當(dāng)歸貝母苦參顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究*

李長天，張珺，吳國泰，石曉峰，邵晶，李威，劉永琦

（1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅蘭州730000；2.甘肅省中藥藥理與毒理學(xué)重點實驗室，蘭州730000；3.甘肅省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院，蘭州730070）

當(dāng)歸貝母苦參顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究*

李長天1，2，張珺1，吳國泰1，2，石曉峰3，邵晶1，2，李威1，劉永琦1

（1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅蘭州730000；2.甘肅省中藥藥理與毒理學(xué)重點實驗室，蘭州730000；3.甘肅省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院，蘭州730070）

目的建立當(dāng)歸貝母苦參顆粒（當(dāng)歸、浙貝母、苦參）的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法采用薄層色譜法對制劑中當(dāng)歸、浙貝母、苦參進(jìn)行定性鑒別，采用高效液相色譜法測定當(dāng)歸貝母苦參顆粒中含阿魏酸、苦參堿量。結(jié)果當(dāng)歸、浙貝母、苦參薄層色譜鑒別方法專屬性強(qiáng)、重現(xiàn)性較好；阿魏酸在0.0316～0.1296 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系（r=0.9998），平均回收率為101.620%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.070%；苦參堿在0.100 0～1.000 0 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系（r= 0.9996），平均回收率為99.180%，RSD為2.040%。結(jié)論該法簡便、靈敏、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可作為當(dāng)歸貝母苦參顆粒的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

當(dāng)歸；浙貝母；苦參；阿魏酸；苦參堿；色譜法，薄層；色譜法，高壓液相

當(dāng)歸貝母苦參顆粒是在東漢著名醫(yī)學(xué)家張仲景創(chuàng)立的當(dāng)歸貝母苦參丸基礎(chǔ)上根據(jù)現(xiàn)代制劑工藝制備的顆粒劑，由當(dāng)歸、浙貝母、苦參3味藥材組成，方中當(dāng)歸補(bǔ)血活血，浙貝母化痰散結(jié)，苦參清熱利濕，諸藥相配共湊養(yǎng)血和血、清熱燥濕、化痰散結(jié)之功效，主要用于肺癌、膀胱癌、前列腺癌、宮頸癌等疾病的治療，已取得較好臨床療效［1-2］，目前，有關(guān)當(dāng)歸貝母苦參顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究尚未見報道。本研究采用薄層色譜法對當(dāng)歸、浙貝母、苦參進(jìn)行定性鑒別，采用高效液相色譜法測定當(dāng)歸貝母苦參顆粒中含阿魏酸和苦參堿量，旨在為全面、有效控制當(dāng)歸貝母苦參顆粒質(zhì)量提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1藥物與試劑當(dāng)歸貝母苦參顆粒（批號20140603）由甘肅省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院研制，阿魏酸對照品（批號110773-200611）、苦參堿對照品（批號110805-200508）、貝母素對照品（批號110751-201110）由中國食品藥品檢定研究院提供，甲醇試劑和乙腈試劑為色譜純，其他試劑全部為分析純，水為純凈水。

1.1.2主要儀器Agilent 1100高效液相色譜儀（美國Agilent公司）、AE260萬分之一分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）、CP225D型十萬分之一電子分析天平（德國Sartorius公司）、KQ2200B超聲清洗儀器（昆山市超聲儀器有限公司生產(chǎn)）、800型離心沉淀器（上海手術(shù)儀器廠）等。

1.2方法

1.2.1薄層色譜鑒別

1.2.1.1當(dāng)歸薄層色譜鑒別［3-4］取當(dāng)歸貝母苦參顆粒5 g研細(xì)，加1%碳酸氫鈉溶液50.00 mL，超聲提取1.0 h，3 500 r/min離心15 min，將上清液傾出，用稀鹽酸調(diào)pH值為2～3，加乙醚20.00 mL振搖萃取2次，合并乙醚層，水浴蒸干乙醚，殘渣加甲醇1.00 mL溶解后作為供試品溶液；按處方制備不含當(dāng)歸的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制得陰性對照溶液；另取當(dāng)歸藥材1 g，按供試品溶液制備方法制得藥材對照溶液；再取阿魏酸加甲醇制成每毫升含1.0 mg的對照品溶液。按《中國藥典》2010年版一部附錄ⅣB試驗方法分別吸取上述4種溶液各10 μL，點于同一硅膠GF254板上，以乙醚∶三氯甲烷∶甲酸（1∶5∶0.1）為展開劑，展開取出晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。

