脊髓NMDA受體NR2B參與前列腺炎致跨器官痛覺致敏的機制研究*

陳勇，張建華，趙濤，孫偉，袁夢娟

（重慶市涪陵中心醫(yī)院泌尿外科408000）

脊髓NMDA受體NR2B參與前列腺炎致跨器官痛覺致敏的機制研究*

陳勇，張建華，趙濤，孫偉，袁夢娟

（重慶市涪陵中心醫(yī)院泌尿外科408000）

目的研究N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受體NR2B在慢性前列腺炎性刺激所致的跨器官痛覺過敏中的作用。方法采用完全氟氏佐劑前列腺注射制作慢性前列腺炎大鼠模型，用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)和蛋白質(zhì)印跡技術(shù)分別檢測NMDA受體NR2B亞基mRNA及蛋白表達水平的變化，以及鞘內(nèi)給予NR2B特異性拮抗劑——ifenprodil對NR2B表達的影響。結(jié)果慢性炎性刺激后腰骶段脊髓背角NMDA受體NR2B表達上調(diào)，鞘內(nèi)給予ifenprodil后NR2B在脊髓背角表達下調(diào)。結(jié)論NMDA受體NR2B可能參與了慢性前列腺炎導(dǎo)致的跨器官痛覺致敏，特異性NR2B拮抗可能是臨床治療慢性前列腺炎導(dǎo)致的慢性神經(jīng)病理性痛的潛在策略。

受體，N-甲基-D-天冬氨酸；前列腺炎；跨器官痛覺致敏

近年來，有研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)臟痛除內(nèi)臟軀體牽涉痛外還有另外一個重要特點，即一個病變內(nèi)臟器官的疼痛繼發(fā)性引起相鄰一個正常器官痛覺敏化，進而導(dǎo)致后者功能異常［1］。目前，國外學(xué)術(shù)界傾向于使用“cross-organ sensitization”，國內(nèi)尚無統(tǒng)一譯名，暫譯為“跨器官痛覺致敏”［2］。N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-asparate，NMDA）受體是一種配體門控離子型谷氨酸受體。有研究表明，NMDA受體NR2B亞基在疼痛的產(chǎn)生及中樞性痛覺敏化形成中具有重要作用，是一個潛在的鎮(zhèn)痛治療靶點［3］。作者進行的前期研究發(fā)現(xiàn)，腰骶段脊髓在前列腺炎導(dǎo)致的跨器官痛覺致敏中具有重要作用［4-5］。本研究采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（reversetranscriptase-polymerase chain reaction，RT-PCR）和蛋白質(zhì)印跡（Western blot）技術(shù)定量觀察了脊髓背角NR2B在前列腺炎性刺激后的時程表達變化，同時觀察了鞘內(nèi)給予NR2B拮抗劑后脊髓背角NR2B的表達變化。

1　材料與方法

1.1材料雄性SD大鼠80只，體質(zhì)量180～200 g，由第三軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供，隨機分為假手術(shù)組（24只）、完全氟氏佐劑（complete freund adjuvant，CFA）組（24只）、ifenprodil組（16只）和空白對照組（16只）。

1.2方法

1.2.1模型制作采用1%戊巴比妥腹腔注射麻醉大鼠，取下腹正中切口，CFA組和假手術(shù)組分別于雙側(cè)前列腺腹葉各注射100 μL CFA和等量生理鹽水。術(shù)前，術(shù)后7、14 d分批處死大鼠（每次各8只），觀察脊髓背角NR2B mRNA及蛋白表達變化。ifenprodil組和空白對照組分別于CFA注射2周后行鞘內(nèi)置管術(shù)（各16只），鞘內(nèi)分別給予NR2B選擇性拮抗劑——ifenprodil 200 nmol和等量生理鹽水，持續(xù)注射7、14 d后處死，采用Western blotting技術(shù)觀察NR2B蛋白表達變化。

1.2.2NR2B蛋白表達的檢測采用戊巴比妥鈉麻醉大鼠并斷頭處死。取L1～2段雙側(cè)脊髓背部部分，用預(yù)冷磷酸鹽緩沖液沖洗組織后置入離心管中。稱質(zhì)量并分別標(biāo)記。采用常規(guī)方法提取蛋白，Lowry測定蛋白含量，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝膠電泳，蛋白轉(zhuǎn)?。?50 mA，3 h），免疫印跡及檢測（NR2B兔多克隆抗體1∶200稀釋），凝膠掃描系統(tǒng)分析蛋白條帶吸光度，用Quantity One4.4軟件分析圖像，用積分光密度值（integrated optical density，IOD）比較蛋白的表達。

