17種植物揮發(fā)油對食源微生物抑菌活性研究

潘旭遲,傅昱晟,許劍鋒,朱靖豪

(上海海洋大學(xué)食品學(xué)院,上海 201306)

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17種植物揮發(fā)油對食源微生物抑菌活性研究

潘旭遲,傅昱晟,許劍鋒*,朱靖豪

(上海海洋大學(xué)食品學(xué)院,上海 201306)

采用抑菌圈實(shí)驗(yàn)研究17種天然源植物揮發(fā)油對大腸桿菌(E.coli),沙門氏菌(S.a.),金黃色葡萄球菌(S.aureus)和李斯特菌(Lis)的抑菌效果,通過Matlab的評價(jià),篩選得到10種具有廣譜抑菌性且抑菌效果較好的產(chǎn)品進(jìn)行最小抑菌濃度(Minimum Iinhibitory Concentration,MIC)和最小殺菌濃度(Minimum Bactericidal Concentration,MBC)實(shí)驗(yàn),并利用氣相色譜-質(zhì)譜法(Gas Chromatography-mass spectrometry,GC-MS)分析得到效果最好的留蘭香油的有效活性成分。結(jié)果表明:留蘭香油對4種實(shí)驗(yàn)細(xì)菌均有較強(qiáng)的抑制作用,其MIC均在6.25 mg·mL-1,MBC均在50 mg·mL-1,有效活性成分為檸檬烯(13.71%)和左旋香芹酮(71.34%),其中左旋香芹酮對E.coli和S.aureus具有更強(qiáng)的抑菌效果,MIC及MBC均在12.5 μg·mL-1。佐以掃描電鏡實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)加入左旋香芹酮后培養(yǎng)的細(xì)菌會產(chǎn)生皺縮或破裂現(xiàn)象,說明左旋香芹酮可抑制實(shí)驗(yàn)細(xì)菌的生長繁殖,最終導(dǎo)致細(xì)菌死亡。初步表明在留蘭香油中左旋香芹酮是主要抑菌成分。

留蘭香,抑菌,大腸桿菌,金黃色葡萄球菌,沙門氏菌,掃描電鏡,氣相色譜-質(zhì)譜,MATLAB軟件

食源性疾病是較為常見的一類影響人類健康的問題,在美國,每年有1/6的人由于食用被微生物污染的食物而導(dǎo)致疾病發(fā)生[16],為使得食品能夠保證較為長久的新鮮程度,多在食品中添加防腐劑,以提高食品的抗菌、抗氧化性能[1]。目前使用最多的為化學(xué)防腐劑,如苯甲酸及其鹽類、山梨酸及其鹽類等[2]。有研究表明:苯甲酸鈉在人體胃腸道的酸性條件下會轉(zhuǎn)換成毒性較強(qiáng)的苯甲酸,有可能引起胃腸功能的減退,增加肝臟的負(fù)擔(dān)[3]。因此在崇尚綠色、安全、天然的今天,人們尋找“天然源防腐劑”以代替人工防腐劑,在食品行業(yè)的發(fā)展中也將成為一項(xiàng)勢在必行的重要課題[4]。本文以天然源植物揮發(fā)油為原料,對其抑菌效果進(jìn)行分析評估,以此尋找與目前人工防腐劑抑菌效果相當(dāng)?shù)漠a(chǎn)品。

許多研究報(bào)道了天然源植物揮發(fā)油對食源性致病菌的抑制效果,如:鄧業(yè)成[5]等人研究了4種植物精油的抑菌活性及其在漱口水中的應(yīng)用;孫立春[6]等人制備了14種植物提取物,并證明其中五倍子及石榴皮醇提取物的抑菌效果更優(yōu)于同質(zhì)量濃度的山梨酸鉀;呂爽[7]等人則對比分析椒樣薄荷與蘇格蘭留蘭香精油的抑菌活性,為其多角度開發(fā)提供依據(jù)。本文則在現(xiàn)有研究基礎(chǔ)上改進(jìn)實(shí)驗(yàn)方案,采用更大量的天然源植物揮發(fā)油作為樣品進(jìn)行抑食源性致病菌生長效果的比較,并利用矩陣運(yùn)算、統(tǒng)計(jì)分析函數(shù)及Matlab的評價(jià),進(jìn)一步針對效果最好的留蘭香油進(jìn)行GC-MS抑菌活性成分分析及掃描電鏡的研究,旨在篩選天然源植物揮發(fā)油中具有廣譜抑菌性及抑菌效果較好的產(chǎn)品,以此為天然食品防腐劑的選擇提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

