大鼠腦缺血/再灌注后早期A(yíng)QP4的動(dòng)態(tài)表達(dá)及其與腦水腫關(guān)系的研究

許淑紅，康　辰，陳美靈，周珮珮，何廣衛(wèi)，崔亞嬌，楊　迪，吳玉林

(1.中國(guó)藥科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床藥學(xué)學(xué)院，江蘇 南京　211198；2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所，北京　100050； 3. 美國(guó)俄亥俄州立大學(xué)藥學(xué)院藥理室,美國(guó) 哥倫布市　43210；4.合肥醫(yī)工醫(yī)藥有限公司，安徽 合肥　230031)

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大鼠腦缺血/再灌注后早期A(yíng)QP4的動(dòng)態(tài)表達(dá)及其與腦水腫關(guān)系的研究

許淑紅1,2，康辰3，陳美靈1，周珮珮1，何廣衛(wèi)4，崔亞嬌1，楊迪1，吳玉林1

(1.中國(guó)藥科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床藥學(xué)學(xué)院，江蘇 南京211198；2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所，北京100050； 3. 美國(guó)俄亥俄州立大學(xué)藥學(xué)院藥理室,美國(guó) 哥倫布市43210；4.合肥醫(yī)工醫(yī)藥有限公司，安徽 合肥230031)

目的研究局灶性腦缺血/再灌注損傷大鼠腦組織病理變化及腦組織水通道蛋白4(AQP4)和相關(guān)蛋白表達(dá)變化，以探索AQP4與腦水腫的關(guān)系。方法♂成年SD大鼠150只，體質(zhì)量250～300 g，隨機(jī)分為假手術(shù)(Sham)組和腦缺血/再灌注損傷模型(I/R)組，其中I/R組又分為I/R-6 h、I/R-12 h、I/R-24 h、I/R-48 h 4個(gè)時(shí)間點(diǎn)組別。采用線(xiàn)栓法阻塞大腦中動(dòng)脈建立局灶性腦缺血/再灌注模型，于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行神經(jīng)癥狀評(píng)分，EB染色檢測(cè)腦組織通透性，TTC染色觀(guān)察腦梗死體積，干濕重法檢測(cè)腦含水量的變化，免疫組化(IHC)檢測(cè)大鼠腦缺血/再灌注后不同時(shí)間點(diǎn)梗死灶周?chē)鶤QP4的表達(dá)，Western blot及RT-PCR檢測(cè)AQP4及相關(guān)蛋白表達(dá)情況。結(jié)果與Sham組相比較，隨著再灌注時(shí)間增加，I/R模型組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分、腦梗死體積、腦組織通透性，腦組織含水量均持續(xù)增加，IHC顯示AQP4的表達(dá)逐漸上調(diào)，分布愈加廣泛；Western blot及RT-PCR結(jié)果驗(yàn)證了AQP4表達(dá)水平的增高趨勢(shì)，同時(shí)對(duì)相關(guān)蛋白表達(dá)檢測(cè)顯示，MMP-9表達(dá)增高，Occludin及JAM-1表達(dá)顯示降低趨勢(shì)，在I/R-48h模型組表達(dá)差異性均最明顯(均P<0.01vsSham)。結(jié)論腦缺血/再灌注后，伴隨腦組織損傷的加劇，AQP4 與MMP-9表達(dá)共同被激活，導(dǎo)致Occludin及JAM-1等TJPs蛋白降解增加，共同參與了腦水腫的形成。

