響應(yīng)面法優(yōu)化重組運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌極高密度乙醇發(fā)酵工藝

曹尚志,黃樂滔,羅　娟,上官敏敏,鄧　穎,汪浩勇

(湖北工業(yè)大學(xué)發(fā)酵工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北武漢 430068)

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響應(yīng)面法優(yōu)化重組運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌極高密度乙醇發(fā)酵工藝

曹尚志,黃樂滔,羅娟,上官敏敏,鄧穎,汪浩勇*

(湖北工業(yè)大學(xué)發(fā)酵工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北武漢 430068)

采用基因工程技術(shù),成功地構(gòu)建了在無需氨基酸和維生素的條件下,能高效利用葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和甘露糖發(fā)酵生成乙醇的重組菌Z.mobilisHYMX。為了提高發(fā)酵乙醇產(chǎn)量,利用響應(yīng)面法優(yōu)化了重組菌極高密度發(fā)酵的工藝條件。結(jié)果表明,最佳發(fā)酵條件為:葡萄糖濃度305 g/L,溫度34 ℃,pH6.5,尿素濃度3 g/L,接種量10%,發(fā)酵時(shí)間60 h。在此條件下重組單胞菌的乙醇產(chǎn)量達(dá)到153.1 g/L,比優(yōu)化前提高了8.5%,比原型菌產(chǎn)量提高了105.14%。與工業(yè)酵母菌株P(guān)E-2相比重組菌節(jié)省了約12%的葡萄糖,節(jié)省了37.5%的時(shí)間。

重組運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌,響應(yīng)面法,發(fā)酵條件,乙醇產(chǎn)量

當(dāng)今世界能源問題、環(huán)境問題日益嚴(yán)峻,對燃料乙醇的應(yīng)用與發(fā)展的研究,不僅能為當(dāng)代的生物能源開發(fā)利用提供借鑒,同時(shí)還可以緩解全球性的能源危機(jī),減少傳統(tǒng)能源引起的環(huán)境問題[1]。能源危機(jī)促使乙醇發(fā)酵菌種的研究,用低成本產(chǎn)生最大化的乙醇以滿足日益增長的需要。酵母菌株P(guān)E-2是文獻(xiàn)報(bào)道最終乙醇產(chǎn)量最高的乙醇發(fā)酵菌種。30%的巴西乙醇工廠采用酵母菌株P(guān)E-2,全世界超過10%的乙醇來自酵母菌株P(guān)E-2發(fā)酵。Pereira FB,Guimaraes PMR等人用重組酵母菌株P(guān)E-2在葡萄糖濃度為343 g/L,發(fā)酵96 h條件下得到乙醇產(chǎn)量為151 g/L[2]。

運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌(Z.mobilis)被認(rèn)為是進(jìn)行乙醇生產(chǎn)最合適的細(xì)菌之一,是良好的燃料乙醇生產(chǎn)菌種[3]。與其它微生物相比,該菌代謝途徑相對簡單,通過2-酮-3脫氧-6磷酸葡萄酸(ED)途徑高效專一代謝葡萄糖、果糖生產(chǎn)乙醇[4]。本文用Tn5轉(zhuǎn)座技術(shù),向Z.mobilis基因組整合了13個(gè)基因(xylA、xylB、araB、araA、araD、manA、tktA、talB、metB、yfdZ、FAR、WS/DGAT、TesA),構(gòu)建出重組菌Z.mobilisHYMX。

響應(yīng)面分析法[5-7]可以進(jìn)行實(shí)驗(yàn)組合設(shè)計(jì),其在實(shí)驗(yàn)室和現(xiàn)實(shí)工廠生產(chǎn)研發(fā)中應(yīng)用廣泛。為了使重組菌乙醇產(chǎn)量最大化,利用響應(yīng)面分析法對重組菌高濃度葡萄糖的發(fā)酵工藝條件進(jìn)行優(yōu)化,對后續(xù)的高糖濃度發(fā)酵生產(chǎn)乙醇以及工業(yè)化研究具有指導(dǎo)意義。