1.2.1.2苦參薄層色譜鑒別［4］取當(dāng)歸貝母苦參顆粒5 g研細(xì)，加蒸餾水30.00 mL，超聲提取0.5 h，過濾，濾液移至分液漏斗中，加三氯甲烷40.00 mL、濃氨試液1.00 mL，振搖萃取，靜置后收集三氯甲烷層，水浴蒸干溶劑，殘渣加甲醇1.00 mL溶解后作為供試品溶液；按處方制備不含苦參的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制得陰性對照溶液；另取苦參藥材2 g，加乙醇20.00mL，超聲提取30min，濾過，濾液蒸干，殘渣加水20.00 mL溶解后按樣品處理法制成藥材對照溶液；另取苦參堿適量加甲醇制成每毫升含1.0 mg的對照品溶液。按2010年版《中國藥典》附錄ⅣB試驗方法分別吸取以上4種溶液各10 μL，點于同一硅膠G薄層板上，以氯仿∶甲醇∶濃氨（8∶1∶0.1）為展開劑，展開取出晾干，噴以稀碘化鉍鉀溶液。

1.2.1.3浙貝母薄層色譜鑒別［3-4］取當(dāng)歸貝母苦參顆粒5 g研細(xì)，加蒸餾水30.00 mL，超聲提取0.5 h，移至分液漏斗中加三氯甲烷40.00 mL，濃氨試液1.00 mL，振搖萃取，靜置后收集三氯甲烷層，水浴蒸干溶劑，殘渣加甲醇1.00 mL溶解后作為供試品溶液；按處方制備不含浙貝母的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制得陰性對照溶液；另取浙貝母藥材2 g，加乙醇20.00 mL，超聲提取30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加水20.00mL溶解后按樣品處理法制成藥材對照溶液；再取貝母素乙加甲醇制成每毫升含1.0 mg的對照品溶液。按《中國藥典》2010年版附錄ⅣB試驗方法分別吸取上述4種溶液各10 μL，點于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯∶甲醇∶濃氨∶水（4∶2∶1∶0.1）為展開劑，展開取出晾干，噴以稀碘化鉍鉀溶液。

1.2.2含苦參堿量測定［5-6］

1.2.2.1色譜條件色譜柱為Thermo BETASIL C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；乙腈∶水（27∶73）為流動相；220 nm處檢測；流速為1.0 mL/min；柱溫為40℃；按苦參堿峰計算理論板數(shù)不低于3 000。

1.2.2.2對照品制備精密稱取苦參堿適量加甲醇配制成每毫升含0.2 mg的溶液，即可。

1.2.2.3供試品制備取當(dāng)歸貝母苦參顆粒適量研細(xì)，精密稱取1.0 g置于錐形瓶內(nèi)，加入氨試液1.00 mL，精密加入三氯甲烷20.00 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲提取0.5 h，再次稱質(zhì)量，用三氯甲烷補(bǔ)足缺失的質(zhì)量，過濾，濾液轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，靜置后放出三氯甲烷溶液，精密吸取2.00 mL，蒸干，殘渣用甲醇溶液溶解，并轉(zhuǎn)移至10.00 mL容量瓶中，加甲醇溶液至刻度，濾過，取續(xù)濾液即為供試品溶液。

1.2.2.4陰性對照品制備按當(dāng)歸貝母苦參顆粒處方工藝制備不含苦參的陰性樣品，按“1.2.2.3”項的方法制備陰性對照品溶液。

1.2.2.5線性關(guān)系考察精密吸取“1.2.2.2”項制備的溶液2.50 mL，置5.00 mL于容量瓶中，加甲醇定容至刻度，得0.10 mg/mL對照品溶液。分別精密吸取0.05、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50 mL至1.00 mL容量瓶中加甲醇稀釋至刻度，搖勻，各進(jìn)樣20 μL，按“1.2.2.1”項色譜條件測定峰面積，并以為苦參堿濃度為橫坐標(biāo)、峰面積值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2.6精密度研究精密吸取“1.2.2.2”項制備的溶液20 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，計算苦參堿峰面積。

1.2.2.7穩(wěn)定性研究精密吸取“1.2.2.3”項制備的溶液20 μL，按“1.2.2.1”項色譜條件分別于0、2.0、4.0、6.0、8.0、24.0 h進(jìn)樣測定含苦參堿量。

1.2.2.8重復(fù)性研究取當(dāng)歸貝母苦參顆粒適量研細(xì)，精密稱定6份，每份1.0 g，按“1.2.2.3”項的方法制成供試液，進(jìn)樣測定含苦參堿量。