缺血/再灌注；腦水腫；AQP4；MMP-9；Occludin；JAM-1

腦缺血/再灌注損傷( cerebral ischemia-reperfusion injury，CIRI) 可發(fā)生于多種腦血管疾病過(guò)程中，其病理生理機(jī)制是涉及多環(huán)節(jié)、多因素、多途徑損傷的復(fù)雜的酶促級(jí)聯(lián)反應(yīng)。腦缺血可以引起嚴(yán)重的神經(jīng)損傷，影響病人的神經(jīng)功能恢復(fù)和預(yù)后。而腦水腫是缺血性腦血管病中常見(jiàn)的并發(fā)癥之一，它可以引起顱內(nèi)高壓、加重病情，甚至造成病人死亡。目前，由于對(duì)腦水腫發(fā)生的機(jī)制尚不十分清楚，因此，臨床治療也僅限于對(duì)癥處理，不能達(dá)到標(biāo)本兼治的目的。關(guān)于腦水腫的發(fā)生存在著腦微循環(huán)障礙、腦機(jī)能代謝障礙、血腦屏障障礙、自由基增加、鈣超載、膜分子結(jié)構(gòu)紊亂等多種學(xué)說(shuō)。而腦內(nèi)血腦屏障( blood brain barrier，BBB)通透性改變既是損傷后的結(jié)果，又是導(dǎo)致?lián)p傷進(jìn)一步加重的重要因素[1]。水通道蛋白4(aquaporin，AQP4)是膜水通道蛋白家族的一員，在腦組織中廣泛表達(dá)，是控制水進(jìn)出腦組織的通道，在腦組織水平衡、 星形細(xì)胞遷移、神經(jīng)興奮及炎癥等方面均起著重要作用[2]。大量研究表明，AQP4 與腦水腫關(guān)系密切， 參與了多種疾病所引起的腦水腫的病理過(guò)程。先前的大量研究[3]顯示，腦缺血/再灌注(ischemia-reperfusion, I/R)早期，迅速引起腦損傷，損傷程度隨時(shí)間變化很大，這一時(shí)期所造成的腦水腫程度也最為嚴(yán)重。更有研究指出，I/R發(fā)生的48h之內(nèi)是腦水腫發(fā)展的關(guān)鍵時(shí)期，也是臨床藥物治療的黃金時(shí)期。本課題組先前的研究[4]也證實(shí)了上述的研究。為了進(jìn)一步研究CIR發(fā)生前48 h內(nèi)各時(shí)間段具體的病理生理過(guò)程，我們選取了I/R-6h、I/R-12h、I/R-24h及I/R-48h這4個(gè)重要的時(shí)間節(jié)點(diǎn)分別進(jìn)行研究，以期探尋大鼠腦缺血/再灌注后早期水通道蛋白4(aquaporin4，AQP4)及相關(guān)蛋白的動(dòng)態(tài)表達(dá)規(guī)律及其與腦水腫關(guān)系。

1　材料

1.1材料與試劑水合氯醛[(A.R.中國(guó)醫(yī)藥(集團(tuán))上?；瘜W(xué)試劑公司)]； 氯化-2,3,5-三苯基四氮唑(TTC)(Biosharp公司)；0.9%氯化鈉注射液(生理鹽水)(湖南科倫制藥有限公司)；生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG/小鼠IgG二抗試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；Western一抗、二抗去除液、Western轉(zhuǎn)膜液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(增強(qiáng)型)、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒和SDS-PAGE電泳液均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；ProSieve Color ptrotein makers(美國(guó)Lonza Rockland公司)。PVDF膜(0.45 μm；美國(guó)SERVA公司)；增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑(美國(guó)Millipore公司)；所用單克隆抗體為：AQP4和JAM-1((美國(guó)Abcam公司)，MMP-9(美國(guó)Cell Signaling Technology公司)，Occludin(美國(guó)Santa Cruz公司)，β-actin(美國(guó)Ambobio公司)；PCR引物(中國(guó)BioSune)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)ThermoFisher公司)。

1.2儀器JA1203精密電子天平，HH.S21-6-S恒溫水浴鍋，DHG-9143BS-III電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，80-2型電動(dòng)離心機(jī)，Infinite M 200 PRO全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀，TP1020自動(dòng)脫水機(jī)，RM型石蠟切片機(jī)，Tission-Tek TEL 組織包埋中，Azure cSeries 400型化學(xué)發(fā)光顯影儀。

1.3動(dòng)物健康♂ Sprague-Dawley (SD)大鼠，SPF級(jí)，體質(zhì)量250～300 g，由江蘇大學(xué)提供，合格證號(hào)：SCXK(蘇)2013-0011

2　方法

2.1動(dòng)物分組及給藥150只SD大鼠，隨機(jī)分為假手術(shù)對(duì)照組和腦缺血/再灌注(ischemic/reperfusion, I/R)模型組。I/R模型組按照時(shí)間點(diǎn)不同分為I/R后6、12、24、48 h 4個(gè)時(shí)間點(diǎn)組別，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各設(shè)置1個(gè)假手術(shù)組。每組I/R大鼠各30只，假手術(shù)對(duì)照大鼠各6只。

