應(yīng)用CALUX法測(cè)定四川省廢棄物焚燒廠飛灰及周邊土壤中二噁英類物質(zhì)含量

許　利, 張嵩巖, 王　維, 田慶華, 張　悅,3, 劉　彥,3

(1. 四川省環(huán)境保護(hù)科學(xué)研究院，成都　610041; 2.中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心，環(huán)境化學(xué)與生態(tài)毒理學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京　100085；3.四川省環(huán)保科技工程有限責(zé)任公司，成都　610041)

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應(yīng)用CALUX法測(cè)定四川省廢棄物焚燒廠飛灰及周邊土壤中二噁英類物質(zhì)含量

許利1, 張嵩巖2, 王維1, 田慶華1, 張悅1,3, 劉彥1,3

(1. 四川省環(huán)境保護(hù)科學(xué)研究院，成都610041; 2.中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心，環(huán)境化學(xué)與生態(tài)毒理學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100085；3.四川省環(huán)保科技工程有限責(zé)任公司，成都610041)

采集四川省生活廢棄物焚燒爐飛灰和企業(yè)周邊土壤樣品10個(gè)，應(yīng)用CALUX生物檢測(cè)法測(cè)定了樣品中二噁英類物質(zhì)的毒性當(dāng)量。與國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道值進(jìn)行比較，結(jié)果表明兩家廢棄物焚燒企業(yè)飛灰中二噁英類物質(zhì)的毒性當(dāng)量水平較低；企業(yè)上風(fēng)向3 000m土壤背景樣品受周圍人類活動(dòng)影響，二噁英類毒性當(dāng)量值與其它省份土壤背景值相比較高；企業(yè)周邊1 200m范圍內(nèi)土壤中二噁英類物質(zhì)的毒性當(dāng)量值介于9.4～12.16 ng-TEQ/kg，低于國(guó)外除農(nóng)業(yè)用地外的其他規(guī)劃用地標(biāo)準(zhǔn)，與國(guó)內(nèi)上海、杭州焚燒企業(yè)周邊土壤樣品中二噁英類毒性當(dāng)量一致，但高于廣東、江蘇和天津焚燒企業(yè)周邊土壤中二噁英毒性當(dāng)量值。檢測(cè)結(jié)果為四川省持久性有機(jī)污染物的污染防治提供了數(shù)據(jù)支持，并填補(bǔ)了國(guó)內(nèi)四川省廢棄物焚燒企業(yè)周邊土壤中二噁英含量的數(shù)據(jù)空白。

二噁英;熒光素酶報(bào)告基因法;焚燒;土壤;飛灰

1　前　言

二噁英類物質(zhì)包含多氯二苯并二惡英(polychlorinated dibenzo-p-dioxins，簡(jiǎn)稱PCDDs)和多氯二苯并呋喃(polychlorinated dibenzofurans，簡(jiǎn)稱PCDFs)兩大類有機(jī)化合物，共210種異構(gòu)體。由于其能持久存在于環(huán)境中，并具有生物積累和毒害性，被斯德哥爾摩公約列為首批受控的持久性有機(jī)污染物。二噁英類的產(chǎn)生主要通過人類的工業(yè)活動(dòng)，其中無組織的廢棄物焚燒是目前世界上大部分國(guó)家和地區(qū)環(huán)境介質(zhì)中二噁英類的主要來源[1]。焚燒煙氣中的二噁英類物質(zhì)通過干、濕沉降于土壤中，被土壤礦物表面吸附和積累，通過食物鏈?zhǔn)蛊渖锒拘缘靡詡鬟f、放大。因此，土壤最可能成為二噁英類物質(zhì)傳播的集散地[2]。對(duì)土壤中二噁英類物質(zhì)的污染現(xiàn)狀調(diào)查及趨勢(shì)研究是非常重要和必要的。