1.2.2.9加樣回收率研究取當(dāng)歸貝母苦參顆粒適量研細(xì)，精密稱定6份，每份0.5 g，分別向每份中加入苦參堿溶液（0.99 mg/mL）1.00 mL，按“1.2.2.3”項的方法制備，進(jìn)樣20 μL，測定峰面積，計算含苦參堿量。

1.2.2.10樣品含苦參堿量測定按“1.2.2.3”項的方法制備不同批號供試品溶液各3份，按“1.2.2.1”項色譜條件測定含苦參堿量，計算平均值。

1.2.3含阿魏酸量測定［7-10］

1.2.3.1色譜條件色譜柱為Thermo BETASIL C18柱（4.6 mm×250.0 mm，5 μm）；乙腈∶0.1%磷酸水溶液（20∶80）為流動相；316 nm處檢測；流速為1.00 mL/min；柱溫為30℃；以阿魏酸峰計算理論塔板數(shù)不低于3 000。

1.2.3.2對照品制備精密稱取阿魏酸0.005 1 g，加70%甲醇定容至5.00 mL的容量瓶中制成對照品儲備液。精密吸取儲備液0.10 mL移至25.00mL容量瓶中，加70%甲醇稀釋至刻度，得每毫升含4.080 0 μg的溶液，即可。

1.2.3.3供試品制備取當(dāng)歸貝母苦參顆粒適量研細(xì)，精密稱取2.0 g置于錐形瓶中，加70%甲醇溶液（含5%甲酸）20.00 mL，稱質(zhì)量，超聲提取1.0 h，放置后補(bǔ)足缺失的質(zhì)量，所得提取液按3 000 r/min離心15 min，取上清液5.00 mL，用70%甲醇定容至10.00 mL作為供試品溶液。

1.2.3.4陰性對照品制備按當(dāng)歸貝母苦參顆粒處方工藝制備不含當(dāng)歸的陰性樣品，按“1.2.3.3”項的方法制備陰性對照品溶液。

1.2.3.5線性關(guān)系考察分別精密吸取“1.2.3.2”項溶液50、100、200、400、600、800μL，用70%甲醇定溶至1.00mL，分別吸取上述溶液20 μL，按“1.2.3.1”項色譜條件測定，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)、阿魏酸濃度（X）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。

1.2.3.6精密度研究精密吸取“1.2.3.2”項制備的阿魏酸溶液20 μL，進(jìn)樣6次，計算阿魏酸峰面積。

1.2.3.7穩(wěn)定性研究精密吸取“1.2.3.3”項制備的阿魏酸溶液20 μL，按“1.2.3.1”項色譜條件分別于0、2.0、4.0、6.0、8.0、24.0 h進(jìn)樣測定含阿魏酸量。

1.2.3.8重復(fù)性研究取當(dāng)歸貝母苦參顆粒約2.0 g研細(xì)，精密稱取6份，按“1.2.3.3”項的方法制備成供試液，進(jìn)樣測定含阿魏酸量。

1.2.3.9加樣回收率研究取當(dāng)歸貝母苦參顆粒約2.0 g研細(xì)，精密稱定6份，分別加入阿魏酸對照品溶液（0.079 mg/mL）200 μL，按“1.2.3.3”項的方法制備，進(jìn)樣20 μL，測定峰面積，計算含阿魏酸量。

1.2.3.10樣品含阿魏酸量測定按“1.2.3.3”項的方法制備不同批號供試品溶液各3份，按“1.2.3.1”色譜條件測定含阿魏酸量，計算平均值。

2　結(jié)果

2.1線性關(guān)系苦參堿回歸方程：Y=30.424 6X+17.819 4，r=0.999 6?？鄥A在0.100 0～1.000 0 μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。阿魏酸回歸方程：Y=65.5577X-0.0344，r=0.999 8。阿魏酸在0.031 6～0.129 6 μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

2.2精密度苦參堿相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為1.034%。阿魏酸RSD為0.843%。

2.3穩(wěn)定性苦參堿、阿魏酸RSD均為1.760%，供試溶液均在24.0 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4重復(fù)性平均含苦參堿量為1.988 0 mg/g，RSD為1.330%（n=6）；平均含阿魏酸量為7.560 0 μg/g，RSD為2.200%（n=6）。重復(fù)性均良好。

