擬青霉FLH30 β-葡萄糖苷酶動(dòng)力學(xué)、激活抑制及其轉(zhuǎn)糖苷

華承偉,于江傲,李　蘭,常景玲,張志宏

(河南科技學(xué)院生命科技學(xué)院,河南新鄉(xiāng) 453003)

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擬青霉FLH30 β-葡萄糖苷酶動(dòng)力學(xué)、激活抑制及其轉(zhuǎn)糖苷

華承偉,于江傲,李蘭,常景玲,張志宏

(河南科技學(xué)院生命科技學(xué)院,河南新鄉(xiāng) 453003)

研究了擬青霉FLH30胞內(nèi)β-葡萄糖苷酶動(dòng)力學(xué)性質(zhì)及葡萄糖、木糖和葡萄糖醛酸內(nèi)酯對(duì)該酶的激活及抑制作用。結(jié)果表明:該酶對(duì)pNP-β-D-葡萄糖苷、pNP-β-D-半乳糖苷、纖維二糖、乳糖、龍膽二糖和水揚(yáng)苷的水解動(dòng)力學(xué)常數(shù)Km分別為0.54、5.28、0.98、26.34、6.92和1.72 mmol/L;在以對(duì)硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)為底物時(shí),5～150 mmol/L葡萄糖和20～600 mmol/L木糖對(duì)酶有激活作用,高于此范圍,則表現(xiàn)出抑制作用,葡萄糖醛酸內(nèi)酯具有很強(qiáng)的抑制作用,葡萄糖、木糖和葡萄糖醛酸內(nèi)酯抑制常數(shù)Ki值分別為63.4、170.3和0.038 mmol/L。木糖能促進(jìn)該酶對(duì)纖維二糖和乳糖的水解作用,木糖濃度為200 mmol/L時(shí),酶活分別增加189.6%和166.3%。該酶還具有轉(zhuǎn)糖苷活性,能夠?qū)⒗w維二糖部分轉(zhuǎn)化為纖維三糖和龍膽二糖。

β-葡萄糖苷酶,動(dòng)力學(xué),激活,抑制,轉(zhuǎn)糖苷

β-葡萄糖苷酶在食品、醫(yī)藥和化工行業(yè)具有廣泛的用途[1],按其存在位置,可分為胞內(nèi)和胞外β-葡萄糖苷酶。微生物的胞內(nèi)β-葡萄糖苷酶為β-葡萄糖苷酶A,并與人體內(nèi)的乳糖酶、根皮苷水解酶有高度的同源性,而胞外β-葡萄糖苷酶與β-葡萄糖苷酶B同源[2]。糖苷水解酶1家族的β-葡萄糖苷酶作用底物廣泛,大部分β-葡萄糖苷酶對(duì)底物的糖基部分結(jié)構(gòu)的專(zhuān)一性較差,能裂解C-O糖苷鍵、C-S鍵、C-N鍵、C-F鍵等;有些對(duì)糖基部分的C4和C2構(gòu)形也不專(zhuān)一,能同時(shí)水解β-葡萄糖苷酶鍵和β-半乳糖苷鍵;有些甚至C6位的專(zhuān)一性也不高,葡萄糖苷酶能夠催化水解半縮醛與環(huán)狀醛糖-OH之間的糖苷鍵,或是葡萄糖與其它化合物如糖、氨基醇、芳基醇或甲醇、乙醇和丙醇上的-OH之間的糖苷鍵;但在所有天然底物中,β-葡萄糖苷酶對(duì)纖維二糖的活性最強(qiáng)[3]。β-葡萄糖苷酶能夠水解纖維二糖、昆布二糖、槐糖和鄰硝基苯-β-D-葡萄糖苷,但是對(duì)其它的一些葡萄糖或是纖維二糖通過(guò)β-糖苷鍵連接起來(lái)的復(fù)合物水解速率非常低[4]。