檸檬油、香茅油、艾葉油、金銀花油、茶樹油、荊芥油、陳皮油、丁香油、百里香油、冬青油、大蒜精油、紫蘇葉油、留蘭香油、水溶性生姜精油、姜油樹脂、芹菜籽油、肉豆蔻吉安市聚鵬天然香料油;左旋香芹酮標(biāo)準(zhǔn)品HPLC≥98%,阿拉丁;檸檬烯HPLC≥98%,上海源葉生物科技有限公司;供試菌包括大腸桿菌(E.coliATCC25922)、沙門氏菌(S.a. CMCC50041)、金黃色葡萄球菌(S.aureusATCC25923)、李斯特菌(LisATCC19115)中國科學(xué)院微生物研究所;胰蛋白胨大豆瓊脂、胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基、MH肉湯青島高科園海博生物技術(shù)有限公司;二甲基亞砜、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、戊二醛2.5%、無水乙醇、鋨酸均為分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;碘硝基四唑紫(INT)生工生物工程(上海)股份有限公司。

MLS-3750全自動高壓蒸汽滅菌鍋日本三洋;ESCO垂直流超凈工作臺新加坡ESCO公司;BPH-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱上海百典;SHP-2008恒溫培養(yǎng)振蕩器上海世平實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;DHG-9073B5-Ⅲ電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱上海新苗醫(yī)療器械制藥有限公司;VOYAGER氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀美國Finnigan公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 抑菌圈實(shí)驗(yàn)參考Chan[8]等方法測定抑菌圈直徑。將17種天然源植物揮發(fā)油分別配制成質(zhì)量濃度為0.5 g·mL-1的水溶液。將活化后的E.coli、S.a.、S.aureus、Lis接種量分別調(diào)整至106、105、106、104cfu/mL。用移液槍取0.1 mL,均勻涂布在制備好的平板上,置于37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中10 min,用無菌鑷子將濾紙片貼在培養(yǎng)基表面,輕壓紙片以確保接觸良好。吸5 μL樣品滴于濾紙片表面并做好標(biāo)記。37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,觀察抑菌圈大小并測定其直徑,3組平行取平均值。

1.2.3MIC和MBC的測定參考微量肉湯稀釋法[9-10],采用篩選的10種揮發(fā)油進(jìn)行MIC及MBC的測定。將篩選后的10種揮發(fā)油樣品溶解在DMSO中,樣品質(zhì)量濃度配制成100 mg·mL-1,經(jīng)二倍系列稀釋,得到系列質(zhì)量濃度為:100、50、25、12.5、6.25、3.13 mg·mL-1。實(shí)驗(yàn)組每孔加入50 μL菌液和50 μL樣品,對照組只加50 μL菌液和50 μL DMSO,將96孔板置于恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃條件下培養(yǎng)24 h,取出,每孔加入10 μL的INT溶液,染色30 min后觀察顏色變化:活細(xì)胞經(jīng)INT染色后為紫色,無活細(xì)胞則不變色,顏色沒有變化的最小濃度即為MIC;培養(yǎng)48 h后,顏色沒有變化的最小濃度即為MBC。

1.2.4留蘭香油的GC-MS分析[11-13]色譜柱:HP-5彈性石英毛細(xì)管柱(30.0 m×0.25 mm×0.25 μm);升溫程序:初始溫度60 ℃,以2 ℃/min升溫至260 ℃;載氣(He)流速1.0 mL/min,進(jìn)樣量0.2 μL;分流比20∶1。

質(zhì)譜條件:電子轟擊(EI)離子源;電子能量70 eV;離子源溫度270 ℃;激活電壓1.5 V;質(zhì)量掃描范圍m/z 29～420;掃描間歇1.0 s;倍增器電壓280 V。

1.2.5檸檬烯和左旋香芹酮標(biāo)準(zhǔn)品抑菌實(shí)驗(yàn)

1.2.5.1抑菌圈實(shí)驗(yàn)參考Chan[8]等方法測定抑菌圈直徑。將檸檬烯、左旋香芹酮標(biāo)準(zhǔn)品配制成0.5 mg·mL-1的水溶液。將活化后的E.coli、S.a.、S.aureus、Lis接種量分別調(diào)整至106、105、106、104cfu/mL。用移液槍取0.1 mL,均勻涂布在制備好的平板上,置于37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中10 min,用無菌鑷子將濾紙片貼在培養(yǎng)基表面,輕壓紙片以確保接觸良好。吸5 μL樣品滴于濾紙片表面并做好標(biāo)記。37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,觀察抑菌圈大小并測定其直徑,3組平行取平均值。