1.2.3NR2B mRNA表達的檢測采用RT-PCR檢測NR2B mRNA表達。大鼠麻醉后斷頭，分離L6～S1脊髓，采用Tripure法提取總RNA，測定并計算A260/A280比值及RNA水平，按常規(guī)方法制備cDNA。NR2B亞基引物，上游5′-TGGCGGTCTTTTTTCGTT-3′，下游5′-GCATTGCC TCCTTGATTTGG-3′，擴增片斷長度：114 bp；β-actin引物：上游：5′-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3′，下游：5′-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3′，擴增片斷長度：150bp。反應(yīng)條件：94℃4 min、94℃20 s、60℃25 s，循環(huán)35次；72℃10 min。用Gel Doc 2000凝膠圖像分析系統(tǒng)進行分析，計算目的基因電泳條帶吸光度×面積值與各自的βactin比值，以樣本/對照比值表示基因表達水平。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以±s表示，采用方差齊性檢驗、t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1前列腺炎性刺激后雙側(cè)脊髓背角NR2B蛋白表達增多術(shù)后7、14 d CFA組大鼠脊髓背角NR2B蛋白表達均顯著高于假手術(shù)組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見表1。

表1　前列腺炎性刺激對L1～2脊髓背角NR2R蛋白表達的影響（±s，IOD）

表1　前列腺炎性刺激對L1～2脊髓背角NR2R蛋白表達的影響（±s，IOD）

注：與假手術(shù)組同時間點比較，aP＜0.01；與同組術(shù)前比較，bP＜0.01。

組別CFA組假手術(shù)組n術(shù)前術(shù)后7 d術(shù)后14 d 19.48±1.95ab12.34±1.42 88 10.23±1.42 10.38±1.11 20.05±1.86ab13.17±1.63

2.2前列腺炎性刺激后雙側(cè)脊髓背角NR2B mRNA表達增多術(shù)后7、14 d CFA組大鼠脊髓背角NR2B mRNA表達均顯著高于假手術(shù)組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；術(shù)后7 d CFA組大鼠脊髓背角NR2B mRNA表達與術(shù)后14d比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

表2　前列腺炎性刺激對L6～S1脊髓背角NR2B mRNA表達的影響（±s，copy/μL）

表2　前列腺炎性刺激對L6～S1脊髓背角NR2B mRNA表達的影響（±s，copy/μL）

注：與假手術(shù)組同時間點比較，aP＜0.01；與同組術(shù)前比較，bP＜0.01。

組別CFA組假手術(shù)組n術(shù)前術(shù)后7 d術(shù)后14 d 7.83±0.37ab4.91±0.42 88 4.11±0.21 4.08±0.25 7.89±0.65ab4.83±0.43

2.3鞘內(nèi)連續(xù)給予ifenprodil后雙側(cè)脊髓背角NR2R蛋白表達下調(diào)術(shù)后7、14 d Ifenprodil組大鼠脊髓背角NR2R蛋白表達顯著低于空白對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見表3。

表3　鞘內(nèi)連續(xù)給予ifenprodil對脊髓背角NR2R蛋白表達的影響（±s，IOD）

表3　鞘內(nèi)連續(xù)給予ifenprodil對脊髓背角NR2R蛋白表達的影響（±s，IOD）

注：與空白對照組同時間點比較，aP＜0.01；與同組術(shù)前比較，bP＜0.01。

組別Ifenprodil組空白對照組n術(shù)前術(shù)后7 d術(shù)后14 d 88 19.77±1.20 18.87±1.10 13.85±1.51ab17.46±1.29 12.47±2.18ab18.12±1.13

3　討論

疼痛是慢性前列腺炎患者最主要的癥狀，也是影響患者生活質(zhì)量的主要因素。不同患者雖然病因不同，但疼痛性質(zhì)和特點相似；疼痛部位分布在與膀胱、尿道神經(jīng)支配相關(guān)的腰骶神經(jīng)支配區(qū)；部分患者可能還存在膀胱、尿道功能異常。目前，對其疼痛產(chǎn)生的原因尚無滿意的解釋，也無有效的治療方法［6］。

跨器官痛覺致敏是近年來提出的關(guān)于內(nèi)臟疼痛的一種新理論［1-2］，即一個病變內(nèi)臟器官的疼痛繼發(fā)性引起另一個相鄰器官痛覺敏化，進而導(dǎo)致后者功能異常。盆腔器官的某些病變與神經(jīng)系統(tǒng)疾病一樣能引起膀胱過度活動，如慢性脊髓損傷、直腸炎、宮頸疾病等［6-7］。直腸炎癥能引起膀胱感覺神經(jīng)元過敏，進一步引起膀胱過度活動［8］。腸易激綜合征患者出現(xiàn)泌尿系統(tǒng)相關(guān)臨床表現(xiàn)的概率顯著增高，包括尿頻、尿急、夜尿等［9］?？缙鞴偻从X致敏理論為前列腺炎導(dǎo)致的疼痛及相關(guān)器官功能障礙提供了一個全新的思路。

