葛根素對(duì)成骨細(xì)胞增殖能力及靶向Runx2的miRNA的影響

張瑩瑩,周建斌，曾祥偉，趙鳳鳴，劉光東，詹秀琴

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京　210023 2.南京中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院疼痛科，江蘇 南京　210014)

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葛根素對(duì)成骨細(xì)胞增殖能力及靶向Runx2的miRNA的影響

張瑩瑩1,周建斌2，曾祥偉1，趙鳳鳴1，劉光東2，詹秀琴1

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京210023 2.南京中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院疼痛科，江蘇 南京210014)

目的研究葛根素作用成骨細(xì)胞MC3T3-E1后對(duì)細(xì)胞的增殖能力和靶向Runx2基因的miRNA的影響。方法① MTT法檢測(cè)葛根素作用于MC3T3-E1細(xì)胞后對(duì)成骨細(xì)胞增殖能力的影響。② 堿性磷酸酶活性檢測(cè)葛根素對(duì)于成骨細(xì)胞活力影響。③ 葛根素作用于成骨細(xì)胞后，采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR(Q-PCR)和蛋白印跡法(Western blot)法檢測(cè)Runx2的mRNA表達(dá)水平和蛋白表達(dá)水平。④ 采用Target Scan、PicTar等靶點(diǎn)預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)靶向Runx2的miRNA，并與表達(dá)譜測(cè)定的葛根素作用MC3T3-E1前后miRNA變化作比較。⑤ 采用Q-PCR法驗(yàn)證葛根素作用MC3T3-E1前后靶向Runx2基因的miRNA表達(dá)量。⑥ 構(gòu)建Runx2 3′UTR/突變型Runx2 3′UTR重組質(zhì)粒、合成miRNA-204mimics、miRNA-204inhibitor、miRNA-204NC共轉(zhuǎn)染MC3T3-E1細(xì)胞，用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)驗(yàn)證Runx2與miRNA-204的靶向關(guān)系。結(jié)果葛根素作用后，與空白對(duì)照組比較，細(xì)胞增殖活性提高，Runx2的mRNA和蛋白表達(dá)水平上升，miRNA-204和miRNA-344f-5p表達(dá)水平下降，miRNA-2861表達(dá)水平上升，miRNA-23a-5p、miRNA-770-5p、miRNA-871-5p表達(dá)水平無(wú)明顯改變。細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后，只有Runx2 3′UTR+miRNA204 mimics組熒光素蛋白的表達(dá)水平明顯降低，說(shuō)明只有miRNA-204可抑制Runx2 3′UTR報(bào)告基因的表達(dá)。結(jié)論葛根素可促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，并通過(guò)下調(diào)靶向Runx2的miRNA的表達(dá)來(lái)提高Runx2表達(dá)水平。

葛根素； 成骨細(xì)胞； 增殖； 堿性磷酸酶； Runx2； miR-204；雙熒光素酶報(bào)告基因

骨質(zhì)疏松癥是骨脆性增加且容易發(fā)生骨折的一種全身性骨骼疾病，以骨量減少，骨微結(jié)構(gòu)退化為主要特征[1]。成骨細(xì)胞是骨形成過(guò)程中的主要的功能性細(xì)胞，負(fù)責(zé)骨基質(zhì)的合成、相關(guān)物質(zhì)的分泌和骨組織礦化[2]。大量研究表明[3-4]，葛根素對(duì)成骨細(xì)胞的增殖有明顯的促進(jìn)作用。Runt家族相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runx2)是骨發(fā)育過(guò)程中激活與啟動(dòng)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化并調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞成熟的重要轉(zhuǎn)錄因子，它能上調(diào)多種成骨相關(guān)基因的表達(dá)，對(duì)膜內(nèi)和軟骨內(nèi)骨化成骨均有控制作用[5]，加深葛根素對(duì)Runx2表達(dá)影響的研究，對(duì)進(jìn)一步闡明葛根素對(duì)骨細(xì)胞的作用的分子機(jī)制有重要意義。