1.2.5.2MIC和MBC的測定參考微量肉湯稀釋法[9-10],采用檸檬烯、左旋香芹酮標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行MIC及MBC的測定。將標(biāo)準(zhǔn)品濃度配制成100 μg·mL-1,經(jīng)二倍系列稀釋,得到系列質(zhì)量濃度為:100、50、25、12.5、6.25、3.13 μg·mL-1。實(shí)驗(yàn)組每孔加入50 μL菌液和50 μL樣品,對照組只加50 μL菌液和50 μL DMSO,將96孔板置于恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃條件下培養(yǎng)24 h,取出,每孔加入10 μL的INT溶液,染色30 min后觀察顏色變化:活細(xì)胞經(jīng)INT染色后為紫色,無活細(xì)胞則不變色,顏色沒有變化的最小濃度即為MIC;培養(yǎng)48 h后,顏色沒有變化的最小濃度即為MBC。

1.2.6掃描電鏡分析[14]根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品MIC、MBC實(shí)驗(yàn)效果,選取效果更優(yōu)的左旋香芹酮進(jìn)行掃描電鏡分析。將經(jīng)活化后的E.coli、S.a.、S.aureus、Lis接種于新鮮的TSB培養(yǎng)基中,調(diào)整在實(shí)驗(yàn)菌中左旋香芹酮標(biāo)準(zhǔn)品濃度為25 μg·mL-1(2×MIC),在37 ℃,150 r/min條件下?lián)u床振蕩培養(yǎng)12 h。先后用戊二醛和鋨酸固定后,乙醇脫水、烘干備用。掃描電鏡實(shí)驗(yàn)時(shí)將其進(jìn)行離子濺射金后,即可進(jìn)行掃描電鏡觀察。1.2.7 數(shù)據(jù)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的均值,數(shù)據(jù)用Excel 2010進(jìn)行處理,計(jì)算其均值與標(biāo)準(zhǔn)差。

表1　17種天然源植物揮發(fā)油抑菌圈實(shí)驗(yàn)結(jié)果(mm)

注:-表示在此條件下無抑菌圈產(chǎn)生。

2　結(jié)果與分析

2.1揮發(fā)油抑菌圈直徑及MIC、MBC

2.1.1揮發(fā)油抑菌圈直徑對表1數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,水溶性生姜精油及芹菜籽油對實(shí)驗(yàn)細(xì)菌不具有抑菌效果,荊芥油、紫蘇葉油、姜油樹脂、肉豆蔻則僅對其中2種細(xì)菌具有抑菌效果,且效果不顯著;而留蘭香油、丁香油效果更好,抑菌圈大小均在14.5 mm及以上,其中留蘭香油、丁香油對S.a.抑菌效果最好,高達(dá)18.9 mm及以上。由表2結(jié)合F值分析,排除ω2中抑菌圈直徑全為0的揮發(fā)油的干擾因素,抑菌普適性最強(qiáng)者為丁香油,留蘭香油次之,檸檬油位于第三位。而在個(gè)別菌的抑制效果上,檸檬油對于Lis抑制效果較其他油更好,丁香油在抑制S.a.效果上最好,留蘭香油對E.coli及S.aureus的抑制效果相對更佳,因此不同揮發(fā)油對于不同菌種也會產(chǎn)生特別的抑制效果,可結(jié)合實(shí)際應(yīng)用選擇最適揮發(fā)油,從ω3～ω6的評定可得,留蘭香油最佳。

2.1.2揮發(fā)油MIC與MBC實(shí)驗(yàn)結(jié)果從表3可得,艾葉油在實(shí)驗(yàn)最大100 mg·mL-1質(zhì)量濃度下對實(shí)驗(yàn)細(xì)菌還未能起抑制作用,實(shí)驗(yàn)中抑菌效果最差。冬青油和金銀花油在100 mg·mL-1時(shí)對S.a.不具有抑菌效果,效果不佳。就抑菌范圍,檸檬油、茶樹油、丁香油及留蘭香油抑菌范圍最廣,對4種實(shí)驗(yàn)細(xì)菌均具有較好的抑制效果,其中丁香油對S.aureus的抑制效果更優(yōu),MIC為3.13 mg·mL-1,對于Lis的抑菌效果與同質(zhì)量濃度揮發(fā)油相比略遜一籌。相比之下,留蘭香油對于4種細(xì)菌的抑制效果更為穩(wěn)定,都在6.25 mg·mL-1。從MBC實(shí)驗(yàn)結(jié)果可得,檸檬油對E.coli、茶樹油對S.a殺菌效果不明顯,只能在一定質(zhì)量濃度下起到抑菌效果。丁香油和留蘭香油對于E.coli、S.a.、S.aureus的MBC均在50 mg·mL-1,但是留蘭香油在Lis上的MBC比丁香油更小,即在Lis上的殺菌效果比丁香油效果更好。