β-葡萄糖苷酶一般受底物葡萄糖的抑制,但近來(lái)發(fā)現(xiàn)一些能被葡萄糖和木糖激活的β-葡萄糖苷酶,如特異腐質(zhì)霉(Humicola insolens)[5]、嗜熱柱霉(Scytalidum thermophilum)[6]、灰腐殖霉高溫變種(Humicola grisea var. thermoidea)[7],另外還發(fā)現(xiàn)一些葡萄糖苷酶在不同溫度,不同底物和葡萄糖濃度下表現(xiàn)出的抑制和激活作用也不一樣[8]。因此,研究不同來(lái)源β-葡萄糖苷酶的動(dòng)力學(xué)性質(zhì)、激活和抑制作用,對(duì)于探索該酶作用機(jī)制,實(shí)際應(yīng)用及拓寬該酶在醫(yī)療等領(lǐng)域的應(yīng)用具有重要的意義。本研究擬對(duì)分離得到的一株耐熱真菌擬青霉FLH30胞內(nèi)β-葡萄糖苷酶的部分底物的動(dòng)力學(xué)參數(shù)進(jìn)行測(cè)定,同時(shí),探索葡萄糖、木糖和葡萄糖醛酸內(nèi)酯對(duì)該酶的激活及抑制作用,為該酶的應(yīng)用奠定一定的基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

擬青霉FLH30胞內(nèi)β-葡萄糖苷酶10 mg/mL,本實(shí)驗(yàn)室分離純化,電泳純;葡萄糖、木糖、葡萄糖醛酸內(nèi)酯、纖維二糖、纖維三糖、乳糖、pNP-β-D-葡萄糖苷、pNP-β-D-半乳糖苷、水楊苷Sigma公司,分析純;纖維四糖自制;葡萄糖氧化酶試劑盒北京北化康泰化學(xué)試劑有限公司;其它試劑均為分析純。

Kieselgel 60層析板德國(guó)Merck公司;TU-1800PC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)北京普析通用儀器設(shè)備有限責(zé)任公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定采用50 mmol/L,pH6.0 Na2HPO4-Citric緩沖液分別配制pNP-糖苷、纖維二糖、龍膽二糖、乳糖、龍膽二糖和水揚(yáng)苷反應(yīng)底物,使底物濃度在0.1～60 mmol/L之間,55 ℃反應(yīng)2 min,測(cè)定酶活。pNP-糖苷類(lèi)底物以水解釋放出pNP的速率來(lái)計(jì)算酶活力,二糖底物通過(guò)檢測(cè)水解過(guò)程中釋放出葡萄糖的速率來(lái)計(jì)算酶活力。葡萄糖的濃度采用葡萄糖氧化酶試劑盒測(cè)定。酶活力單位定義為在上述條件下每分鐘反應(yīng)生成1 μmol pNP、葡萄糖或還原糖所需要的酶量。其中纖維二糖和龍膽二糖,一個(gè)酶活力單位為生成2 μmol的葡萄糖的量,將底物濃度(mmol/L)和反應(yīng)速率(μmol·min-1·mg-1)輸入酶動(dòng)力學(xué)軟件Grafit測(cè)定Km和Vmax。

1.2.2葡萄糖、木糖和D-葡糖酸-δ-內(nèi)酯對(duì)β-葡萄糖苷酶的作用以50 mmol/L,pH6.0的Na2HPO4-Citric緩沖液配制10 mmol/L的pNPG,分別加入終濃度為5～1000 mmol/L的葡萄糖、木糖及葡萄糖和木糖的混合液(葡萄糖和木糖混合液分別添加等濃度的葡萄糖和木糖,每種糖的濃度和單糖作用時(shí)濃度一致),D-葡糖酸-δ-內(nèi)酯濃度為0.01～2 mmol/L每毫升反應(yīng)體系加入對(duì)pNPG 1個(gè)單位的酶活,55 ℃反應(yīng)10 min,按1.2.1測(cè)定酶活,以不加糖的體系作為100%對(duì)照,研究葡萄糖、木糖和D-葡糖酸-δ-內(nèi)酯對(duì)β-葡萄糖苷酶活性的影響。

以50 mmol/L,pH6.0的Na2HPO4-Citric緩沖液配制底物(纖維二糖和乳糖)溶液、激活劑(木糖)溶液,整個(gè)反應(yīng)體系控制底物終濃度為10 mmol/L,添加不同濃度木糖(20～600 mmol/L),55 ℃反應(yīng)2 min,按1.2.1測(cè)定酶活,以不加木糖的酶活作為100%對(duì)照,研究木糖對(duì)該酶水解10 mmol/L纖維二糖和10 mmol/L乳糖的影響。