表1　PB實(shí)驗(yàn)水平

1　材料與方法

1.1材料與儀器

運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌(Z.mobilis)來自ATCC31821;大腸桿菌(E.coliK12)由作者實(shí)驗(yàn)室保藏;重組運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌(Z.mobilisHYMX)本次構(gòu)建;Pfu DNA聚合酶購自NEB公司;T4 DNA 接酶和各種限制性內(nèi)切酶購自大連寶生物公司;質(zhì)粒小量抽提試劑盒和膠回收試劑盒購自長沙安比奧生物技術(shù)公司;酵母粉購自安琪酵母有限公司;葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、尿素及其余試劑均為分析純,購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

My cycle型PCR儀美國Bio-rad;Micro Pulser型電轉(zhuǎn)化儀美國Bio-rad;UV-2000型分光光度計(jì)上海尤尼柯儀器有限公司;GC7890F氣相色譜儀上海天美科學(xué)儀器有限公司;DYY7C電泳儀北京六一儀器;IMS-20全自動(dòng)制冰機(jī)常熟學(xué)科電器有限公司;DNP-9052電熱恒溫培養(yǎng)箱上海精宏科學(xué)儀器廠;Tanon-2500凝膠成像系統(tǒng)上海天能科技有限公司;GC7890F氣相色譜儀上海天美科學(xué)儀器有限公司。

1.2培養(yǎng)基

種子與活化培養(yǎng)基:100 g/L葡萄糖,10 g/L酵母提取物,1 g/L尿素,1 g/L磷酸二氫鉀,0.5 g/L七水硫酸鎂,調(diào)節(jié)至pH6.0,115 ℃滅菌30 min。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基:290 g/L葡萄糖,10 g/L酵母提取物,1 g/L尿素,1 g/L磷酸二氫鉀,0.5 g/L七水硫酸鎂,調(diào)節(jié)至pH6.0,115 ℃滅菌30 min。厭氧條件下32 ℃發(fā)酵60 h。

無氨基酸和維生素培養(yǎng)基:不同質(zhì)量濃度的還原糖(葡萄糖、木糖、甘露糖、阿拉伯糖),1 g/L尿素,1 g/L磷酸二氫鉀,0.5 g/L七水硫酸鎂,調(diào)節(jié)至pH6.0,115 ℃滅菌30 min。厭氧條件下32 ℃發(fā)酵60 h。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1重組菌Z.mobilisHYMX構(gòu)建方法利用PCR重疊技術(shù),將各個(gè)功能基因序列融合,構(gòu)建出需要的轉(zhuǎn)座子。然后將克隆的轉(zhuǎn)座子連接到運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌轉(zhuǎn)座載體上,最后將連接好的轉(zhuǎn)座載體轉(zhuǎn)座到Z.mobilis基因組上得到重組菌Z.mobilisHYMX[8]。

1.3.2重組菌還原糖利用及無氨基酸和維生素條件下的發(fā)酵驗(yàn)證無氨基酸和維生素培養(yǎng)基成分如下:葡萄糖(100、140、180 g/L)、1 g/L尿素,1 g/L磷酸二氫鉀,0.5 g/L七水硫酸鎂,pH6.0。10%接種量,厭氧條件下32 ℃靜置發(fā)酵60 h。

配制還原糖無氨基酸和維生素培養(yǎng)基成分如下:60 g/L(木糖、阿拉伯糖、甘露糖),1 g/L尿素,1 g/L磷酸二氫鉀,0.5 g/L七水硫酸鎂,pH6.0。10%接種量,厭氧條件下32 ℃靜置發(fā)酵60 h。

