阿魏酸對體外培養(yǎng)的成骨細胞增殖、分化和礦化功能的影響

高建林，陳　珺，李　兵，盧　麗，楊國柱，陸幸妍，李青南

(1.東莞康華醫(yī)院藥劑科，廣東 東莞　523080；2.廣東藥學院生命科學與生物制藥學院，廣東 廣州　510006)

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阿魏酸對體外培養(yǎng)的成骨細胞增殖、分化和礦化功能的影響

高建林1,2，陳珺2，李兵1，盧麗2，楊國柱2，陸幸妍2，李青南2

(1.東莞康華醫(yī)院藥劑科，廣東 東莞523080；2.廣東藥學院生命科學與生物制藥學院，廣東 廣州510006)

阿魏酸；成骨細胞；細胞增殖；細胞分化；堿性磷酸酶；成骨基因

阿魏酸化學名稱為3-甲氧基4-羥基丙烯酸，是當歸等抗骨質疏松中藥復方制劑的組方中藥所含的一種水溶性單體成分，是其主要活性物質之一，具有降低膽固醇、抗氧化、抗血小板聚集等功能[1]。目前阿魏酸對心肌細胞、淋巴細胞活性影響的研究已有報道[1-3]，而其對成骨細胞活性影響的研究較為少見。該文研究阿魏酸對體外培養(yǎng)的成骨細胞增殖、分化功能的影響并探討其作用機制，為當歸等在防治骨質疏松癥中的應用提供理論依據。

1　材料與方法

1.1實驗材料阿魏酸(浙江銀和藥業(yè)有限公司)，新生SD大鼠(廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心)。Dmem培養(yǎng)液(Gibco)，胎牛血清(Hyclone)，TRIzol(Invitrogen)，茜素紅(浙江溫州東升化工試劑廠)，CCK-8試劑盒(碧云天生物技術研究所)，堿性磷酸酶(AKP)試劑盒(南京建成生物工程研究所)，RT-PCR試劑盒(TaKaRa公司)。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養(yǎng)新生24 h內SD 大鼠,無菌條件下取出頭蓋骨, 剔除附著的結締組織, 膠原酶消化后置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取第三代細胞進行實驗。

1.2.2細胞增殖與分化實驗第3代成骨細胞以 1×107·L-1密度接種于96 孔板, 每孔100 μL , 24 h 后進行誘導培養(yǎng)。實驗組阿魏酸濃度分別為40, 160, 640，2560 μmol·L-1, 對照組只加條件培養(yǎng)基。增殖實驗組48 h后檢測吸光度(OD), 檢測波長450 nm, 參考波長630 nm。分化實驗組培養(yǎng)48 h 后, 吸棄孔中的培養(yǎng)液, 經裂解后收集裂解液, 檢測其吸光度, 檢測波長490 nm, 參考波長630 nm。

1.2.3鈣化功能檢測與細胞增殖分化基因的表達成骨細胞以1×107·L-1的密度分別接種于24 孔培養(yǎng)板和100 mm 培養(yǎng)皿，24 h后進行誘導培養(yǎng)。實驗分組同上。鈣化功能檢測組培養(yǎng)21 d后，鏡下觀察鈣化結節(jié)的數量、體積及染色強度；基因表達檢測組培養(yǎng)48 h后, 加TRIzol處理收集細胞，提取RNA進行RT-PCR 試驗。

1.2.4統(tǒng)計學處理組間比較采用SPSS 13.0軟件進行方差分析或t檢驗。

2　結果

與對照組比較，40、160、640、2560 μmol·L-1阿魏酸均可以促進成骨細胞的增殖與分化(P<0.05)。組間比較，細胞增殖方面，2560 μmol·L-1組可以促進成骨細胞增殖，與其他濃度組差異有顯著性(P<0.01)；細胞分化方面，除了160與640 μmol·L-1濃度之間沒有差異外，其他各組間都差異存在顯著性(P<0.01)，見Tab 1，2。

Tab 1　Effects of ferulic acid on proliferation of ±s,n=3)

*P<0.05vscontrol;△P<0.01vsgroup 2560

Tab 2　Effects of ferulic acid on differentiation of ±s，n=3)