1.2.3葡萄糖醛酸內(nèi)酯抑制常數(shù)Ki的測(cè)定整個(gè)反應(yīng)體系以50 mmol/L pH6.0的Na2HPO4-Citric緩沖液配制,使pNPG濃度為0.5、1.0和1.5 mmol/L,葡萄糖醛酸內(nèi)酯濃度0.025～0.15 mmol/L,55 ℃反應(yīng)2 min,分別測(cè)定在3個(gè)底物濃度、不同內(nèi)酯濃度下的初速度(每毫升反應(yīng)體系加入對(duì)pNPG 2個(gè)單位的酶活,使底物消耗量小于10%),以速率的倒數(shù)對(duì)內(nèi)酯的濃度作圖,通過(guò)Dixon plots求得,每個(gè)反應(yīng)作三個(gè)平行。

1.2.4葡萄糖和木糖抑制常數(shù)Ki的測(cè)定pNPG和葡萄糖、pNPG和木糖反應(yīng)體系以50 mmol/L,pH6.0的Na2HPO4-Citric緩沖液配制,使pNPG濃度為0.5、1.0和1.5 mmol/L,葡萄糖濃度為300、400和600 mmol/L,木糖濃度800、900和1000 mmol/L,55 ℃反應(yīng)2 min。分別測(cè)定不同底物濃度下的初速度(每mL反應(yīng)體系加入對(duì)pNPG 1個(gè)單位的酶活,使底物消耗量小于10%),以速率v的倒數(shù)對(duì)葡萄糖和木糖濃度的倒數(shù)作圖,利用SigmaPlot Enzyme Kinetics Module(Systat Software Inc. San Jose,California,USA)分析軟件分析,通過(guò)Lineweaver-Burk作圖法求得,每個(gè)反應(yīng)作三個(gè)平行。

1.2.5葡萄糖和木糖激活常數(shù)K0.5的測(cè)定整個(gè)反應(yīng)體系以50 mmol/L,pH6.0的Na2HPO4-Citric緩沖液配制。底物pNPG濃度分別配制兩個(gè)范圍:低濃度范圍(0.15～0.9 mmol/L)和高濃度范圍(1.5～4 mmol/L)。低底物濃度下,葡萄糖和木糖濃度分別為5和20 mmol/L;高底物濃度下,葡萄糖和木糖濃度分別為50和200 mmol/L,分別測(cè)定不同底物濃度下的反應(yīng)速率。利用SigrafW software(http://portal.ffclrp.usp.br/sites/ivana/downloads)[9],以v/V對(duì)lg[S]作圖,使用方程:

式中v為反應(yīng)速率;V1和V2分別為酶與多底物結(jié)合位點(diǎn)的最大反應(yīng)速率;S為底物濃度;n1和n2為Hill系數(shù);K1和K2為酶與底物結(jié)合常數(shù)。

1.2.6轉(zhuǎn)糖苷實(shí)驗(yàn)以50 mmol/L,pH6.0的Na2HPO4-Citric緩沖液配制5%、10%、15%、20%的纖維二糖和10 mmol/L的pNPG,分別添加終濃度為0.5 U/mL和1.0 U/mL的β-葡萄糖苷酶55 ℃保溫,定時(shí)取樣沸水浴10 min滅酶活,上樣2 μL進(jìn)行薄層層析(TLC)分析,展層系統(tǒng)為正丁醇/乙酸/水系統(tǒng)(2∶1∶1,v/v/v),將水解的樣品點(diǎn)樣后展開(kāi)兩次,吹干后用硫酸∶甲醇(5∶95,v/v)溶液浸濕,最后在130 ℃烘箱中烘烤顯色。同時(shí),為考察葡萄糖對(duì)酶的激活可能是轉(zhuǎn)糖苷作用,在pNPG為10 mmol/L時(shí),分別加入100 mmol/L葡萄糖和木糖,按上述方法進(jìn)行TLC分析。分別稱(chēng)取等量的纖維多糖、葡萄糖和木糖配制成總濃度為0.1 g/mL纖維多糖標(biāo)準(zhǔn)品Gn、纖維多糖+木糖標(biāo)準(zhǔn)品Gn+X。