2.2模型構(gòu)建將麻醉成功的大鼠固定好，暴露左側(cè)頸總動(dòng)脈，鈍性分離左側(cè)頸總動(dòng)脈(common carotid artery，CCA)、頸外動(dòng)脈(external carotid artery，ECA)、頸內(nèi)動(dòng)脈(internal carotid artery，ICA)及迷走神經(jīng)。在頸外動(dòng)脈下墊雙線(xiàn)分別兩次結(jié)扎頸外動(dòng)脈，兩節(jié)點(diǎn)之間保留一定距離(約2 mm)。用血管夾夾閉頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈，將右側(cè)頸外動(dòng)脈近心段剪開(kāi)一小口，將所做成線(xiàn)栓子緩慢插入ECA及ICA入顱至大腦中動(dòng)脈(MCA)開(kāi)口處，魚(yú)線(xiàn)插入的平均深度為(18.5±0.5) mm，外留1 cm長(zhǎng)漁線(xiàn)，此時(shí)即在大腦中動(dòng)脈起始端堵塞大腦中動(dòng)脈，造成局灶性腦缺血，結(jié)扎漁線(xiàn)與血管。缺血后120 min實(shí)施再灌注，即將置于皮下的漁線(xiàn)尾端輕輕拔出，扎死CCA前端，消毒并逐層縫合皮膚。假手術(shù)組：除不插魚(yú)線(xiàn)外，其余操作與手術(shù)組相同。

2.3神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分模型制作成功后，按照Bederson的方法對(duì)大鼠的行為缺陷進(jìn)行評(píng)分，分?jǐn)?shù)越高，大鼠行為障礙越嚴(yán)重。評(píng)分結(jié)束后，挑選評(píng)分在1～3分者入組，造模后死亡及評(píng)分為4分的實(shí)驗(yàn)鼠排除入組，參考Berderson[5]評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)在4個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)實(shí)驗(yàn)鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分。

Tab 1　Standard for Neurobehavioral score

2.4血腦屏障通透性測(cè)定大鼠腦缺血/再灌注后48 h，經(jīng)尾靜脈注射伊文思藍(lán)(2%，4 mL·kg-1)，注射完依文思藍(lán)后2 h麻醉大鼠，將其固定于鼠板上，打開(kāi)胸腔，用12號(hào)針頭經(jīng)左心室插入心臟，并在右心耳處剪口，用靜脈滴注的方式將0.9%生理鹽水灌注入心臟(灌注壓為110 mmHg)，至右心耳流出無(wú)色清亮的液體，斷頭取腦，去除硬腦膜，生理鹽水沖洗后，濾紙吸干表面水分，取缺血側(cè)大腦稱(chēng)其濕重后置于甲酰胺溶液(每100 mg腦組織中加入1 mL甲酰胺)中，56 ℃水浴24 h。24 h后1 000 r·min-1離心5 min，用吸管輕吸出上清液，可見(jiàn)光分光光度計(jì)(λ=632)測(cè)定上清液OD值，甲酰胺做空白比色，按公式計(jì)算腦組織EB含量：腦組織EB滲透率=(左腦OD值/左腦重量)/(右腦OD值/右腦重量)。

2.5腦組織含水量測(cè)定采用干濕重法測(cè)定腦含水量。不同時(shí)相點(diǎn)，大鼠處死后迅速取腦，將取出的腦組織放在培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿內(nèi)含有生理鹽水溫潤(rùn)的定性濾紙，以防止腦組織水分蒸發(fā)。去除皮質(zhì)表面的軟腦膜、小腦、腦干，用濾紙輕輕拭去腦組織表面的血跡，分離獲取梗死側(cè)大腦半球，置于稱(chēng)量杯中稱(chēng)取濕重，從取腦到稱(chēng)重完畢時(shí)間控制在5min內(nèi)。然后將腦組織放入電熱恒溫箱中，100℃烘干24～48 h烘烤至恒重，記錄干重 (兩次干重之差≤0.2 mg)。按如下公式計(jì)算：腦組織含水量/%=(濕重-干重)/濕重×100%。