1.3.3單因素實(shí)驗(yàn)對影響運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌基因工程菌發(fā)酵產(chǎn)乙醇的幾個(gè)因素做單因素實(shí)驗(yàn),主要有溫度、發(fā)酵時(shí)間、初始pH、初始葡萄糖濃度、接種量、尿素濃度。

選取5個(gè)溫度梯度:28、32、34、36、40 ℃,接種量10%,葡萄糖濃度290 g/L,尿素濃度1 g/L,pH6,發(fā)酵60 h;5個(gè)時(shí)間梯度:40、50、60、70、80 h,接種量10%,葡萄糖濃度290 g/L,溫度32 ℃,尿素濃度1 g/L,pH6;5個(gè)初始pH4、5、6、7、8,接種量10%,葡萄糖濃度290 g/L,溫度32 ℃,尿素濃度1 g/L,發(fā)酵60 h;5種初始葡萄糖濃度:270、280、290、300、310 g/L,接種量10%,溫度32 ℃,尿素濃度1 g/L,pH6,發(fā)酵60 h;5種接種量:5%、8%、10%、12%、15%(V/V),葡萄糖濃度290 g/L,溫度32 ℃,尿素濃度1 g/L,pH6,發(fā)酵60 h;5種尿素濃度:1、2、3、4、5 g/L,接種量10%,葡萄糖濃度290 g/L,溫度32 ℃,pH6,發(fā)酵60 h。

各種條件下培養(yǎng)基中還需加入10 g/L酵母提取物,1 g/L磷酸二氫鉀,0.5 g/L七水硫酸鎂,厭氧靜置發(fā)酵。

1.3.4Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,分別為葡萄糖濃度(g/L)、初始pH、發(fā)酵溫度(℃)、發(fā)酵時(shí)間(h)、接種量(℃)、尿素濃度(℃);每個(gè)因素分別取高(1)、低(-1)兩個(gè)水平,應(yīng)用Design-Expert8.0進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和分析,以乙醇產(chǎn)量為響應(yīng)值,共進(jìn)行12組實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

1.3.5爬坡實(shí)驗(yàn)根據(jù)Plackett-Burman實(shí)驗(yàn),設(shè)計(jì)爬坡實(shí)驗(yàn),找到逼近最大響應(yīng)值的區(qū)域。

1.3.6中心組合(CCD)實(shí)驗(yàn)方法根據(jù)最陡爬坡實(shí)驗(yàn)結(jié)果,顯著因素以中心點(diǎn)為零水平,用Design Expert 8.0軟件設(shè)計(jì)中心組合實(shí)驗(yàn)并進(jìn)行響應(yīng)面分析，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見表2。

表2　CCD實(shí)驗(yàn)水平

1.3.7乙醇測定的方法乙醇產(chǎn)量采用氣相色譜儀測定,計(jì)算方法為內(nèi)標(biāo)法,以正丁醇為內(nèi)標(biāo)物[9-10]。

2　結(jié)果與分析

2.1重組菌構(gòu)建與初篩

本實(shí)驗(yàn)以多種不同種屬來源細(xì)菌的基因組為模板,首先分別克隆了xylA、xylB、araB、araA、araD、manA、tktA、talB、metB、yfdZ、FAR、WS/DGAT和TesA,經(jīng)過測序確認(rèn)DNA序列無誤后,構(gòu)建其能在Z.mobilis中表達(dá)的操縱子。將13個(gè)操縱子按圖1的順序連接成一個(gè)連續(xù)的DNA分子,構(gòu)建Tn5轉(zhuǎn)座載體。其中,xylA、xylB、araB、araA、araD、manA、tktA、talB操縱子[11-12],使細(xì)菌獲得利用木糖、阿拉伯糖、甘露糖的能力。metB、yfdZ操縱子[13]使細(xì)菌可以在無氨基酸和維生素的培養(yǎng)基中生長和發(fā)酵生產(chǎn)乙醇。由于有文獻(xiàn)報(bào)道乙醇耐受細(xì)菌體內(nèi)的脂肪酸含量明顯增加,構(gòu)建了TesA、FAR和WS/DGAT[14-15]操縱子,用于增加細(xì)菌體內(nèi)脂肪酸的含量。