表2　17種天然源植物揮發(fā)油綜合評估

表3　10種天然源植物揮發(fā)油對4種供試菌的MIC、MBC實(shí)驗(yàn)結(jié)果

注:/:表示在抑菌圈實(shí)驗(yàn)中樣品對該實(shí)驗(yàn)細(xì)菌不產(chǎn)生抑制效果;-:表示在MIC、MBC實(shí)驗(yàn)中實(shí)驗(yàn)樣品的最大質(zhì)量濃度100 mg·mL-1對該菌不產(chǎn)生抑制作用,但在抑菌圈實(shí)驗(yàn)中具有抑菌效果;表5同。

2.2GC-MS分析留蘭香油的主要成分

根據(jù)GC-MS色譜圖峰形,直接采用數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)庫搜索后定量分析得到其中化合物含量在1%以上的有5種化合物,依次為:桉樹醇、二氫香芹酮、乙酸二氫香芹酮、左旋香芹酮及檸檬烯,其中,桉樹醇、二氫香芹酮、乙酸二氫香芹酮含量在1.37%～2.31%,檸檬烯含量在13.71%,左旋香芹酮含量在71.34%,五種化合物共占留蘭香油90.51%。其中左旋香芹酮及檸檬烯含量遠(yuǎn)大于其他幾種化合物,與現(xiàn)有研究中報(bào)道[13,15]的留蘭香油主要成分基本一致,證明了實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。故針對這兩種化合物進(jìn)行進(jìn)一步研究分析。

圖1　留蘭香油GC-MS圖Fig.1　GC-MS of spearmint oil

2.3檸檬烯與左旋香芹酮的抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果

對留蘭香油活性成分進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn),結(jié)果見表4、表5。在抑菌圈實(shí)驗(yàn)中,同等質(zhì)量濃度的左旋香芹酮皆優(yōu)于檸檬烯,且對于S.a.的抑菌圈直徑達(dá)到19.3 mm。就抑菌范圍及抑菌效果來說,檸檬烯在最大質(zhì)量濃度時(shí)對S.a.沒有抑菌效果,且對S.a.和S.aureus同樣不具有殺菌效果。而左旋香芹酮不但對于4種實(shí)驗(yàn)細(xì)菌的MIC均在12.5 μg·mL-1且都具有殺菌效果,其中以對E.coli和S.aureus的殺菌效果最好,MBC在12.5 μg·mL-1。又因左旋香芹酮在留蘭香油中含量最高,可初步判定,留蘭香油中主要起抑菌效果的成分為左旋香芹酮,檸檬烯輔之。

表4　檸檬烯及左旋香芹酮抑菌圈直徑實(shí)驗(yàn)結(jié)果(mm)

表5　檸檬烯及左旋香芹酮對4種供試菌的MIC、MBC實(shí)驗(yàn)

2.4掃描電鏡分析

左旋香芹酮作用前后的E.coli、S.a.、S.Aureus和Lis的菌體形態(tài)分別如圖2～圖5所示。對照組的菌體表面光滑、外觀飽滿、折光性好,而實(shí)驗(yàn)組的菌體則產(chǎn)生皺縮、干癟,且菌體表面有明顯的凹陷,證明左旋香芹酮對于實(shí)驗(yàn)細(xì)菌具有抑制生長繁殖,破壞細(xì)胞膜,使細(xì)胞膜通透性增加,大分子物質(zhì)泄露的作用,最終導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞死亡。

圖2　左旋香芹酮處理前后的E.coli對比圖Fig.2　Scanning electron mictographs of E.coli treated with L(-)-Carvone注：對照組：60000×;實(shí)驗(yàn)組：50000×。

圖3　左旋香芹酮處理前后的S.a.對比圖(50000×)Fig.3　Scanning electron mictographs of S.a. treatedwith L(-)-Carvone(50000×)