表1　β-葡萄糖苷酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)

圖1　葡萄糖、木糖和D-葡糖酸-δ-內(nèi)酯對(duì)葡萄糖苷酶的影響Fig.1　Effects of glucose,xylose and D-δ-gluconolactone注:a:底物pNPG濃度為5 mmol/L時(shí)葡萄糖和木糖對(duì)酶的影響;b:木糖對(duì)酶水解10 mmol/L纖維二糖和10 mmol/L乳糖的影響;c:D-葡糖酸-δ-內(nèi)酯對(duì)重組酶的影響。

2　結(jié)果與討論

2.1動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定

圖2　D-葡糖酸-δ-內(nèi)酯(a)、葡萄糖(b)和木糖(c)對(duì)葡萄糖苷酶的抑制常數(shù)Fig.2　Effects of D-δ-gluconolactone(a),glucose(b)and xylose(c)

由表1可知,該酶具有較寬的底物作用范圍,其中對(duì)pNP-β-D-葡萄糖苷有較高的催化效率,其次是纖維二糖,Kcat/Km分別為10.15 mg-1·s-1·mL和5.36 mg-1·s-1·mL。

2.2葡萄糖、木糖和D-葡糖酸-δ-內(nèi)酯對(duì)葡萄糖苷酶的作用

由圖1可知,一定濃度的葡萄糖(5～150 mmol/L)和木糖(20～600 mmol/L)對(duì)酶有激活作用,高于此值,則表現(xiàn)出抑制作用,其中葡萄糖在40 mmol/L、木糖在200 mmol/L時(shí)激活作用最強(qiáng),使酶活力分別增加114.3%和155.2%(圖1a),在木糖濃度為200 mmol/L時(shí),該酶對(duì)纖維二糖和乳糖的酶活分別增加為189.6%和166.3%(圖1b)。此酶較耐葡萄糖的抑制,1000 mmol/L的濃度酶活還保持在20%以上。結(jié)果顯示,混合糖激活作用在總糖濃度小于200 mmol/L時(shí),處于兩種單糖激活作用之間(圖1a),表明該β-葡萄糖苷酶可能為單一激活位點(diǎn)。由圖1c可知,D-葡糖酸-δ-內(nèi)酯強(qiáng)烈抑制酶活。

2.3葡萄糖、木糖和D-葡糖酸-δ-內(nèi)酯抑制常數(shù)Ki的測(cè)定

采用Dixon作圖法及Lineweaver-Burk法測(cè)得D-葡糖酸-δ-內(nèi)酯(圖2a)、葡萄糖(圖2b)、和木糖(圖2c)的Ki值分別為0.038、63.4和170.3 mmol/L。

2.4葡萄糖和木糖激活作用

動(dòng)力學(xué)研究表明,在不同底物(pNPG)濃度下,葡萄糖和木糖對(duì)葡萄糖苷酶的激活作用也不一樣。由圖3、圖5可知,在底物濃度<1 mmol/L時(shí),激活作用隨糖濃度的增加而減小,在底物濃度>2 mmol/L時(shí),激活作用隨糖濃度的增加而增大。K0.5值計(jì)算利用SigrafW software非線(xiàn)性擬合方法進(jìn)行。在底物濃度<1 mmol/L,葡萄糖濃度為5和50 mmol/L時(shí),激活常數(shù)K0.5分別為0.36和0.78 mmol/L(見(jiàn)圖4);木糖濃度為20和200 mmol/L時(shí),激活常數(shù)K0.5分別為0.51和1.18 mmol/L(見(jiàn)圖6)。

圖3　不同濃度的葡萄糖對(duì)酶反應(yīng)速率的影響Fig.3　Different content of glucose influce on initial velocity

圖4　低底物(pNPG)濃度(a)和高底物濃度(b)下Hill方程非線(xiàn)性擬合曲線(xiàn)Fig.4　Plot of v/V versus log[pNPG]for the hydrolysis of pNPG in low/high concentration of pNPG注:(a)底物濃度小于1 mmol/L,葡萄糖濃度5 mmol/L;(b)底物濃度大于1 mmol/L,葡萄糖濃度50 mmol/L。