實(shí)驗(yàn)中將如圖1所示的Tn5轉(zhuǎn)座子整合到Z.mobilis的基因組上。取轉(zhuǎn)座載體10 μL與5 μL的Tn5轉(zhuǎn)座酶混合,37 ℃水浴2 h,取3 μL與Z.mobilisCP4感受態(tài)細(xì)胞混合,電擊后用種子培養(yǎng)基32 ℃培養(yǎng)4～6 h[16]。

將培養(yǎng)后的重組運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的菌液離心去上清,用無菌生理鹽水稀釋,涂板到30 g/L木糖、30 g/L阿拉伯糖或30 g/L甘露糖為唯一碳源的固體平板中培養(yǎng)。將PCR鑒定正確的陽性轉(zhuǎn)座子,加入等體積的40%滅菌甘油,放在-80 ℃冰箱保存。

圖1　轉(zhuǎn)座子的示意圖Fig.1　Schematic diagram of transposon

2.2重組菌還原糖利用及不添加氨基酸和維生素發(fā)酵驗(yàn)證

由表3可知重組菌在三種葡萄糖濃度的無氨基酸和微生物培養(yǎng)基中發(fā)酵產(chǎn)量達(dá)到了50、69.5、88.5 g/L。說明重組菌可以在無氨基酸和無維生素培養(yǎng)基中高效發(fā)酵葡萄糖生產(chǎn)乙醇。

表3　無氨基酸和維生素的發(fā)酵驗(yàn)證結(jié)果

由表4可知最終乙醇產(chǎn)量分別為20.5、18.2、24.3 g/L,說明重組菌可以很好的利用葡萄糖、阿拉伯糖、甘露糖生產(chǎn)乙醇。

表4　重組菌還原糖發(fā)酵驗(yàn)證結(jié)果

2.3單因素實(shí)驗(yàn)

2.3.1溫度對乙醇產(chǎn)量的影響不同溫度對乙醇產(chǎn)量的影響結(jié)果如圖2所示,開始時(shí)隨著溫度的提高,乙醇產(chǎn)量提高明顯,在32 ℃和34 ℃時(shí)乙醇產(chǎn)量分別為141.3 g/L和141.5 g/L。隨著溫度的進(jìn)一步提高到36 ℃時(shí),乙醇產(chǎn)量下降到129.6 g/L,下降了8.5%。當(dāng)溫度達(dá)到40 ℃時(shí),乙醇產(chǎn)量只有112.8 g/L,所以選取32 ℃是最合適的溫度,溫度繼續(xù)提高不僅不能提高乙醇產(chǎn)量還會提高成本消耗更多能量。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn) ⑴20歲以下的AECOPD患者；⑵合并自身免疫性疾病、惡性腫瘤等終末期疾病、嚴(yán)重代謝性疾病、嚴(yán)重肝腎功能障礙的患者；⑶非實(shí)施本病綜合救治原因死亡的患者。

圖2　溫度對乙醇產(chǎn)量的影響Fig.2　Effect of temperature on ethanol yield

2.3.2發(fā)酵時(shí)間對乙醇產(chǎn)量的影響不同發(fā)酵時(shí)間對乙醇產(chǎn)量的影響結(jié)果如圖3所示,隨著發(fā)酵時(shí)間的增加乙醇產(chǎn)量在增加,在70 h達(dá)到最大值145.4 g/L,發(fā)酵時(shí)間80 h時(shí),乙醇產(chǎn)量有所下降,只有141.9 g/L,但是在發(fā)酵時(shí)間60 h時(shí)乙醇產(chǎn)量141.5 g/L與70 h相比乙醇產(chǎn)量相差較小,綜合考慮能耗成本等因素,選擇60 h為最合適發(fā)酵時(shí)間。