環(huán)境中二噁英分析屬超痕量、多組分分析，對(duì)分析技術(shù)的特異性、選擇性和靈敏性的要求極高。目前二噁英的測(cè)定方法主要有美國(guó)環(huán)境保護(hù)局EPA-1613和1668為代表的HRGC-HRMS、基于抗原-抗體的ELISA法，以及基于總毒性當(dāng)量(TEQ)的生物檢測(cè)法等[3]?，F(xiàn)階段國(guó)內(nèi)各相關(guān)領(lǐng)域分析二噁英類物質(zhì)普遍采用HRGC-HRMS，該法通過復(fù)雜的前處理過程能夠?qū)CDD、PCDF和PCB等異構(gòu)體進(jìn)行精確定量，但是檢測(cè)成本昂貴、檢測(cè)周期較長(zhǎng)，使其在環(huán)境、食品和衛(wèi)生等領(lǐng)域開展二噁英類物質(zhì)污染狀況調(diào)查中的應(yīng)用受到極大限制[4]。相比之下生物檢測(cè)法所需要的檢測(cè)時(shí)間短、操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)費(fèi)用低，并且能夠同時(shí)檢測(cè)更多的樣本。生物檢測(cè)法中，熒光素酶報(bào)告基因法(CALUX)作為一種高效快速、簡(jiǎn)易價(jià)廉的生物分析方法，得到了美國(guó)EPA推薦使用的二噁英生物學(xué)檢測(cè)方法，并已被歐盟、美國(guó)、日本等國(guó)廣泛用于二噁英的篩選檢測(cè)中。

國(guó)外已廣泛開展了土壤環(huán)境中二噁英類物質(zhì)污染調(diào)查研究，如美國(guó)、日本、荷蘭等，并根據(jù)土地的使用功能性質(zhì)制定了土壤中二噁英類物質(zhì)含量的限值指標(biāo)。我國(guó)目前的研究數(shù)據(jù)較少，雖有部分省市已開展了相關(guān)研究，如上海、浙江、江蘇等，但四川省廢棄物焚燒企業(yè)周邊土壤中二噁英類物質(zhì)含量的調(diào)查研究目前還未見報(bào)道。因此我們采用了CALUX生物檢測(cè)方法，調(diào)查研究了四川省兩座廢棄物焚燒企業(yè)焚燒爐飛灰及企業(yè)周邊土壤中二噁英類的含量，并與國(guó)內(nèi)外調(diào)查研究數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比，為國(guó)內(nèi)的二噁英調(diào)查研究提供數(shù)據(jù)支持和參考。

2　材料與方法

2.1材料

正己烷、甲苯和丙酮(均為農(nóng)殘級(jí))分別購(gòu)自美國(guó)J.T-Baker 公司，二氯甲烷(農(nóng)殘級(jí))購(gòu)自Honeywell公司，乙酸乙酯(農(nóng)殘級(jí))、二甲基亞砜(DMSO，for biology)和玻璃棉購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich，無水硫酸鈉購(gòu)自日本和光純藥(Wako Pure Chemical)公司，二噁英標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自美國(guó)willington公司。提取裝置采用美國(guó)Thermo的加速溶劑萃取裝置，型號(hào)為ASE 350，凈化儀器采用北京普利泰科儀器有限公司的全自動(dòng)凈化裝置，型號(hào)為JF602。

培養(yǎng)基、盤尼西林(Penicillin-streptomycin)、胎牛血清(FBS)和磷酸鹽緩沖液均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，熒光素酶和細(xì)胞裂解液購(gòu)自美國(guó)Promega公司，酶標(biāo)儀購(gòu)自美谷分子儀器有限公司，型號(hào)為SpectraMax?L。