2.5加樣回收率苦參堿平均加樣回收率為99.180%，RSD為2.040%。阿魏酸平均加樣回收率為101.620%，RSD為1.070%。

2.6薄層色譜鑒別結(jié)果當(dāng)歸、苦參、貝母供試品色譜中分別在與其藥材及對照品色譜相應(yīng)位置上顯示相同顏色熒光斑點，斑點清晰，分離效果好，陰性樣品無干擾，該法專屬性良好，見圖1～3。

圖1　當(dāng)歸薄層色譜鑒別結(jié)果

圖2　苦參薄層色譜鑒別結(jié)果

圖3　浙貝母薄層色譜鑒別結(jié)果

2.7樣品含苦參堿量苦參堿吸收峰分離良好，平均含苦參堿量為2.029 mg/g，RSD為1.250%，見圖4。

圖4　樣品含苦參堿量測定

2.8樣品含阿魏酸量阿魏酸吸收峰分離良好，平均含阿魏酸量為7.340 0 μg/g，RSD為1.290%，見圖5。

圖5　樣品含阿魏酸量測定

3　討論

當(dāng)歸貝母苦參顆粒由當(dāng)歸、浙貝母和苦參3味藥材組成，原方見于張仲景《金匱要略》的當(dāng)歸貝母苦參丸，方中當(dāng)歸養(yǎng)血活血潤燥，浙貝母利肺氣解郁，苦參清熱利濕，除熱結(jié)；當(dāng)歸辛以潤之，苦參苦以泄之，浙貝母入肺經(jīng)，開郁利氣，使其通調(diào)水道下輸膀胱，為水出高源之義，符合中醫(yī)認(rèn)為腫瘤的病因病機(jī)是虛、痰、毒、瘀因素共同作用的觀點，諸藥相配共湊養(yǎng)血和血、清熱燥濕、化痰散結(jié)之功效［2，11］。

現(xiàn)代醫(yī)家將當(dāng)歸貝母苦參丸應(yīng)用于肺癌、膀胱癌、前列腺癌、宮頸癌等疾病的治療取得較好療效［12-13］。本研究應(yīng)用現(xiàn)代提取分離技術(shù)和制劑技術(shù)將傳統(tǒng)當(dāng)歸貝母苦參丸制成顆粒，選擇阿魏酸和苦參堿作為當(dāng)歸貝母苦參顆粒的定量指標(biāo)，結(jié)合當(dāng)歸、浙貝母和苦參的薄層色譜鑒別，能有效控制當(dāng)歸貝母苦參顆粒的質(zhì)量，方法簡單易行，重現(xiàn)性較好，適宜用于當(dāng)歸貝母苦參顆粒的質(zhì)量控制。

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Study on quality standard for Danggui Beimu Kushen Granules*

Li Changtian1，2，Zhang Jun1，Wu Guotai1，2，Shi Xiaofeng3，Shao Jing1，2，Li Wei1，Liu Yongqi1
（1.Gansu University of Chinese Medicine，Lanzhou，Gansu 730000，China；2.Key Laboratory of Pharmacology and Toxicology of Traditional Chinese Medicine in Gansu Province，Lanzhou，Gansu 730000，China；Gansu Provincial Academic Institute for Medical Research，Lanzhou，Gansu730070，China）

ObjectiveTo set up the quality standard for Danggui Beimu Kushen Granules.MethodsTLC was applied to qualitatively identify Angelica sinensis，F(xiàn)ritillaria thunbergⅡ，Sophora flavescens and HPLC was applied to quantitatively determine ferulic acid and matrine in the preparation.ResultsThe TLC identification method of Angelica sinensis，F(xiàn)ritillaria ThunbergⅡand Sophora flavescens had strong specificity and good reproducibility；ferulic acid showed good linear relation in the range of 0.031 6～0.129 6 μg（r=0.999 8）.The average recovery rate of ferulic acid was 101.620%，and RSD was 1.070%；matrine showed good linearity with the peak area in the range of 0.100 0～1.000 0 μg（r=0.999 6）.The average recovery rate was 99.180%and RSD was 2.04%.ConclusionThis methods are simple，sensitive and accurate with good reproducibility，and can be used as the quality control standard of Danggui Beimu Kushen Granules.

Angelica sinensis；Fritillaria thunbergⅡ；Sophora flavescens；ferulic acid；Matrine；Chromatography，thin layer；Chromatography，high pressure liquid

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.12.003

A

1009-5519（2016）12-1785-04

甘肅省財政廳科研業(yè)務(wù)費資助項目（BH-2013-25）。

李長天（1971-），副教授，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)及中藥研發(fā)的教學(xué)與科研工作。

（2016-01-25）