1　材料與試劑

1.1細(xì)胞前成骨細(xì)胞系MC3T3-E1(中國(guó)科學(xué)研究院上海細(xì)胞庫(kù))；葛根素標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)藥品生物制品檢定所):20 mg/支，純度為96.0%，白色粉末狀，干燥密封保存；α-MEM培養(yǎng)基(維森特)；胎牛血清(Gibco)；四唑鹽MTT(凱基生物有限公司)；對(duì)酚磷酸酯二鈉鹽(p-NPP, Sigma)；mRNA逆轉(zhuǎn)試劑盒(TaKaRa公司)；TRIzol(Invitrogen公司)；Realtime PCR SYBR premix 2×(TaKaRa公司)；mRNA引物由南京金斯瑞公司合成序列：Runx2 Forward：5′-CGGACGAGGCAAGAGTTTCA-3′，Reverse：5′-GGATGAGGAATGCGCCCTAA-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為192 bp；β-actin Forward：5′-GTGCTATGTTGCTCTAGACTTCG-3′，Reverse:5′-ATGCCACAGGATTCCATACC-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為174 bp。目的基因一抗(rabbit Runx2)(Cell Signaling Technology公司)；蛋白裂解液(碧云天公司)；顯色液 (BIO-BAD公司)；BCA試劑盒(Solarbio公司)；內(nèi)參一抗(rabbit β-actin公司)(Cell Signaling Technology公司)；二抗(Anti-Rabbit IgG HRP)(Cell Signaling Technology公司)；RNAiso for Small RNA(TaKaRa公司)，miRNA反轉(zhuǎn)錄酶、酶抑制劑( VaZyMe 公司)；miRNA所有相關(guān)引物(Tab 1)由上海生物工程有限公司合成。表中的Reverse是miR-204、miR-2861、miR-344f-5p、miR-23a-5p、miR-770-5p、miR-871-5p 6個(gè)基因的通用下游引物。

1.2主要儀器熒光實(shí)時(shí)定量PCR儀(Agilent Technologies Mx3000P); 紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)(BioDrop, USA); 凝膠成像儀(Bio-Rad, USA); 酶標(biāo)儀(BioTek, USA).

1.3方法

1.3.1MTT法檢測(cè)葛根素對(duì)成骨細(xì)胞增殖能力影響將細(xì)胞以0.5×104每孔種在96孔板，用含胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，37℃、5% CO2孵育24 h后，分為2組。葛根素組：每孔加入葛根素藥液180 μL，使其終濃度為10 mg·L-1；空白對(duì)照組：加入等體積的培養(yǎng)液。加藥后分別繼續(xù)培養(yǎng)24、48和72 h，每組均設(shè)6個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入新鮮配制的5× 103mg·L-1的MTT 溶液20 μL，4 h后棄上清，每孔加DMSO 150 μL，水平搖床混勻，酶標(biāo)儀于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值。

1.3.2葛根素對(duì)成骨細(xì)胞堿性磷酸酶活性的影響每孔1×105個(gè)細(xì)胞分別接種至6孔板中,37℃、5% CO2培養(yǎng)。設(shè)對(duì)照組，葛根素作用72 h后收集細(xì)胞, PBS洗2次,冰上超聲處理30 s 2次后，12 000×g離心15 min。取上清液100 uL加入含1.0×103mg·L-1p-NPP、1 mol·L-1二乙醇胺和0.5 mmol·L-1MgCl2的緩沖100 μL，37℃避光孵育30 min，每孔加入3 mol·L-1NaOH 50 μL終止反應(yīng),在405 nm波長(zhǎng)下測(cè)定光吸收。BCA法測(cè)定樣品蛋白濃度,用于校正堿性磷酸酶活性。

1.3.3熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)Runx2轉(zhuǎn)錄水平將細(xì)胞以1×105種在6孔板里，設(shè)置葛根素處理組和空白對(duì)照組,加入等體積加了胎牛血清的培養(yǎng)液，培養(yǎng)72 h。使用TRIzol法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行總RNA的提取，用核酸蛋白分析儀測(cè)其濃度和純度。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒得到cDNA。參考說(shuō)明書(shū)反應(yīng)體系并每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。PCR的循環(huán)條件：采用二步法：95℃ 30 s預(yù)變性，(95℃ 5 s，60℃ 34 s)× 40個(gè)循環(huán)，做熔解曲線(xiàn)分析。