2.2樣品采集與分裝

本文研究所用飛灰樣品來自四川省成都市周邊的兩座生活廢棄物焚燒企業(yè)A、B。由于焚燒廠A受耕種農(nóng)田影響，為避免農(nóng)藥殘留對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，焚燒廠B受建筑物遮擋，采樣比較困難。因此在1 200m范圍內(nèi)只挑選了三個(gè)點(diǎn)位采樣，分別為在主導(dǎo)風(fēng)向下游500m、800m、1 200m處(可能的最大落地濃度區(qū)域)布設(shè)采樣點(diǎn)位。在發(fā)生源主導(dǎo)風(fēng)向上游3km，布設(shè)1個(gè)點(diǎn)位作為背景值。企業(yè)焚燒爐周邊土壤采樣點(diǎn)的布置分別如圖1中A、B所示，共有8個(gè)土壤采樣點(diǎn)和2個(gè)背景值采樣點(diǎn)。為提高樣品的代表性，采用5點(diǎn)混合式采樣，即在每個(gè)地點(diǎn)選擇一個(gè)采樣在中心，并在距中心5～10m的4個(gè)方向上各選1點(diǎn)，合計(jì)5個(gè)采樣點(diǎn)。清理掉采樣點(diǎn)上的樹葉植物等覆蓋物，用不銹鋼小鏟采取表層以下5～20cm土壤樣品，混合后放入樣品袋，置于室內(nèi)風(fēng)干，研磨成粉末(小于0.25mm)，四分法取樣，裝入棕色樣品瓶，低溫避光保存。其中企業(yè)B下風(fēng)向500m周圍為住宅用地，為有效取樣，故在周邊500～600m范圍內(nèi)選取了三個(gè)采樣點(diǎn)，分別取樣后均勻混合為一個(gè)樣品。五點(diǎn)混合式采樣法如圖2所示。

2.3樣品預(yù)處理與凈化

土壤樣品預(yù)處理流程參照EPA1613方法，如圖3所示。ASE提取條件為：提取液為正己烷：二氯甲烷(1∶1(v/v))；溫度：150℃，壓力：1 500ps，保持7min，靜態(tài)提取8min， 2個(gè)循環(huán)。自動(dòng)凈化裝置使用北京普利泰科儀器有限公司提供的成品凈化柱，串聯(lián)順序依次為酸性硅膠柱、鋁柱和活性炭柱。淋洗方法：用20mL正己烷分別預(yù)淋洗三個(gè)串聯(lián)柱，再用20mL甲苯預(yù)淋洗活性炭柱，再用20mL正己烷分別預(yù)淋洗三個(gè)串聯(lián)柱，加樣后用10mL甲苯淋洗活性炭柱，分離出PCDD/Fs。收集淋洗液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，用200μl DMSO定容。

2.4CAULX生物檢測(cè)

進(jìn)行生物試驗(yàn)時(shí)，從加了200μl DMSO的樣品中取出4.5μl，加入450μl PRMI 1640培養(yǎng)液(1% Penicillin-streptomycin+8% FBS)后混勻。在已放置有細(xì)胞Hepa 6.1的96孔板上每孔加入100μL混合液，培養(yǎng)20～40 h(37℃，體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2)。采用化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)儀測(cè)量發(fā)光度，通過發(fā)光度計(jì)算PCDD/Fs濃度。

圖1　焚燒廠A、B周圍土壤取樣點(diǎn)位示意Fig.1　Sampling points scheme of the two municipal solid waste incinerations (MSWIs)

圖2　五點(diǎn)混合式采樣法示意Fig.2　Schematic diagram of five hybrid sampling method

圖3　土壤樣品預(yù)處理流程圖Fig.3　Flow diagram for the pretreatment of the soil samples

3　實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1熒光素酶表達(dá)基因法原理以及其毒性當(dāng)量因子

CALUX方法是基于基因工程技術(shù)，把哺乳動(dòng)物的細(xì)胞色素P450基因啟動(dòng)子(CYP1A1)和螢火蟲的熒光酶合成基因，重組到大鼠肝癌細(xì)胞系(H4IIE)染色體上。脂溶性二噁英類污染物透過細(xì)胞膜與細(xì)胞內(nèi)多環(huán)芳烴受體可逆性結(jié)合，形成配體-AhR復(fù)合物，使AhR的構(gòu)象發(fā)生改變，進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)。在細(xì)胞核內(nèi)配體-AhR復(fù)合體和核內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ARNT)結(jié)合，形成配體-AhR-ARNT復(fù)合物，特異性的與染色體上的二噁英應(yīng)答區(qū)域結(jié)合，并激活細(xì)胞合成熒光素酶[3]。該測(cè)試系統(tǒng)合成的熒光素酶量及熒光強(qiáng)度與測(cè)定系統(tǒng)中加入的二噁英量成正相關(guān)，系統(tǒng)中的熒光強(qiáng)度可以通過酶標(biāo)儀進(jìn)行讀取。

