-ATT/HM-TAG；13～16.E-ATT/HM-TAC；17～20.E-ATT/HM-TTA；21～24.E-ATT/HM-TTT；25～28.E-ATT/HM-TTG；29～32.E-ATT/HM-TTC；33～36.E-ATT/HM-TGA；37～40.E-ATT/HM-TGT；41～44.E-ATT/HM-TGG；45～48.E-ATT/HM-TGC；M. 2000的分子量標(biāo)準(zhǔn)(變性為單鏈)Fig.5 MSAP profiles of H.brasiliensis genomic DNA between high tapping cut and low tapping cut 1,2,5,6,9,10,13,14,17,18,21,22,25,26,29,30,33,34,37,38,41,42,45,46. High tapping cut H.brasiliensis genomic DNA; 3,4,7,8,11,12,15,16,19,20,23,24,27,28,31,32,35,36,39,40,43,44,47,48. Low tapping cut H.brasiliensis genomic DNA; Odd number of lanes. Fragments obtained after digestion with EcoRⅠ/HpaⅡ and amplification by PCR; Even number of lanes. Fragments obtained after digestion with EcoRⅠ/MspⅠ and amplification by PCR; 1～4.E-ATT/HM-TAA; 5～8.E-ATT/HM-TAT; 9～12.E-ATT/HM-TAG; 13～16.E-ATT/HM-TAC; 17～20.E-ATT/HM-TTA; 21～24.E-ATT/HM-TTT; 25～28.E-ATT/HM-TTG; 29～32.E-ATT/HM-TTC; 33～36.E-ATT/HM-TGA; 37～40.E-ATT/HM-TGT; 41～44.E-ATT/HM-TGG; 45～48.E-ATT/HM-TGC; M. Molecular weight standard(denatured single-stranded DNA)

Table5ComparisonofgenomicDNAmethylationlevelintwokindsofH.brasiliensisofdifferenttappingcuts

類型Type高割線樹(shù)Hightappingcutplants低割線樹(shù)Lowtappingcutplants總擴(kuò)增條帶數(shù)Totalamplifiedbands266291半甲基化條帶數(shù)Hemimethylationbands1316全甲基化條帶數(shù)Fullmetylationbands8690半甲基化率Hemimetylatedrate4．89%5．50%全甲基化率Fullmetylationrate32．33%30．93%總甲基化率Totalmethylationrate37．22%36．43%

MSAP圖譜分析還顯示，高割線樹(shù)和低割線樹(shù)甲基化總帶數(shù)分別為99和106，總甲基化率分別為37.22%和36.43%。高割線樹(shù)中，4.89%為半甲基化位點(diǎn)，32.33%為全甲基化位點(diǎn)。低割線樹(shù)中，5.50%為半甲基化位點(diǎn)，30.93%為全甲基化位點(diǎn)(表5)。在2種開(kāi)割膠樹(shù)中，全甲基化的比例均比半甲基化的高。因此推斷高低割線樹(shù)中胞嘧啶甲基化的主要模式可能是CpG型。上述結(jié)果說(shuō)明本研究建立的MSAP優(yōu)化體系可用于橡膠樹(shù)DNA甲基化多樣性分析。

3 討論

本試驗(yàn)基于MSAP反應(yīng)體系預(yù)實(shí)驗(yàn)中了解的各因素的用量或濃度水平范圍，結(jié)合單因素和正交試驗(yàn)法著重對(duì)橡膠樹(shù)MSAP反應(yīng)體系中酶切和預(yù)擴(kuò)增及選擇性擴(kuò)增體系進(jìn)行了優(yōu)化，成功建立了橡膠樹(shù)MSAP分析技術(shù)體系，即：50 μL雙酶切體系中，750 ng橡膠樹(shù)模板DNA經(jīng)10 h同步酶切和12 h以上16℃連接后，取4 μL酶連產(chǎn)物進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增，為減少非特異性擴(kuò)增和保證足夠的選擇性擴(kuò)增模板，以稀釋20～40倍的預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物用于選擴(kuò)，選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物圖譜通過(guò)6%聚丙烯酰胺凝膠顯示，圖譜穩(wěn)定、帶型完整清晰、多態(tài)性豐富。