2.6腦梗死體積百分比I/R之后，將各實(shí)驗(yàn)鼠麻醉后迅速斷頭取腦，切除嗅球和低位腦干，用生理鹽水沖洗后迅速將腦組織置于-20℃冰箱中速凍15～20 min，取出腦組織放入腦槽中，在冰床上進(jìn)行操作。大腦沿冠狀面自前腦額極起向后連續(xù)切片，一般切成5～6片、厚度平均約2 mm的冠狀腦切片。小心的將腦片置于2% TTC溶液中，放入37℃恒溫箱中避光孵育30 min。正常腦組織可染成深紅色，梗死灶為白色，將腦片置于4%多聚甲醛中固定12 h，數(shù)碼照相機(jī)拍照。選擇每一切面的額側(cè)面用Image-pro plus6.0圖像分析軟件計(jì)算每張腦片的面積和梗死面積。大鼠腦梗死百分比=(正常側(cè)大腦半球體積- 梗死側(cè)非梗死區(qū)大腦半球的體積)/正常側(cè)大腦半球體積%=[(A1′+A2′+…+An′)d-(A1+A2+…+An)d]/(A1′+A2′+…+An′)d%，An′表示每片正常腦組織面積，An表示梗死側(cè)非梗死區(qū)每片腦組織面積，d表示每片厚度。以此百分比來(lái)代表腦梗死灶的體積，表示I/R后腦損傷的嚴(yán)重程度。

2.7腦組織取材大鼠腦缺血/再灌注后，將大鼠斷頭處死，迅速置于冰盤(pán)上分離腦組織， 在視交叉前行冠狀切取腦組織，取右側(cè)腦組織塊在冰冷的生理鹽水中漂洗稱(chēng)重，分離的梗死腦組織半球再分為兩部分：一部分用4%多聚甲醛固定，后續(xù)經(jīng)脫水、透明、包埋，制成腦組織石蠟塊；另一部分置于EP管，于液氮中保存待用。

2.8免疫組化測(cè)定AQP4的表達(dá)及分布取石蠟切片常規(guī)脫蠟，磷酸鹽緩沖液PBS(PH 7.4)洗滌，浸入3%過(guò)氧化氫封閉液中室溫封閉30 min。枸櫞酸緩沖液(0.01 mol·L-1，PH 6.0)高壓3 min，冷卻至室溫后滴加5% BSA室溫孵育。PBS洗滌后滴加一抗4℃濕盒過(guò)夜。次日切片恢復(fù)至室溫后分別滴加二抗和辣根酶標(biāo)記工作液，37℃溫箱分別孵育20 min。PBS洗滌后DAB顯色，蘇木精輕度復(fù)染，自來(lái)水水洗返藍(lán)，梯度酒精常規(guī)脫水，中性樹(shù)膠封片，于Eclipse TE 2000-S 免疫熒光顯微鏡下觀(guān)察結(jié)果。

2.9Western blot 先提取總蛋白再用BCA法測(cè)定總蛋白濃度。30～50 μg總蛋白上樣量以濃度為8%的凝膠電泳分離。冰水浴下恒流(300 mA)濕法轉(zhuǎn)膜1.5 h，以體積分?jǐn)?shù)5%的脫脂奶粉封閉1 h，加一抗。4℃共孵育過(guò)夜。TBS-T洗滌，與二抗共孵育2 h，用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行顯色，并利用灰度分析軟件定量分析，以β-actin的灰度值標(biāo)化蛋白表達(dá)水平。2.10Quantitive real-time polymerase chain reaction(qRT-PCR)取約100 mg腦組織放入研缽中，加入少量液氮敲碎，用預(yù)冷的廣口槍頭轉(zhuǎn)移至勻漿器中，加入1 mL TRIzol勻漿使裂解充分，轉(zhuǎn)移至EP管中待用；提取組織總 RNA；按AMV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄后，4℃保存。擴(kuò)增條件: 94℃ 15 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s，共35個(gè)循環(huán)。2%瓊脂糖凝膠電泳后，凝膠成像儀觀(guān)察，用 BandScan 5.0軟件測(cè)定條帶灰度值，將各mRNA表達(dá)水平分別與β-actin mRNA灰度值的比值作為觀(guān)察指標(biāo)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。擴(kuò)增引物如下表。