由以上原理可以看出，CALUX方法中合成熒光素量及熒光強(qiáng)度實(shí)際與二噁英類促使基因表達(dá)能力的強(qiáng)弱有關(guān)，因此將2,3,7,8-TCDD誘導(dǎo)基因表達(dá)的能力定義為1，其他異構(gòu)體誘導(dǎo)基因表達(dá)能力與之相比即為CALUX方法中使用的毒性當(dāng)量因子(REP)，對(duì)應(yīng)的總毒性當(dāng)量用TEQ表示，以有別于用HRGC-HRMS檢測(cè)法使用的總毒性當(dāng)量I-TEQ[4]。

3.2CALUX標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制以及TEQ的計(jì)算

一是朝著管理會(huì)計(jì)方向發(fā)展。過去財(cái)務(wù)管理依據(jù)于企業(yè)運(yùn)作的部分?jǐn)?shù)據(jù)，管理人員根據(jù)自身經(jīng)驗(yàn)和市場(chǎng)發(fā)展方向加以管理；隨著大數(shù)據(jù)時(shí)代的到來，財(cái)務(wù)管理工作依靠客觀性數(shù)據(jù)，而且數(shù)據(jù)類型較為豐富，能夠?yàn)槠髽I(yè)提供各個(gè)崗位、領(lǐng)域以及過去和未來的真實(shí)、準(zhǔn)確數(shù)據(jù)。如預(yù)算管理工作，過去財(cái)務(wù)管理依據(jù)會(huì)計(jì)準(zhǔn)則被動(dòng)性的開展工作，而且預(yù)算工作受重視度偏低；現(xiàn)階段，大數(shù)據(jù)使得財(cái)務(wù)管理偏向管理會(huì)計(jì)方向，不再受到相關(guān)會(huì)計(jì)原則的局限，多數(shù)工作和管理人員主動(dòng)性利用數(shù)據(jù)做出分析，為企業(yè)整體運(yùn)作提供數(shù)據(jù)和資料。

CALUX標(biāo)準(zhǔn)曲線可參考文獻(xiàn)[4]進(jìn)行繪制。即將CALUX法中二噁英類檢出原理近似與酶反應(yīng)式相同，并利用酶反應(yīng)模型Hill公式繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖4所示。

圖4　標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度應(yīng)答曲線Fig.4　Dose-response curve of standards determined by CALUX bioassay

3.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果和討論

3.3.1飛灰中二噁英類含量

企業(yè)A、B焚燒爐飛灰及其周邊土壤二噁英含量如表1和圖5所示，其中飛灰中二噁英毒性當(dāng)量分別為31.25ng-TEQ/kg和16.11ng-TEQ/kg，大于企業(yè)周邊土壤中二噁英類毒性當(dāng)量，且為企業(yè)上風(fēng)向3 000m處土壤中二噁英毒性當(dāng)量的3.38和3.77倍。與國(guó)內(nèi)外生活廢棄物焚燒廠飛灰中二噁英毒性當(dāng)量相比，此次采樣的兩家焚燒廠飛灰中二噁英毒性當(dāng)量較低，具體參考指標(biāo)見表2所示。可能的原因是由于這兩家企業(yè)均為2012年投資建成的，引進(jìn)了世界先進(jìn)的焚燒爐和煙氣凈化技術(shù)和設(shè)備，代表了四川省城市生活廢棄物焚燒行業(yè)的清潔生產(chǎn)水平。目前世界各國(guó)還沒有垃圾焚燒爐飛灰中二噁英的控制標(biāo)準(zhǔn)，一般是參照土壤中的控制標(biāo)準(zhǔn)來處理。參照我國(guó)《生活垃圾填埋場(chǎng)污染控制標(biāo)準(zhǔn)》 (GB16889—2008)，企業(yè)A、B飛灰樣品中二噁英類含量均遠(yuǎn)低于的標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的3 ng I-TEQ/g。