圖4　左旋香芹酮處理前后的S. Aureus對比圖(50000×)Fig.4　Scanning electron mictographs of S. Aureus treatedwith L(-)-Carvone(50000×)

圖5　左旋香芹酮處理前后的Lis對比圖(50000×)Fig.5　Scanning electron mictographs of Lis treatedwith L(-)-Carvone(50000×)

3　結(jié)論與討論

本文以17種天然源植物揮發(fā)油抑菌效果的研究為基礎(chǔ),從抑菌圈實(shí)驗(yàn)和96孔板微量稀釋實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,檸檬油、茶樹油、丁香油及留蘭香油對4種實(shí)驗(yàn)細(xì)菌都具有較好的抑制效果,其中丁香油及留蘭香油對實(shí)驗(yàn)細(xì)菌都起到良好殺菌作用。數(shù)據(jù)分析可得,不同揮發(fā)油在不同菌種的抑制效果上也有不同:例如百里香油對E.coli和S.aureus抑制效果弱,對Lis無抑制效果,但對S.a.在6.25 mg·mL-1即有抑菌作用。因此在作為肉類香辛料同時(shí),可調(diào)整用量或與其他揮發(fā)油復(fù)配作為防腐劑應(yīng)用于食品中,在成本上可以得到控制,便于食品工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)。丁香油和留蘭香油綜合抑菌效果最好,其中在Lis的殺菌效果上,留蘭香油的MBC更小于丁香油,可認(rèn)為留蘭香油的殺菌效果優(yōu)于丁香油。GC-MS分析得到留蘭香油的抑菌活性成分中含量最高的2個(gè)化合物為檸檬烯(13.71%)與左旋香芹酮(71.34%),并通過抑菌實(shí)驗(yàn),證明在留蘭香油中主要起抑菌效果的為左旋香芹酮。

通過掃描電鏡對比左旋香芹酮作用前后的細(xì)菌細(xì)胞形態(tài),發(fā)現(xiàn)加入左旋香芹酮的細(xì)菌發(fā)生皺縮、干癟、且菌體表面有明顯的凹陷,證明了左旋香芹酮對于實(shí)驗(yàn)細(xì)菌具有抑制生長繁殖,破壞細(xì)胞膜,使細(xì)胞膜通透性增加,大分子物質(zhì)泄露的作用,最終可以導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞死亡。因此可嘗試通過包合、微囊技術(shù)或使用天然助溶劑助溶等方法增加左旋香芹酮溶解度,便于添加到食品中使用。相比添加助溶劑不利于熱加工、有香味等,包合及微囊技術(shù)有助于掩蓋化合物本身香味,但同時(shí)也存在抑菌效果不良的風(fēng)險(xiǎn),因此也需根據(jù)實(shí)際應(yīng)用選擇最適添加方法。

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Study on the active ingredients for antibacterial activities of volatile oils from 17 kinds of natural plants

PAN Xu-chi,FU Yu-sheng,XU Jian-feng*,ZHU Jing-hao

(College of Food Science and Technology,Shanghai Ocean University,Shanghai 201306,China)

Antibacterial effects of volatile oils from 17 kinds of natural plants onEscherichiacoli,Staphylococcusaureus,Salmonellasspp. andListeriamonocytogeneswere investigated in this study.Inhibition zone and Matlab were employed to determine that the spearmint oil was the optimal solution for inhibiting the bacteria,the MIC and MBC were 6.25 mg·mL-1and 50 mg·mL-1respectively. Furthermore,the active ingredients of spearmint oil were identified as limonene(13.71%)and L(-)-carvone(71.34%)by using GC-MS,which had better antibacterial activity againstE.coliandS.aureus,both MIC and MBC were 12.5 μg·mL-1. The comprehensive analysis indicated that L(-)-carvone was the main factor for bacterial inactivation. And the SEM results showed bacterial cells were crumpled and ruptured after L(-)-carvone treatment,which demonstrated this substance could effectively suppress bacterial growth and reproduction.

spearmint;antibacterial;E.coli;S.aureus;Salmonellas;scanning electron microscope(SEM);gas chromatography-mass spectrometry(GC-MS);MATLAB

2016-02-17

潘旭遲(1995-)，女，本科在讀，研究方向：生物技術(shù)(海洋生物制藥)，E-mail：panxuchi1514@126.com。

許劍鋒(1968-)，博士，副教授，研究方向：海洋天然藥物，E-mail：jfxu@shou.edu.cn。

TS201.3

A

1002-0306(2016)16-0107-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.16.013