3　結(jié)果

3.1I/R大鼠的一般特征實(shí)驗(yàn)期間，Sham組大鼠一般狀態(tài)良好、健壯、皮毛有光澤，對(duì)外界反應(yīng)靈敏，無(wú)死亡。與Sham組比較，I/R組大鼠精神萎靡，出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)功能障礙，行走向?qū)?cè)旋轉(zhuǎn)或傾倒，甚至癱瘓。Sham組造模全部成功，I/R模型組造模成功96只，成功率80%。

3.2神經(jīng)功能評(píng)分Sham組因未閉塞大腦中動(dòng)脈，故未出現(xiàn)局灶性神經(jīng)功能缺損癥狀，評(píng)分均為0分；而在造模后I/R模型組神經(jīng)功能評(píng)分均3分左右，表明各模型組均出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)功能缺損癥狀，行走向?qū)?cè)旋轉(zhuǎn)或傾倒。隨著再灌注時(shí)間延長(zhǎng)，自6～48 h神經(jīng)功能缺損癥狀呈逐漸加重趨勢(shì)；與I/R-6 h相比較，I/R-24 h及I/R-48 h神經(jīng)功能評(píng)分差異有顯著性(均為P<0.05)，見(jiàn)Fig 1。

3.3大鼠血腦屏障通透性的變化實(shí)驗(yàn)結(jié)果如Tab 4、Fig 2所示，EB染色范圍反映了大鼠血腦屏障通透性。I/R組與假手術(shù)組相比，血腦屏障通透性明顯增加(P<0.01)；隨著時(shí)間的持續(xù)，與I/R-6 h相比較，I/R-24 h及48 h腦組織均明顯增加血腦屏障通透性(P<0.05)，而I/R-12 h與I/R-6 h組相比較略有增加，但相互之間差異無(wú)顯著性(P>0.05),見(jiàn)Fig 2。

Tab 2　PCR primer used in the experiment

Fig 1　Score of nerve function for I/R rats

##P<0.01vsSham;*P<0.05vsI/R-6 h

3.4腦組織含水量的變化Sham組各時(shí)間點(diǎn)腦組織含水量都維持在較低的正常水平，相互之間差異無(wú)顯著性；與Sham相比較，I/R組各時(shí)間點(diǎn)，腦含水量明顯增加(均為P<0.05)；隨著再灌注時(shí)間延長(zhǎng)，各組別腦含水量均逐漸升高，與I/R-6 h相比較，I/R-12 h、24 h及48 h差異均存在顯著性(均P<0.05),見(jiàn)Fig 3。

3.5腦梗死體積的變化與假手術(shù)組相比，I/R各組腦組織梗死范圍從再灌注6 h逐漸升高(P<0.05)，再灌注48 h達(dá)到峰值，差異有顯著性(P<0.01)。假手術(shù)組無(wú)缺血改變，TTC 染色呈均勻紅色。I/R 組梗死體積百分比，隨再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增加(P<0.05)，在I/R-48 h達(dá)最大(Fig 4，5)。

3.6免疫組化檢測(cè)AQP4表達(dá)及分布在免疫組化中檢測(cè)中，AQP4表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞內(nèi)顯示棕黃色顆粒。如Fig 6分布圖及統(tǒng)計(jì)圖所示，AQP-4蛋白在Sham組表達(dá)很少，與Sham組相比較，I/R模型組各時(shí)間點(diǎn)I/R腦組織AQP-4蛋白表達(dá)差異均有不同程度的上調(diào)，其中I/R-12 h、24 h及48 h差異均存在顯著性(分別為P<0.05，P<0.01，P<0.01)。與I/R-6 h相比較，AQP-4蛋白在I/R-24 h及48 h的表達(dá)水平差異均有顯著性(分別為P<0.05，P<0.01)，I/R-12h的表達(dá)亦增高，差異無(wú)顯著性(P>0.05vsI/R-6 h)，F(xiàn)ig 6。

3.7Western blot檢測(cè)I/R大鼠腦組織相關(guān)蛋白表達(dá)