表1　企業(yè)A、B焚燒爐飛灰及周邊土壤中二噁英毒性當(dāng)量

3.3.2企業(yè)周邊土壤中二噁英類物質(zhì)空間分布及其毒性當(dāng)量水平

A、B企業(yè)下風(fēng)向周邊土壤中二噁英類物質(zhì)空間分布情況不同。如圖5所示，企業(yè)A周邊土壤二噁英濃度分布規(guī)律是距發(fā)生源越遠(yuǎn)，土壤二噁英濃度越低，下風(fēng)向1 200m左右與土壤背景中二噁英濃度相差不大，說明該企業(yè)下風(fēng)向1 200m以外的區(qū)域受二噁英影響不大。企業(yè)B周邊土壤二噁英濃度分布規(guī)律是距發(fā)生源越遠(yuǎn)，土壤二噁英類含量越大，且遠(yuǎn)大于該廠土壤背景值。出現(xiàn)以上情況的原因可能是由于焚燒廠B下風(fēng)向800m范圍內(nèi)受建筑物影響，導(dǎo)致這段區(qū)域內(nèi)二噁英濃度偏低，下風(fēng)向1 200m后為荒地，不受建筑物影響，土壤中二噁英含量升高。而焚燒廠A下風(fēng)向1 200m范圍內(nèi)無建筑物遮擋，焚燒煙氣自然沉降，所以離發(fā)生源越遠(yuǎn)，焚燒廠A下風(fēng)向土壤中二噁英濃度越低。

企業(yè)周邊1 200m范圍內(nèi)土壤中二噁英類毒性當(dāng)量范圍介于9.4～12.16 ng-TEQ/kg，與國(guó)外參考值比較，此值略高于國(guó)外鄉(xiāng)村土壤的濃度水平(1-5 ng TEQ/kg)，但低于日本、荷蘭的住宅用地標(biāo)準(zhǔn)(1 000ngTEQ/kg)、德國(guó)的居民、公園、娛樂設(shè)施標(biāo)準(zhǔn)(1 000ngTEQ/kg)。根據(jù)采樣點(diǎn)土地性質(zhì)，除了企業(yè)A下風(fēng)向500m和831m范圍內(nèi)有少量農(nóng)田，土壤二噁英毒性當(dāng)量略高于瑞典敏感用地外。其余土樣根據(jù)采樣點(diǎn)用地性質(zhì)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于國(guó)外相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。具體參考指標(biāo)見表1。與國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)報(bào)道值相比，焚燒廠A、B1 200m范圍內(nèi)土壤樣品中二噁英類毒性當(dāng)量略高于江蘇、浙江、天津和廣東等地的廢棄物焚燒廠周邊土壤中二噁英的毒性當(dāng)量，但低于上海廢棄物企業(yè)周邊土壤中的二噁英毒性當(dāng)量。需要說明的是，參考文獻(xiàn)中所用的檢測(cè)方法大部分為HRGC-HRMS方法，而本次調(diào)查所用的方法為CALUX生物檢測(cè)法。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，CALUX的實(shí)測(cè)值高于HRGC-HRMS測(cè)量值 1.2～4.5倍[4]。如果按照此倍數(shù)進(jìn)行換算，則換算后的值與中國(guó)大部分地區(qū)廢棄物企業(yè)周邊土壤中二噁英含量值一致。具體參考指標(biāo)見表2所示。

表2　中國(guó)部分地區(qū)土壤背景值和焚燒爐周邊土壤二噁英毒性當(dāng)量值

圖5　企業(yè)A、B飛灰及周邊土壤二噁英類含量空間分布Fig.5　Spatial distribution of dioxins concentrations in the soil around the two municipal solid waste incinerations