在優(yōu)化體系的過(guò)程中同時(shí)發(fā)現(xiàn)，MSAP技術(shù)體系對(duì)DNA模板質(zhì)量和試樣質(zhì)量的要求都非常高，首先要求樣品采集應(yīng)盡量選用同一發(fā)育時(shí)期的嫩葉片，采集古銅期大小葉最佳，其原因是橡膠樹(shù)葉片的形成經(jīng)歷小葉古銅期、大葉古銅期、淡綠期、變色期和穩(wěn)定期5個(gè)階段，以及DNA甲基化水平易受環(huán)境的影響。然后要求提取的DNA既要保證完整性，又要保證無(wú)糖、蛋白質(zhì)和RNA的殘留，其理由是提取的DNA在含有多糖、多酚和蛋白質(zhì)等物質(zhì)的情況下，甚至有殘留的乙醇和TE緩沖液，都容易造成酶切不完全，結(jié)果導(dǎo)致較多大片段帶型出現(xiàn)[36]?？梢?jiàn)制備高質(zhì)量的基因組DNA是MSAP技術(shù)體系分析成敗的首要前提。因此本文采用改進(jìn)的CTAB提取DNA，所提取的DNA的質(zhì)量和濃度均符合MSAP對(duì)DNA模板所要求的標(biāo)準(zhǔn)。

基因組DNA的酶切產(chǎn)物質(zhì)量是決定MSAP成敗的關(guān)鍵。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)在50 μL反應(yīng)體系中加入EcoRⅠ和HpaⅡ各10 U，或EcoRⅠ20 U和MspⅠ 10 U同步酶切基因組DNA 10 h，實(shí)現(xiàn)雙酶酶切方法的摸索，保證了酶切反應(yīng)完全的同時(shí)又防止模板DNA降解和節(jié)省試驗(yàn)時(shí)間；避免了高分子量片段的擴(kuò)增，使多態(tài)性條帶集中在100～750 bp，清晰可辨。酶切體系應(yīng)適宜，體系過(guò)小，酶切反應(yīng)不充分；HapⅡ、MspⅠ宜用5倍的高濃度酶，但酶量不得超過(guò)反應(yīng)總體系的10%。

預(yù)擴(kuò)增和選擇性擴(kuò)增也是影響MSAP的關(guān)鍵步驟。對(duì)預(yù)擴(kuò)增正交試驗(yàn)的單因素分析表明，模板用量和引物用量是影響預(yù)擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵因素。模板用量和引物用量同時(shí)或單個(gè)過(guò)低都會(huì)導(dǎo)致預(yù)擴(kuò)增片段分子量范圍整體偏上，如1、2、6、8、11、12、15、16號(hào)體系，各體系均無(wú)法達(dá)到預(yù)擴(kuò)增對(duì)產(chǎn)物的要求，反之，隨著模板用量和引物用量的一同升高，預(yù)擴(kuò)增片段分子量范圍整體下移，如體系4和14，兩體系均達(dá)到預(yù)擴(kuò)增對(duì)產(chǎn)物的要求。dNTP濃度和TaqDNA聚合酶濃度對(duì)預(yù)擴(kuò)增結(jié)果有較大的影響，當(dāng)反應(yīng)體系中的dNTPs濃度較高而Mg2+濃度較低時(shí)，多余的dNTPs會(huì)與Mg2+結(jié)合，致使Mg2+濃度降低，進(jìn)而顯著降低Taq酶的酶活力[37]，鑒于這一現(xiàn)象，需考慮提高Taq聚合酶濃度與dNTPs競(jìng)爭(zhēng)Mg2+，避免PCR反應(yīng)的催化不足，如體系4。而當(dāng)反應(yīng)體系的dNTPs濃度和Taq聚合酶濃度都較低且前高后低失衡時(shí)，可通過(guò)提高M(jìn)g2+濃度來(lái)滿足Taq酶對(duì)Mg2+的需求，如體系14，選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物分析表明，以本體系實(shí)驗(yàn)產(chǎn)物為模板擴(kuò)增的多態(tài)性條帶充足，試驗(yàn)結(jié)果真實(shí)、可靠，且節(jié)約試驗(yàn)成本。但當(dāng)dNTPs濃度過(guò)低時(shí)，由于dNTPs不能為PCR反應(yīng)提供充足的能量，為此會(huì)降低產(chǎn)物的產(chǎn)量[38]，如1、5、9、13號(hào)體系，即使引物、Mg2+和Taq聚合酶濃度較高，仍會(huì)降低產(chǎn)物的產(chǎn)量，如體系9和13。此外，當(dāng)dNTPs濃度較低時(shí)，DNA模板量過(guò)少也會(huì)降低PCR產(chǎn)物的量，如體系10。從選擇性擴(kuò)增分析中發(fā)現(xiàn)模板稀釋倍數(shù)和引物用量是影響選擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵因素，模板稀釋倍數(shù)和引物用量同時(shí)或單個(gè)過(guò)低都會(huì)導(dǎo)致非特異擴(kuò)增明顯增多，如1、2、6、15、16號(hào)體系。dNTPs濃度過(guò)低，即使模板稀釋倍數(shù)和引物用量較高，非特異擴(kuò)增也會(huì)明顯增多，如體系9。隨著稀釋倍數(shù)、引物用量和dNTPs濃度的增大，選擴(kuò)增產(chǎn)物中的非特異擴(kuò)增明顯減少，如3、4、7號(hào)體系。