*P<0.05vscontrol;△△P<0.01vsgroup 40;##P<0.01vsgroup 160;▲▲P<0.01vsgroup 640;DP<0.01vsgroup 2560

40～640 μmol·L-1阿魏酸可以增加鈣化結節(jié)的數量，其中40 μmol·L-1組的數量最多；而到2 560 μmol·L-1濃度時，阿魏酸則不促進鈣化結節(jié)的形成。40～2 560 μmol·L-1阿魏酸促進成骨相關指標AKP、Osteopotin、Collagen-Ⅰ等基因的表達，與對照組比較，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。3討論

以成骨細胞為研究對象，從中藥中篩選治療骨質疏松癥可能的有效成分的研究已多有報道[4-6]，本文研究了當歸等中藥的有效成分阿魏酸對成骨細胞增殖、分化等功能的影響。結果顯示：40～2 560 μmol·L-1阿魏酸與對照組比，均具有刺激成骨細胞增殖的作用(P<0.05)。堿性磷酸酶是成骨細胞分化的早期特異性標志之一，阿魏酸4個濃度組的AKP活性均高于對照組，差異均具有統(tǒng)計學意義，表明阿魏酸在40～2 560 μmol·L-1濃度范圍內具有促進成骨細胞分化的功能。通過Von kossa染色法檢測成骨細胞鈣化結節(jié)數目，可以反映細胞鈣化程度[7]。在40～640 μmol·L-1濃度范圍內，阿魏酸可以促進成骨細胞鈣化結節(jié)的形成，而到2 560 μmol·L-1濃度時，其數量未見明顯增加，這一點與AKP的結果不盡一致。鈣化結節(jié)反映的是成骨細胞分化中晚期的情況，與分化早期AKP的結果不盡一致，表明2 560 μmol·L-1阿魏酸對于成骨早、晚期分化的作用存在差異，具體原因有待進一步的探討。阿魏酸在40～2 560 μmol·L-1濃度范圍內可以促進成骨相關基因AKP、Osteopontin、CollagenⅠ的表達。AKP基因檢測的結果與其活性測定的數據一致，提示阿魏酸可以促進成骨細胞的分化。Osteopontin在骨基質礦化開始后開始增高，對成骨細胞與基質的吸附起重要作用[8]。CollagenⅠ是骨有機基質的主要成分，其表達與骨形成活性密切相關。40～2 560 μmol·L-1阿魏酸可以促進Osteopontin、CollagenⅠ的表達，與增值實驗的結果一致，表明阿魏酸可以促進成骨細胞的增值與成熟。

綜上所述，阿魏酸具有刺激體外培養(yǎng)的成骨細胞增殖、分化的功能，在一定濃度范圍內還可以促進成骨細胞的鈣化，作用機制可能與其增加成骨相關基因mRNA的表達有關。作為當歸等中藥的水溶性單提成分，其在防治骨質疏松癥中可能具有一定的應用前景。

(致謝：感謝廣東藥學院生命科學與生物制藥學院新藥功能實驗室賈歡歡、李英彬、張旭玲等同學給予的支持與幫助。)

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Effects of ferulic acid on proliferation, differentiation and mineralization of cultured osteoblastsinvitro

GAO Jian-lin1,2，CHEN Jun2，LI Bin1，LU Li2，YANG Guo-zhu2，LU Xin-yan2，LI Qing-nan2

(1.DeptofMedicine，DongguanKanghuaHospital，Dongguan,Guangdong523080，China；2.CollegeofLifeScienceandBio-pharmaceutics，GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510006,China)

ferulic acid; osteoblast; cell proliferation；cell differentiation； alkaline phosphatase(AKP); osteogenic gene

時間：2016-9-22 11:14

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160922.1114.060.html

2016-07-05,

2016-09-12

國家自然科學基金資助項目(No 30971172)

高建林(1980-)，男，碩士，藥師，研究方向：臨床藥學，E-mail：gjl1998@qq.com;

李青南(1956-)，女，博士，教授，碩士生導師，研究方向：骨藥理學，通訊作者，E-mail：qingnanli@sina.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.10.030

A

1001-1978(2016)10-1479-02

R-332；R284.1；R329.24；R681.022