1.3.4Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)水平按全蛋白抽提試劑盒說(shuō)明書(shū)提取處理72h后的各組細(xì)胞總蛋白，并用BCA法進(jìn)行蛋白定量，-20℃凍存。取各組樣本25 μg進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，將分離后的蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移到PDVF膜上，放入少量封閉液，室溫下，搖床上封閉1 h。TBST漂洗濾膜3次，每次5 min。加入一抗抗體和封閉液(1 ∶1 000)3 mL孵育過(guò)夜后，TBST漂洗濾膜3次，每次5 min。將膜與HRP結(jié)合的二抗(二抗用封閉液稀釋1 ∶3 000)，室溫下?lián)u蕩孵育1 h，TBST漂洗濾膜3次，每次5 min。配制顯色液: 按A液 ∶B液=1 ∶1配制，在正面加混勻的顯色液,放入凝膠成像儀中顯影，調(diào)整曝光時(shí)間，直至出現(xiàn)最佳條帶。用Bandscan分析軟件分析條帶灰度,進(jìn)行半定量比較分析,并且均采用自身灰度值校正,以目的基因的條帶灰度與管家基因β-actin的灰度比值表示蛋白的表達(dá)水平。

Tab 1　microRNA primer sequence

1.3.5microRNA表達(dá)譜檢測(cè)TRIzol法提取葛根素作用72 h后的成骨細(xì)胞和對(duì)照組細(xì)胞的RNA，交由康成生物公司完成表達(dá)譜實(shí)驗(yàn)。

1.3.6軟件預(yù)測(cè)靶向Runx2的miRNA生物學(xué)信息軟件對(duì)可能靶向Runx2的miRNA進(jìn)行預(yù)測(cè)。目前常用的靶基因預(yù)測(cè)軟件有TargetScan、PicTar、miRBase和miRDB。綜合利用這4個(gè)軟件預(yù)測(cè)，選取幾個(gè)軟件預(yù)測(cè)皆靶向Runx2的miRNA，并與表達(dá)譜入選的miRNA進(jìn)行比對(duì)，重復(fù)的miRNA基因作為研究對(duì)象。

1.3.7葛根素作用后靶向Runx2的miRNA變化細(xì)胞培養(yǎng)方法及葛根素作用時(shí)間同“1.3.1”、RNA提取方法同“1.3.3”。miRNA 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：5×Reverse Transcription Mix 10.0 μL、Stem-loop 反轉(zhuǎn)錄引物1.0 μL、microRNA 500 ng、hiscript Enzyme Mix 2.0 μL、加 RNA free H2O至總體積20 μL。反應(yīng)條件為：25℃，5 min；45℃，50 min；85℃，5 min；4℃，反應(yīng)結(jié)束后，將其放入-20℃保存。

Real-Time PCR 檢測(cè)反應(yīng)體系條件方法同“1.3.3”。

1.3.8雙熒光素酶報(bào)告基因法驗(yàn)證靶基因取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以每孔2×104細(xì)胞種于24孔培養(yǎng)板中，充分混勻，培養(yǎng)24 h。當(dāng)融合度接近90%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。取1.5 mL EP管6個(gè)，均加入無(wú)血清雙抗的αMEM培養(yǎng)液(按50 μL每孔)和Lipofectamine 2000脂質(zhì)體(按1 μL每孔)，使其充分混勻，靜置5 min。向新的EP管中加入無(wú)血清雙抗的αMEM培養(yǎng)液(按50 μL每孔)和Runx2 3′UTR/突變型Runx2 3′UTR重組質(zhì)粒(100 ng每孔)、miRNA mimics/miRNA inhibitor/陰性對(duì)照NC(2 μmol·L-1/孔)，并充分混勻，共分成6組，即Runx2 3′UTR+miRNA mimics、Runx2 3′UTR+miRNA inhibitor、Runx2 3′UTR+miRNA NC、Runx2mut 3′UTR+miRNA mimics、Runx2mut 3′UTR+miRNA inhibitor、Runx2mut 3′UTR+miRNA NC。將混有脂質(zhì)體的αMEM培養(yǎng)液和上述6組αMEM培養(yǎng)液分別相混合(100 uL/孔)，并充分混勻，室溫下靜置20 min，分別加到24孔培養(yǎng)板相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)組中(每組設(shè)定3個(gè)復(fù)孔)，混勻放置于37℃ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。