4　結(jié)　論

應(yīng)用CALUX法測(cè)定了四川省兩座廢棄物焚燒企業(yè)焚燒爐飛灰及周邊土壤中二噁英類物質(zhì)的毒性當(dāng)量，為四川省持久性有機(jī)污染物的污染防治提供了數(shù)據(jù)支持，并填補(bǔ)了國(guó)內(nèi)四川省廢棄物焚燒企業(yè)周邊土壤中二噁英含量的數(shù)據(jù)空白。

CALUX法具有操作程序簡(jiǎn)單、快速，檢測(cè)靈敏度和準(zhǔn)確性等同于HRGC-HRMS、檢測(cè)范圍廣、分析費(fèi)用較低和檢測(cè)周期短等一系列優(yōu)勢(shì)，適用于二噁英樣品的快速半定量篩選，可應(yīng)用于我國(guó)大規(guī)模的二噁英污染狀況調(diào)查和相應(yīng)的健康危害評(píng)估。從文獻(xiàn)報(bào)道來看，國(guó)內(nèi)二噁英檢測(cè)值均為采用HRGC-HRMS方法得到，相比CALUX方法，HRGC-HRMS測(cè)量值偏低，因此用兩種方法得到的結(jié)果進(jìn)行比較并不恰當(dāng)。但是鑒于生物檢測(cè)法的優(yōu)點(diǎn)，希望國(guó)家行政部門能盡快出臺(tái)相關(guān)的生物檢測(cè)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，以有利于國(guó)內(nèi)工作者開展土壤篩查和污染識(shí)別，并為相關(guān)行政部門制定完善的功能區(qū)劃內(nèi)二噁英類持久性有機(jī)物的污染限值提供參考。

致謝：感謝“全球環(huán)境基金‘中國(guó)制漿造紙行業(yè)二惡英減排項(xiàng)目’”(Project ID: P125528)對(duì)四川省二惡英生物檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室建設(shè)的資助。

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Determination of Dioxins in the Fly Ash and the Surrounding Soil of Two Municipal Solid Waste Incinerations in Sichuan by Chemical-Activated Luciferase Gene Expression (CALUX)

XU Li1, ZHANG Song-yan2, WANG Wei1, TIAN Qing-hua1, ZHANG Yue1,3, LIU Yan1,3

(1.SichuanAcademyofEnvironmentalSciences,Chengdu610041,China; 2.StateKeyLaboratoryofEnvironmentalChemisty&Ecotaxicology,ResearchCenterforEco-environmentalSciences,ChineseAcademyofSciences,Beijing100085,China; 3.SichuanProvinceEnvironmentalProtecionTechnologyEngineering,Chengdu610041,China)

The research took both fly ash and 10 soil samples around two municipal solid waste incinerations (MSWIs) in Sichuan. The simple and low cost CALUX (Chemical-Activated Luciferase Gene Expression) bioassay method was used to fast determine dioxins in the fly ash and the surrounding soils. Compared to the reported TEQ concentrations of the fly ash, background and surrounding soil of the MSWIs at home and abroad, the measured TEQ values were lower in the fly ash of the two MSWIs in Sichuan. Influenced by human activities, dioxin TEQ concentrations were higher in the soil which located on the upwind of dominant wind direction about 3 000m away from the incinerators. However, the TEQ concentrations of the surrounding soil 1 200m away from the incinerators were 9.4～12.16 ng-TEQ/kg, lower than the planning land use standard abroad except for agriculture land standards, higher than the reported values of MSWIs in Guangdong, Jiangsu and Tianjin, etc. province, but consisted with the reported values in Shanghai and Hangzhou city. The testing result provide data for prevention and control of persistent organic pollutants in Sichuan.

Dioxin; CALUX; incineration; soil; fly ash

2016-06-23

許利(1985-)，女，四川成都人，2015年畢業(yè)于復(fù)旦大學(xué)高分子科學(xué)系，博士，主要從事環(huán)境污染防治研究及環(huán)境友好材料的研發(fā)應(yīng)用。

田慶華,tqhtwo@scaes.cn。

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A

1001-3644(2016)05-0007-06