內(nèi)臟-軀體和內(nèi)臟-內(nèi)臟感覺傳入會聚在盆腔跨器官痛覺致敏產(chǎn)生中具有重要作用［4-5］。作者前期研究發(fā)現(xiàn)，前列腺和膀胱感覺神經(jīng)在腰骶段背根神經(jīng)節(jié)會聚，慢性炎性對會聚細胞的數(shù)量無影響，但能顯著增加腰骶段背根神經(jīng)節(jié)的瞬時感受器電位香草酸受體1（transient receptor potential vanilloid-1，TRPV1）和神經(jīng)生長因子的表達［10］。同時前列腺炎性刺激可引起膀胱功能改變。在一定程度上證實了前列腺炎可能導(dǎo)致跨器官痛覺過敏，但其具體機制仍不清楚。

NMDA受體在體內(nèi)神經(jīng)發(fā)育、突觸可塑性、學(xué)習(xí)、記憶及痛覺信號傳導(dǎo)等生理病理過程中發(fā)揮著重要作用［11］。NR2B是NMDA的一個重要亞基，參與了外周痛覺感受閾擴大、中樞過度興奮及痛覺過敏的形成［3］，在疼痛的產(chǎn)生及中樞性痛覺敏化形成中具有重要作用［12］。

本研究采用CFA刺激前列腺制作了前列腺炎疼痛模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NMDA受體NR2B亞基在腰骶段脊髓背角高表達，術(shù)后7、14 d CFA組大鼠脊髓背角NR2B蛋白表達均顯著高于假手術(shù)組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），鞘內(nèi)給予NR2B特異性拮抗劑——ifenprodil后NR2B表達下調(diào)。Ifenprodil可能通過減少NR2B mRNA的方式或增加NR2B降解的方式發(fā)揮作用，但具體機制尚不清楚［13］。因此，作者推測，NMDA受體NR2B亞基在前列腺炎導(dǎo)致的跨器官痛覺致敏中具有重要作用。同時作者以往研究發(fā)現(xiàn)，前列腺炎性刺激后腰骶段背根神經(jīng)節(jié)和脊髓背角的TRPV1表達同樣增多，而TRPV1參與了排尿反射，病理情況下與膀胱炎性痛、痛覺過敏及膀胱刺激癥狀有關(guān)［10］。但TRPV1與NMDA受體NR2B之間有無聯(lián)系尚需進一步研究。

綜上所述，NMDA受體NR2B參與了前列腺炎導(dǎo)致的跨器官痛覺過敏狀態(tài)的形成與維持，但具體機制尚需進一步研究。鑒于NMDA受體在慢性疼痛的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用，對NR2B進行選擇性拮抗可能成為脊髓損傷后慢性疼痛治療的新策略。

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Study on mechanism of spinal cord NMDA receptor NR2B participating in cross-organ pain sensation sensitization caused by prostatitis*

Chen Yong，Zhang Jianhua，Zhao Tao，Sun Wei，Yuan Mengjuan（Department of Urological Surgery，F(xiàn)uling District Central Hospital，Chongqing 408000，China）

ObjectiveTo investigate the role of N-methyl-D-aspartate（NMDA）receptor NR2B in the cross-organ pain sensation sensitization caused by inflammation stimulation of chronic prostatitis.MethodsThe prostatic injection of complete Freund adjunvant（CFA）was adopted to establish the rat chronic prostatitis model.The changes of NR2B subunit mRNA and protein expression levels were detected by using the Western blot and RT-PCR methods.Furthermore，the influence of NR2B specific antagonist ifenprodil by intrathecal injection on NR2B expression was investigated.ResultsThe expressions of NR2B in the spinal dorsal horn of lumbosacral segment after chronic inflammatory stimulation was up-regulated，while which after the intrathecal administration of ifenprodil was down-regulated.ConclusionThe NMDA receptor NR2B may be involved in the cross-organ pain sensation sensitization caused by chronic prostatitis.Therefore specific NR2B may be a potential strategy for treating chronic neuropathic pain induced by chronic prostatitis.

Receptors，N-methyl-D-aspartate；Prostatitis；Cross-organ sensitization

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.12.005

A

1009-5519（2016）12-1792-02

重慶市科委自然科學(xué)基金資助項目（cstc2012jja10104）。

陳勇（1971-），博士研究生，主任醫(yī)師，主要從事慢性前列腺炎的發(fā)病機制及治療的研究。

（2016-03-08）

（2016-04-03）