每孔用1×PBS輕柔洗滌1次，每孔加1×PLB(裂解液)，反復(fù)吹打，凍融3次，以充分裂解細(xì)胞。離心后取上清。用熒光檢測(cè)儀中進(jìn)行測(cè)定，設(shè)置2 s的預(yù)測(cè)延遲和10 s的測(cè)定用時(shí)，在測(cè)量管中加入5 μL樣本充分混勻10 s，再加入100 μL Luciferase Reporter Assay Reagent Ⅱ(LAR Ⅱ,螢火蟲(chóng)熒光素酶底物)測(cè)定螢火蟲(chóng)熒光1，而后加入100 μL Stop&Glo?substrate(海腎熒光素酶底物)測(cè)定海腎熒光2。以熒光1/熒光2的值作為相對(duì)熒光素酶活性。

2　結(jié)果

2.1葛根素對(duì)成骨細(xì)胞增殖能力的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(Fig 1)，加藥組的細(xì)胞OD值明顯高于空白組，表明葛根素作用后細(xì)胞的增殖能力明顯增強(qiáng)。作用72 h后加藥組與空白組的差異更為明顯，故后面實(shí)驗(yàn)葛根素作用時(shí)間均為72 h。

2.2葛根素對(duì)成骨細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶活性的影響葛根素作用成骨細(xì)胞72 h后，細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶活性的檢測(cè)結(jié)果為：空白對(duì)照組54.44±0.45，葛根素處理組55.52±0.81，與空白對(duì)照組比較，葛根素作用成骨細(xì)胞72 h后，堿性磷酸酶活性提高，且實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

*P<0.05,**P<0.01vscontrol

2.3葛根素對(duì)成骨細(xì)胞Runx2 mRNA表達(dá)水平的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(Fig 2)，葛根素作用72 h后，Runx2 mRNA表達(dá)量，空白對(duì)照組為1，葛根素組為2.47±0.66，與空白對(duì)照組比較差異具有顯著性，葛根素作用后Runx2 mRNA表達(dá)量上升了1.47倍(P<0.01)。

Fig 2　RNA expression levels of Runx2 before and after effect of puerarin

*P<0.01vscontrol

2.4葛根素對(duì)成骨細(xì)胞Runx2蛋白表達(dá)水平的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，同空白組相比，葛根素作用后Runx2/β-actin的值明顯高于對(duì)照組，表明Runx2蛋白水平明顯上升。每組蛋白樣本重復(fù)3次，Runx2蛋白水平見(jiàn)Fig 3。

2.5表達(dá)譜檢測(cè)葛根素作用后microRNA的變化送檢樣品測(cè)序數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后，選取同一個(gè)體藥物作用前后兩標(biāo)本間miRNA表達(dá)差異，并用Chi-squared 2X2的方法計(jì)算p-value(取P<0.05)。microRNA表達(dá)譜檢測(cè)結(jié)果顯示：miR-204、miR-2861、miR-344f-5p、miR-23a-5p、miR-871-5p、miR-770-5p等119個(gè)microRNA葛根素作用前后發(fā)生變化。部分表達(dá)譜結(jié)果見(jiàn)Tab 2。

2.6靶向Runx2的miRNA預(yù)測(cè)結(jié)果綜合利用TargetScan、PicTar、miRBase和miRDB這4個(gè)軟件預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，靶向Runx2的miRNA有miR-204、miR-128、miR-135b-5p、miR-3072-3p、miR-2861、miR-344f-5p等。與表達(dá)譜入選的miRNA進(jìn)行比對(duì)，miRNA-204、miRNA-344f-5p、miR-2861是共同存在的。2.7葛根素作用后miRNA表達(dá)量的變化選取表達(dá)譜既有改變軟件也預(yù)測(cè)到的miRNA-204、miRNA-344f-5p、miR-2861和表達(dá)譜有改變軟件沒(méi)有預(yù)測(cè)到的miR-23a-5p、miR-871-5p、miR-770-5p 6個(gè)microRNA作為PCR的研究對(duì)象。結(jié)果顯示(Fig 4)葛根素作用后miRNA在成骨細(xì)胞中的表達(dá)水平與空白對(duì)照組比較，miRNA-204、miRNA-344f-5p表達(dá)水平下降，miR-2861表達(dá)水平上升，且變化特別明顯，其機(jī)制與成骨細(xì)胞活性之間的關(guān)系有待進(jìn)一步研究。miR-23a-5p、miR-871-5p、miR-770-5p表達(dá)水平無(wú)明顯改變。實(shí)驗(yàn)研究表明miRNA在體內(nèi)常作為負(fù)調(diào)節(jié)器調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)[6]，由于葛根素作用以后Runx2的表達(dá)水平上升，我們只選取葛根素作用以后表達(dá)水平下降的miRNA作為研究對(duì)象。經(jīng)過(guò)綜合考慮，我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中進(jìn)一步驗(yàn)證miRNA-204與Runx2的靶向關(guān)系。