圖3　發(fā)酵時(shí)間對乙醇產(chǎn)量的影響Fig.3　Effect of fermentation time on ethanol yield

2.3.3初始pH對乙醇產(chǎn)量的影響不同初始pH對乙醇產(chǎn)量的影響結(jié)果如圖4所示,開始時(shí)pH的增大使乙醇產(chǎn)量增加,在pH6.0時(shí)乙醇產(chǎn)量最高為141.3 g/L。pH再增大,乙醇產(chǎn)量開始下降,所以pH6.0是最合適的發(fā)酵初始pH。

圖4　初始pH對乙醇產(chǎn)量的影響Fig.4　Effect of initial pH on ethanol yield

2.3.4葡萄糖濃度對乙醇產(chǎn)量的影響不同葡萄糖濃度對乙醇產(chǎn)量的影響如圖5所示,隨著葡萄糖濃度的增加乙醇產(chǎn)量在提高,在300 g/L時(shí)產(chǎn)量最高為145.3 g/L,但是在葡萄糖濃度達(dá)到310 g/L時(shí),乙醇產(chǎn)量下降明顯,所以300 g/L的葡萄糖濃度為合適的發(fā)酵濃度。

圖5　葡萄糖濃度對乙醇產(chǎn)量的影響Fig.5　Effect of glucose concentration on ethanol yield

2.3.5接種量對乙醇產(chǎn)量的影響不同接種量對乙醇產(chǎn)量影響如圖6所示,開始隨著接種量的增加,乙醇產(chǎn)量增加明顯,在10%接種量時(shí)產(chǎn)量達(dá)到最高為141.3 g/L。隨著接種量的增加,乙醇產(chǎn)量反而下降,所以10%接種量最合適。

圖6　接種量對乙醇產(chǎn)量的影響Fig.6　Effect of inoculation amount on ethanol yield

2.3.6尿素濃度對乙醇產(chǎn)量的影響不同尿素對乙醇產(chǎn)量影響如圖7所示,可以看到尿素對乙醇產(chǎn)量的影響較小,而尿素濃度在3 g/L時(shí)乙醇產(chǎn)量最高為合適濃度,此時(shí)產(chǎn)量最高為142.8 g/L。

圖7　尿素濃度對乙醇產(chǎn)量影響Fig.7　Effect of urea concentration on ethanol yield

2.4Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表5,各因素顯著性水平分析見表6。根據(jù)表6數(shù)據(jù)可知,模型p值<0.0001,說明該模型非常顯著可信度高。A、C、D的p值均<0.01表明A、C、D因素極顯著。因此,溫度、初始pH及葡萄糖濃度對乙醇產(chǎn)量R影響極顯著,而且由表6可知這三個(gè)因素對乙醇產(chǎn)量的總貢獻(xiàn)值達(dá)到98%以上,因此在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中主要考慮這三個(gè)因素。

表5　Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

注:G、H、I、J、K、L表示虛擬因素。

2.5最陡爬坡實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

根據(jù)表6結(jié)果可知溫度、初始pH均為負(fù)效應(yīng),葡萄糖濃度為正效應(yīng),設(shè)計(jì)爬坡實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果如表7。由表7可知第四組實(shí)驗(yàn)最接近最佳值區(qū)域,即葡萄糖濃度為300 g/L,溫度為31 ℃,pH為6.5時(shí)乙醇產(chǎn)量達(dá)到最高為147.8 g/L。

表7　最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

2.6響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

由最陡爬坡實(shí)驗(yàn)確定了最重要影響因素的取值區(qū)域。利用Design Expert軟件設(shè)計(jì)進(jìn)行CCD實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表8,以X1、X2、X3、Y分別表示葡萄糖濃度、溫度、pH、乙醇產(chǎn)量。

表6　Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)結(jié)果方差分析

表9　CCD實(shí)驗(yàn)結(jié)果方差分析

表8　CCD實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.7響應(yīng)面圖、最適發(fā)酵條件的確定及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