本研究首次采用優(yōu)化后的橡膠樹(shù)MSAP反應(yīng)體系對(duì)高割線和低割線橡膠樹(shù)單株進(jìn)行甲基化模式分析，即使使用少部分引物組合，兩種膠樹(shù)中的I/Ⅱ/Ⅲ型甲基化模式均能被該方法檢測(cè)到，并對(duì)高割線樹(shù)和低割線樹(shù)的全基因組甲基化水平做了對(duì)比評(píng)估，高低割線樹(shù)葉片基因組甲基化水平無(wú)明顯差異?？赡苡捎谒靡锝M合數(shù)量有限和割線變化對(duì)葉片DNA甲基化影響較小的原因，未能夠檢測(cè)出兩種膠樹(shù)間可能存在的甲基化模式不同的多態(tài)性位點(diǎn)。仍可進(jìn)一步證實(shí)本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化后建立的MSAP技術(shù)反應(yīng)體系適于橡膠樹(shù)DNA甲基化分析，且能區(qū)分不明顯的甲基化水平差異，為橡膠樹(shù)對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性表觀遺傳研究奠定了基礎(chǔ)。

盡管吳春太等于2011年建立的橡膠樹(shù)MSAP熒光標(biāo)記技術(shù)體系具有檢測(cè)位點(diǎn)多，帶型易辨、多態(tài)性高和穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，且操作簡(jiǎn)便、快捷、高效，但在克隆多態(tài)性片段進(jìn)行測(cè)序方面存在一定缺陷。同年，李海林等優(yōu)化并建立了橡膠樹(shù)MSAP銀染反應(yīng)體系，其重點(diǎn)是對(duì)選擇性擴(kuò)增體系進(jìn)行優(yōu)化。針對(duì)橡膠樹(shù)基因組MSAP銀染反應(yīng)體系而論，本研究在選擇性擴(kuò)增體系中優(yōu)選出的Mg2+、dNTPs、引物濃度分別比李海林等最佳組合選擇性擴(kuò)增體系中確定的量超出66.67%、25.00%、166.67%，而Taq聚合酶用量減半，由于Taq酶在費(fèi)用項(xiàng)目中所占權(quán)重大，實(shí)則節(jié)約DNA甲基化檢測(cè)成本[32]。此外，‘熱研7-33-97’高低割線2種樹(shù)的總甲基化平均率為36.83%，比接穗芽片來(lái)自不同部位的‘熱研8-79’老幼態(tài)無(wú)性系的均值高出9.72%[33～34]，但比繁殖方式不同的‘熱研7-33-97’老幼態(tài)無(wú)性系的均值降低17.38%[31]，其原因可能與品種基因型及其樹(shù)齡的差異有關(guān)。除‘熱研7-33-97’老幼態(tài)無(wú)性系全甲基化的平均比例略低于半甲基化的值外，‘熱研7-33-97’高低割線樹(shù)全甲基化的平均比例和‘熱研8-79’老幼態(tài)無(wú)性系的平均比例均比各自半甲基化的值高。綜上可知，橡膠樹(shù)基因組甲基化程度與狀態(tài)是豐富多變的。