Fig 3　Protein expression of Runx2 before and after puerarin effects on osteoblasts

*P<0.05vscontrol

Tab 2　microRNA expression spectrum of drug vs blank

Fig 4　Expression levels of miRNA before and after puerarin on osteoblast

A:miR-204;B:miR-2861;C:miR-344f-5;D:miR-23a-5p;E:miR-770-5p;F:miR-871-5p,*P<0.05,**P<0.01vscontrol

2.8雙熒光素酶報(bào)告基因法驗(yàn)證miRNA與Runx2的靶向關(guān)系結(jié)果顯示(Fig 5)，細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，只有Runx2 3′UTR+miRNA-204 mimics組熒光素蛋白的表達(dá)水平明顯降低，Runx2 3′UTR+miRNA-204 inhibitor組熒光素蛋白的表達(dá)水平明顯提高(P<0.05)，說(shuō)明只有miRNA-204可抑制Runx2 3′UTR報(bào)告基因的表達(dá)，miRNA inhibitor促進(jìn)Runx2 3′UTR報(bào)告基因的表達(dá)，miRNA-204+Runx2mut 3′UTR組、Runx2mut 3′UTR+miRNA inhibitor、miRNA-204NC+Runx2 3′UTR組和miRNA-204NC+Runx2mut 3′UTR組熒光素蛋白的表達(dá)水平均變化不明顯(P>0.05)，表明了Runx2為miRNA-204的靶基因。

Fig 5　Effects of miRNA-204 on expression of Runx2

3′UTR OE=miRNA-204mimics, IN=miRNA-204inhbitor, NC=miRNA-204NC,*P<0.05，**P<0.01vsRunx2 3′UTR+NC. A:Runx2 3′UTR+OE;B:Runx2mut 3′UTR+OE;C:Runx2 3′UTR+IN;D:Runx2mut 3′UTR+IN;E:Runx2 3′UTR+NC;F:Runx2mut 3′UTR+NC

3　討論

葛根素是從葛根這一味中藥里提取的單體成分，是一種異黃酮化合物，屬于植物雌激素[7]。研究表明，葛根素能夠刺激成骨細(xì)胞的增殖作用，提高成骨細(xì)胞的堿性磷酸酶的活性[3,8]。堿性磷酸酶是成骨細(xì)胞分化早期的特異性標(biāo)志物，常被用來(lái)作為評(píng)價(jià)成骨細(xì)胞礦化功能的指標(biāo)[9]。成骨細(xì)胞分泌堿性磷酸酶和鈣鹽結(jié)晶體到細(xì)胞外基質(zhì)中，堿性磷酸酶使局部的磷酸含量增加，促使基質(zhì)鈣化[10]。本實(shí)驗(yàn)葛根素組堿性磷酸酶活性明顯增加，也表明了葛根素可以促進(jìn)成骨細(xì)胞的生物礦化進(jìn)程。

Runx2的表達(dá)是成骨細(xì)胞分化的開(kāi)始，它能促進(jìn)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化[11]，是骨形成過(guò)程中最早和最具特征性的標(biāo)志，對(duì)防治骨質(zhì)疏松癥具有重要意義[12]。miRNA是細(xì)胞內(nèi)的一類(lèi)小分子RNA，在轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)基因表達(dá)，能影響多種生物學(xué)過(guò)程，包括細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、發(fā)育[13-15]。它的發(fā)現(xiàn)可能成為極有應(yīng)用價(jià)值的分子標(biāo)志物，為骨質(zhì)疏松癥的治療提供新的靶標(biāo)。