圖5　不同濃度的木糖對(duì)酶反應(yīng)速率的影響Fig.5　Different content of xylose influce on initial velocity

圖6　低底物(pNPG)濃度(a)和高底物濃度(b)下Hill方程非線(xiàn)性擬合曲線(xiàn)Fig.6　Plot of v/V versus log[pNPG]for the hydrolysis of pNPG in low/high concentration of pNPG注:(a)底物濃度小于1 mmol/L,木糖濃度20 mmol/L;(b)底物濃度大于1 mmol/L,木糖濃度200 mmol/L。

2.5轉(zhuǎn)糖苷實(shí)驗(yàn)

葡萄糖對(duì)該酶的激活另一方面可能是轉(zhuǎn)糖苷作用的結(jié)果,在pNPG為10 mmol/L,葡萄糖為100 mmol/L時(shí),在最初的1 h內(nèi)觀察到有二糖的生成(圖7a)。而添加木糖(圖7b)沒(méi)有觀察到有產(chǎn)物生成。

圖7　以pNPG為底物時(shí)葡萄糖(a)和木糖(b)對(duì)酶影響的TLC分析Fig.7　Analysised production of pNPG and glucose(a)or xylose(b)by TLC at different time注:Gn:纖維多糖標(biāo)準(zhǔn)品;Gn+X:纖維多糖+木糖標(biāo)準(zhǔn)品。

圖8　以纖維二糖為底物轉(zhuǎn)糖苷作用的TLC分析Fig.8　Analysised transglycosylation using cellobiose as substrate at different time 注:a～d加酶量為0.5 U/mL;e～h:加酶量為1.0 U/mL。

以纖維二糖為底物的轉(zhuǎn)糖苷作用:當(dāng)加酶量為0.5 U/mL時(shí),在5%濃度的底物,在24 h合成的三糖量達(dá)到最大,隨后降低(圖8a)。而10%、15%和20%的底物濃度,在60 h內(nèi),隨時(shí)間的增加,合成的三糖量逐漸增加(圖8b～d)。由圖8a～d可知,同時(shí)在5%底物濃度時(shí),合成的龍膽二糖(纖維二糖與纖維三糖之間的斑點(diǎn))隨時(shí)間增加而增加,而高濃度的底物,龍膽二糖合成量較少。由圖8e～h可知,加酶量為1.0 U/mL時(shí),5%底物濃度在48 h后,產(chǎn)物主要為單糖和龍膽二糖;在底物濃度為10%時(shí),在單糖與二糖之間又生成一新糖,同時(shí),龍膽二糖明顯比加酶量為0.5 U/mL時(shí)要多;而在底物濃度為15%和20%時(shí),龍膽二糖含量相比低底物濃度時(shí)明顯又逐漸減少,三糖含量沒(méi)有明顯變化。

3　結(jié)論與討論

本研究對(duì)新得到的擬青霉FLH30胞內(nèi)β-葡萄糖苷酶進(jìn)行了底物動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)定,其中對(duì)天然底物纖維二糖具有較高的催化效率,這為該酶的多底物水解在實(shí)際應(yīng)用中提供了生產(chǎn)參數(shù)借鑒。一定濃度的葡萄糖(5～150 mmol/L)和木糖(20～600 mmol/L)對(duì)該酶有激活作用,同時(shí),木糖還能促進(jìn)該酶對(duì)纖維二糖和乳糖的水解作用;而葡萄糖醛酸內(nèi)酯對(duì)該酶具有很強(qiáng)的抑制作用。這可能為該酶在實(shí)際應(yīng)用中擴(kuò)大其應(yīng)用范圍,如乳糖的水解等,解除一些抑制因素等提供一定的指導(dǎo)意義。該酶能以pNPG和纖維二糖為底物產(chǎn)生轉(zhuǎn)糖苷作用,能夠?qū)⒗w維二糖部分轉(zhuǎn)化為纖維三糖和龍膽二糖,在實(shí)際應(yīng)用中可用于合成芳基、烷基糖及其它低聚糖。