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National Natural Science Foundation of China(No.31270713)；Fundamental Research Funds for Rubber Research Institute,CATAS(No.1630022012008)

introduction：WU Chun-Tai(1972—),male,Ph.D.,associate researcher, experimental area engaged primarily in study on the characteristic of producing-rubber ofHeveabrasiliensis.

date:2016-03-25

OptimizationofMSAPAnalysisSystemforHeveabrasiliensisandItsApplicationinPlantofDifferentHeightsofOpeningforTapping

WU Chun-Tai1BAN Shuo1,2LI Yu1ZENG Ri-Zhong1*

(1.Rubber Research Institute,Chinese Academy of Tropical Agriculture Sciences/Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Rubber Tree,Ministry of Agriculture,the People’s Republican of China/State Center for Rubber Breeding/Hainan Provincial Key Laboratory of Physiology for Tropical Crops,Danzhou 571737；2.College of Plant Science and Technology,Huazhong Agricultural University,Hubei,Wuhan 430070)

Using the tender leaves ofHeveabrasiliensisvariety ‘CATAS 7-33-97’ as materials, several key influencing factors in leaf genomic DNA restriction enzyme digestion, pre-amplification and selective amplification system which affected the system quality of MSAP were optimized through the single factor and orthogonal design method in order to obtain the optimal MSAP reaction system of rubber tree. The optimized reaction system of MSAP was used for difference analysis of DNA methylation in two kinds ofH.brasiliensisof high and low tapping cuts. The results showed that 750 ng genomic DNA in a reaction volume of 50 μL could be fully digested byEcoRⅠ 20 U,HpaⅡ 20 U orMspⅠ 10 U at 37℃ for 10 h. MSAP-PCR pre-amplification was performed in 20 μL of reaction volume with the following mix: ligation products 4 μL, MgCl2(25 mmol·L-1)0.15 μL, dNTPs(2.5 mmol·L-1)0.1 μL,Taqpolymerase(5 U·μL-1) 0.1 μL, 10×PCR Buffer 2 μL, primer E-00/HM-00(10 μmol·L-1) 0.3 μL, respectively. The 20 μL selective reaction mixture contained 20 times diluted amplification products 2 μL, MgCl2(25 mmol·L-1) 0.1 μL, dNTPs(2.5 mmol·L-1) 0.125 μL,Taqpolymerase(5 U·μL-1) 0.1 μL, 10×PCR Buffer 2 μL, primer E+3/HM+3(10 μmol·L-1) 0.4 μL respectively. The total methylation rates of two samples were 37.22% and 36.43%, respectively. The full methylation rates were more than the hemi-methylation rates inH.brasiliensisof different tapping cuts. Therefore, CpG methylation may represent the major form of DNA methylation in rubber tree. Our data indicated that this MSAP reaction system with high stability and reliablity and good reproducibility have provided the foundation for different degree tapping stress of rubber tree associated research with the MSAP technology.

Heveabrasiliensisof high and low tapping cuts;DNA methylation;methylation sensitive amplified polymorphism(MSAP);system optimization

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31270713)；橡膠研究所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)資助項(xiàng)目(1630022012008)

吳春太(1972—)，男，博士，副研究員，主要從事橡膠樹(shù)產(chǎn)膠特性研究。

* 通信作者：E-mail:hnzrz@aliyun.com

2016-03-25

* Corresponding author：E-mail:hnzrz@aliyun.com

S794.1

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2016.06.009