本實(shí)驗(yàn)表明，葛根素在上調(diào)成骨細(xì)胞Runx2表達(dá)的同時(shí)，miRNA表達(dá)譜也有很大的改變，推測(cè)葛根素對(duì)Runx2表達(dá)的影響可能與miRNA有關(guān)。miRNA表達(dá)譜檢測(cè)到葛根素作用于成骨細(xì)胞后miR-23a-5p、miR-871-5p、miR-770-5p發(fā)生改變，而PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)葛根素作用后這3種miRNA并沒(méi)有發(fā)生統(tǒng)計(jì)學(xué)的改變，初步判斷miRNA表達(dá)譜只能作為參考，驗(yàn)證其靶向關(guān)系還有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。表達(dá)譜和PCR結(jié)果都發(fā)現(xiàn)葛根素作用后miRNA-204、miRNA-344f-5p表達(dá)下降，說(shuō)明了Runx2和miRNA-204、miRNA-344f-5p的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。采用生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，miRNA-204能與Runx2的3′非翻譯區(qū)特異性結(jié)合從而抑制其翻譯。為進(jìn)一步驗(yàn)證miR-204和Runx2之間的關(guān)系，我們構(gòu)建了Runx2 3′UTR和突變型Runx2 3′UTR的表達(dá)載體，用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)進(jìn)行驗(yàn)證，最終實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了它們之間的靶向關(guān)系。以上結(jié)果表明miRNA對(duì)Runx2表達(dá)有調(diào)控作用，葛根素對(duì)成骨細(xì)胞Runx2的影響，一定程度上與干涉靶向Runx2的miRNA相關(guān)，葛根素干涉miRNA表達(dá)的分子機(jī)制我們還在進(jìn)一步的研究中。(致謝：本實(shí)驗(yàn)主要是在南京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室完成，感謝實(shí)驗(yàn)室各位老師的幫助讓我順利完成實(shí)驗(yàn)。)

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Effects of puerarin on proliferation of osteoblasts and Runx2-targeting miRNAs

ZHANG Ying-ying1,ZHOU Jian-bin2,ZENG Xiang-wei1,ZHAO Feng-ming1,LIU Guang-dong2,ZHAN Xiu-qin1

(1.BasicMedicalCollegeofNanjingUniversityofChineseMedicine,Nanjing210023,China;2.NanjingIntegratedTraditionalChineseandWesternMedicineHospital,Nanjing210014)

AimTo study proliferation capacity of cell and the target relationship between microRNA and Runx2 after effect of puerarin on osteoblasts MC3T3-E1.MethodsThe proliferation capacity of cell was detected by MTT after effect of puerarin on osteoblasts MC3T3-E1 .The vitality of osteoblasts was detected by activity of alkaline phosphatase. The expression level of mRNA and protein of Runx2 were detected by real-time quantitative PCR and Western blot. The result of miRNA expression spectrum was compared with the predicted result to determine the Runx2-targeting miRNAs. The expression levels of miRNAs possiby targeted to Runx2 were detected by real-time quantitative PCR. The RhoE 3′UTR vector and RhoE mut 3′UTR vector were constructed. miRNA-204 mimics and miRNA-204 NC were synthetised. The target genes were verified by dual luciferase report gene assay.ResultsAfter osteoblasts treated with puerarin, proliferation capacity and activity of cells were enhanced ,expression levels of mRNA and protein of Runx2 were both increased , the expression levels of miRNA-204 and miRNA-344f-5p were declined, the expression levels of miRNA-2861 was increased，the expression levels of miRNA-23a-5p, miRNA-770-5p and miRNA-871-5p showed no obvious change. According to the results of dual luciferase reporter gene method after cell transfection of 48 h, only set of 3′UTR Runx2+mimics the miRNA - 204 of fluorescein protein expression level decreased significantly, showing only the miRNA-204 inhibits Runx2 3′UTR report gene expression.ConclusionPuerarin promotes the proliferation of osteoblasts and regulates the miRNAs which possibly target to Runx2.

puerarin; osteoblast; proliferation; alkaline phosphatase; Runx2; miR-204; dual luciferase reporter gene

時(shí)間：2016-9-22 11:14

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160922.1114.048.html

2016-06-21,

2016-08-17

江蘇省科技廳資助項(xiàng)目(No BK20131417)

張瑩瑩(1989-)，女，碩士生，研究方向：分子生物學(xué),E-mail：593556188@qq.com；

詹秀琴(1966-)，女，博士，副教授，研究方向：分子生物學(xué)，通訊作者，E-mail:xqzhan14@sina.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.10.024

A

1001-1978(2016)10-1457-06

R284.1；R329.24；R342.2；R681.022