3.7.1不同時(shí)間點(diǎn)I/R大鼠腦組織AQP4和MMP-9蛋白表達(dá)如Fig 7 Western blot條帶及灰度定量分析結(jié)果所示，I/R模型組各時(shí)間點(diǎn)AQP4蛋白表達(dá)升高，其中I/R-24 h及48 h蛋白表達(dá)升高顯著，與Sham組差異存在顯著性(分別為P<0.05，P<0.01vsSham)；與I/R-6h模型組相比較，I/R-24 h及48 h時(shí)間點(diǎn)，AQP4蛋白表達(dá)增加明顯(P<0.05，P<0.01 vsI/R-6 h)，I/R-12 h模型組表達(dá)增加不明顯(P>0.05),見(jiàn)Fig 7。

Fig 3　Changes of brain water for I/R rats at different time points

#P<0.05vsSham;*P<0.05vsI/R-6 h

Fig 4　Volume of cerebral infarction for I/R rats at different time points

Fig 5　Cerebral infarction for I/R rats

#P<0.05,##P<0.01vsSham;*P<0.05,**P<0.01vsI/R-6 h

如Fig 8 Western blot檢測(cè)結(jié)果所示，與AQP4蛋白表達(dá)趨勢(shì)相似。I/R模型組各時(shí)間點(diǎn)MMP-9蛋白表達(dá)持續(xù)升高，其中I/R-12 h、24 h及48 h蛋白表達(dá)均明顯升高，與Sham組差異存在顯著性(分別為P<0.05，P<0.01，P<0.01)；與I/R-6 h模型組相比較，I/R-24 h及48 h時(shí)間點(diǎn)，MMP-9蛋白表達(dá)增加明顯(均為P<0.01)，I/R-12 h模型組表達(dá)有增加趨勢(shì)，但與I/R-6 h組差異無(wú)顯著性(P>0.05),見(jiàn)Fig 8。

3.7.2不同時(shí)間點(diǎn)I/R大鼠腦組織JAM-1和Occludin蛋白表達(dá)如Fig 9結(jié)果所示，Sham組JAM-1蛋白表達(dá)水平較高，I/R模型組各時(shí)間點(diǎn)，隨著I/R時(shí)間的延長(zhǎng)，JAM-1蛋白表達(dá)持續(xù)降低；其中I/R-12 h、24 h及48 h蛋白表達(dá)均降低明顯，與Sham組差異存在顯著性(分別為P<0.05，P<0.01，P<0.01)，I/R-6 h模型組降低不明顯(P>0.05)；與I/R-6 h模型組相比較，I/R-12 h、24 h及48 h時(shí)間點(diǎn)，JAM-1蛋白表達(dá)均降低明顯(P<0.05，P<0.01，P<0.01),見(jiàn)Fig 9。

Occludin蛋白表達(dá)變化與JAM-1蛋白表達(dá)趨勢(shì)相似，Sham組蛋白表達(dá)水平較高，I/R模型組各時(shí)間點(diǎn)，隨著I/R時(shí)間的延長(zhǎng)，Occludin蛋白表達(dá)穩(wěn)步降低；其中I/R-12 h、24 h及48 h蛋白表達(dá)均降低明顯，與Sham組差異存在顯著性(分別為P<0.05，P<0.01，P<0.01)，I/R-6 h模型組降低不明顯(P>0.05)；與I/R-6 h模型組相比較，I/R-24 h及48 h時(shí)間點(diǎn)，Occludin蛋白表達(dá)均降低明顯(均為P<0.01)，I/R-12 h模型組降低不明顯(P>0.05),見(jiàn)Fig 10。

3.8RT-PCR檢測(cè)I/R大鼠腦組織相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平變化RT-PCR檢測(cè)I/R大鼠模型腦組織相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的差異，見(jiàn)Fig 11，結(jié)果顯示，AQP4 mRNA水平在I/R模型各時(shí)間點(diǎn)均高于Sham組，其中I/R-24 h及48 h AQP4 mRNA的水平明顯高于Sham組和I/R-6 h時(shí)間點(diǎn)模型組(P<0.01)；MMP-9 mRNA水平在I/R-6 h升高不明顯，I/R-12 h、24 h及48 h升高明顯(P<0.05，P<0.01，P<0.01)，與I/R-6 h相比較，I/R-12 h變化不大，I/R-24 h及48 h升高明顯(均為P<0.01)；JAM-1 mRNA水平在Sham組表達(dá)較高，I/R模型組在12 h以后降低明顯(分別P<0.05，P<0.01，P<0.01)，與I/R-6 h相比較，I/R-24 h及48 h降低明顯(均P<0.01)；Occludin mRNA水平與JAM-1 mRNA表達(dá)變化趨勢(shì)相似，I/R-12 h、24 h及48 h降低明顯(P<0.05，P>0.01，P<0.01)，其中I/R-24 h及48 h相對(duì)于I/R-6 h降低明顯(P<0.05，P<0.01)，見(jiàn)Fig 11。