其中,木糖和葡萄糖的激活作用表明,該β-葡萄糖苷酶中可能存在激活位點(diǎn),且葡萄糖和木糖參與激活作用時(shí),結(jié)合的位點(diǎn)為一個(gè)位點(diǎn),但這個(gè)激活位點(diǎn)是位于活性中心內(nèi)還是活性中心外還不確定,需要結(jié)合結(jié)構(gòu)生物學(xué)進(jìn)一步證實(shí)。Laurent Fourage等[10]研究了來(lái)源于Thermusthermophilus的1家族β-葡萄糖苷酶(Ttβgly)的作用機(jī)制,他們認(rèn)為,在低溫和高濃度底物下,(Gly-X,X:芳基)形成E-Gly/Gly-X,從而表現(xiàn)出抑制現(xiàn)象,在較高溫度下,轉(zhuǎn)糖苷機(jī)制占主要作用,形成Gly-Gly-X,表現(xiàn)出激活作用。當(dāng)加入一定濃度的葡萄糖時(shí),在低的底物濃度和較低溫度下,葡萄糖和底物競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合酶的活性中心,表現(xiàn)出抑制現(xiàn)象,而當(dāng)?shù)孜锔哂谝慌R界濃度且溫度高于一定值的時(shí)候,葡萄糖可以作為糖苷受體生成Gly-Glc從而表現(xiàn)出激活現(xiàn)象。而來(lái)源于擬青霉FLH30胞內(nèi)β-葡萄糖苷酶在低底物濃度下,隨葡萄糖和木糖濃度的增加這種激活作用越明顯,當(dāng)?shù)孜锔哂谝欢舛?激活作用反而變小,轉(zhuǎn)糖苷作用也是在低底物濃度下速度快、產(chǎn)量高,同時(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),提高酶量,在適宜的底物濃度下,合成新糖的種類(lèi)也增加。由于不同來(lái)源的β-葡萄糖苷酶差異比較大,組成(β/α)8口袋式結(jié)構(gòu)的(pocket or crater)深度和長(zhǎng)度不一樣,其結(jié)合底物鏈的長(zhǎng)度也不一樣[11-12],活性中心氨基酸的組成及蛋白單體的聚合形式等都對(duì)酶的性質(zhì)造成影響,導(dǎo)致不同來(lái)源物種及同一物種的不同糖苷酶也千差萬(wàn)別,其具體作用方式有待于進(jìn)一步研究。

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Kinetics,activation,inhibition and transglycosylation of theβ-glucosidase fromPaecilomycessp. FLH30

HUA Cheng-wei,YU Jiang-ao,LI Lan,CHANG Jing-ling,ZHANG Zhi-hong

(School of Life Science and Technology,Henan Institute of Science and Technology,Xinxiang 453003,China)

Theβ-glucosidase fromPaecilomycessp. FLH30 exhibited a broad substrate specificity. The enzyme hydrolyzed pNPG,pNP-β-D-galactoside,cellobiose,lactose,salicin,gentiobiose,exhibiting apparent kinetics constant(Km)values of 0.54,5.28,0.98,26.34,6.92 and 1.72 mmol/L,respectively. A certain concentration of glucose(5～150 mmol/L)and xylose(20～600 mmol/L)had an activation on the enzymes use pNPG as substrate,above the value then demonstrated inhibition. Glucuronolactone had strongly inhibited the enzyme activity,the value of inhibite constant Kiof glucose,xylose and glucuronolactone was 63.4,170.3 and 0.038 mmol/L. Xylose also had an activation on the enzyme hydrolysis of cellobiose and lactose,the enzyme activity increased by 189.6% and 166.3% respectively in the xylose concentration 200 mmol/L. Furthermore,the enzyme showed transglycosylation activity and could produced cellotriose and gentibiose use cellobiose as substrate.

β-glucosidase;kinetics;activation;inhibition;transglycosylation

2015-07-06

華承偉(1972-)，男，博士，副教授，研究方向：酶工程、食品生物技術(shù)，E-mail：cwhua@hist.edu.cn。

河南科技學(xué)院重點(diǎn)科研項(xiàng)目(201010611004)。

TS202.3

A

1002-0306(2016)16-0130-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.16.018