根據(jù)上述的回歸方程用Design Expert繪出響應(yīng)面分析圖8。等高線可以反映各因素的交互作用,響應(yīng)面越陡說明交互作用越明顯,由圖8可知,這三個(gè)因素交互作用不顯著,響應(yīng)面圖都是接近圓形而非陡峭的橢圓形。由響應(yīng)圖可知該拋物線圖形均開口向下,說明方程確實(shí)存在最大值,對上述二次多項(xiàng)回歸模型方程逐步回歸,以及通過表8、表9得到發(fā)酵乙醇的最佳條件為溫度34 ℃,葡萄糖濃度為305 g/L,pH6.5,在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),重復(fù)實(shí)驗(yàn)6次,平均值為153.1 g/L。

圖8　葡萄糖濃度、溫度、pH交互作用對乙醇產(chǎn)量影響的響應(yīng)面圖Fig.8　Response surface plots of effect of interaction between glucose concentration,temperature and pH on ethanol yield

3　結(jié)論

成功的構(gòu)建了不需要添加氨基酸和維生素,能同時(shí)高效利用葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和甘露糖生成乙醇的基因重組菌Z.mobilisHYMX。解決了運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌利用碳源單一的缺點(diǎn),為細(xì)菌低成本生產(chǎn)乙醇打好基礎(chǔ)。

運(yùn)用響應(yīng)面分析法對基因重組菌Z.mobilisHYMX極高密度乙醇發(fā)酵工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。確定了最佳發(fā)酵條件為葡萄糖濃度305 g/L,溫度34 ℃,pH6.5,尿素濃度3 g/L,接種量10%,發(fā)酵時(shí)間60 h。在此條件下經(jīng)過6次重復(fù)實(shí)驗(yàn)得到平均153.1 g/L的乙醇產(chǎn)量,比優(yōu)化前提高了8.5%,比原型菌產(chǎn)量提高了105.14%。與工業(yè)酵母菌株P(guān)E-2相比重組菌節(jié)省了約12%的葡萄糖,節(jié)省了37.5%的時(shí)間。

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Optimization of very high ethanol fermentation conditions of the recombinantZymomonasmobilisby response surface method

CAO Shang-zhi,HUANG Le-tao,LUO Juan,SHANG-GUAN Min-min,DENG Ying,WANG Hao-yong*

(Key Laboratory of Fermentation Engineering Ministry of Education,Hubei University of Technology,Wuhan 430068,China)

The recombinant bacteriaZ.mobilisHYMX which can utilize glucose,xylose,arabinose and mannose to produce ethanol in the culture medium without amino acids and vitamins,was constructed by genetic engineering technology. The fermentation conditions of the HYMX strain under very high gravity ethanol fermentation conditions were optimized by the response surface methodology. The results showed that the optimum conditions were:glucose concentration 305 g/L,temperature 34 ℃,pH6.5,urea concentration 3 g/L,inoculation amount 10%,fermentation time 60 h. Under the optimized conditions,the ethanol yield of the recombinant strain was 153.1 g/L,8.5% higher than the non-optimized one,105.14% higher than the prototype strain. Compared with the industrial yeast strain PE-2,the glucose saving was more than 12%,and the fermentation time saving was more than 37.5%.

recombinantZymomonasmobilis;response surface method;fermentation conditions;the ethanol yield

2016-01-18

曹尚志(1987-)，男，碩士研究生，研究方向：生化與分子生物學(xué)，E-mail:cao.shang.zhi@qq.com。

汪浩勇(1969-)，男，博士，教授，研究方向：生化與分子生物學(xué)，E-mail:haoyongw@qq.com。

湖北省優(yōu)秀中青年團(tuán)隊(duì)計(jì)劃項(xiàng)目(T200705)。

TS201.3

B

1002-0306(2016)16-0184-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.16.028