4　討論

近年來(lái)，在腦缺血病理生理方面的大量研究表明，缺血性腦損傷過(guò)程中，除缺氧和能量代謝衰竭外，由缺血誘導(dǎo)的一系列瀑布樣效應(yīng)是導(dǎo)致神經(jīng)元死亡的重要機(jī)制[6]。

Fig 7　Expression of AQP4 protein level in brain for

#P<0.05,##P<0.01vsSham;*P<0.05,**P<0.01vsI/R-6 h

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，I/R后各時(shí)間段模型大鼠神經(jīng)功能評(píng)分都增加，且隨著時(shí)間延長(zhǎng)，神經(jīng)功能評(píng)分也就越高；隨后的腦組織取材研究中也顯示，無(wú)論是腦組織含水量、腦組織通透率，還是腦梗死體積分?jǐn)?shù)都隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而進(jìn)行性加重。

為了進(jìn)一步探討I/R后早期腦水腫發(fā)生的相關(guān)分子機(jī)制，我們對(duì)I/R模型腦組織中AQP4表達(dá)水平進(jìn)行相關(guān)的檢測(cè)。先前的研究表明[2]，水分子的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)和平衡調(diào)節(jié)需要水通道蛋白參與。進(jìn)一步研究表明[4]，AQP4與腦水腫的形成密切相關(guān)，廣泛參與I/R后腦損傷的不同發(fā)展階段。近年來(lái)，AQP4參與腦水腫的形成越來(lái)越受到關(guān)注，成為腦水腫的治療靶點(diǎn)[7-8]。AQP4主要表達(dá)于毛細(xì)血管周?chē)男切文z質(zhì)細(xì)胞足突和室管膜細(xì)胞，尤其在星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)豐富。之前的研究已經(jīng)表明，短暫性I/R增加AQP4的表達(dá)，導(dǎo)致腦水腫。本研究通過(guò)免疫組化及Western blot技術(shù)手段研究缺血區(qū)AQP4蛋白的表達(dá)水平及腦組織分布特征，研究結(jié)果表明，AQP4蛋白表達(dá)水平隨著時(shí)間的延長(zhǎng)迅速的增加，在I/R-48 h時(shí)間點(diǎn)達(dá)到最大表達(dá)水平。伴隨著腦水腫程度加重，AQP4蛋白的表達(dá)增強(qiáng)，這一結(jié)果表明，AQP4的表達(dá)變化與I/R后腦水腫的形成密切相關(guān)。之后的RT-PCR測(cè)定AQP4 mRNA 的表達(dá)也驗(yàn)證了上述結(jié)果。

Fig 8　Expression of MMP-9 protein level in brain

#P<0.05，##P<0.01vsSham;**P<0.01vsI/R-6 h

Fig 9　Expression of JAM-1 protein level in brain for

#P<0.05,##P<0.01vsSham;*P<0.05,**P<0.01vsI/R-6 h

Fig 10　Expression of Occludin protein level in brain for

#P<0.05,##P<0.01vsSham;**P<0.01vsI/R-6 h

緊密連接(tight junction, TJ)是存在于BBB上內(nèi)皮細(xì)胞與毛細(xì)血管之間的復(fù)雜的細(xì)胞系統(tǒng)，是BBB的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，對(duì)維持BBB生理功能具有重要意義[9]。Occludin和JAM-1是組成TJ的主要結(jié)構(gòu)蛋白，是衡量TJ功能變化的重要指標(biāo)[10]。研究顯示[11]，Occludin和JAM-1與BBB通透性的調(diào)節(jié)密切相關(guān)，其表達(dá)變化可作為衡量BBB損傷程度的標(biāo)志。Terry等[12]研究證實(shí)，Occludin與腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的“屏障”作用密切相關(guān)。進(jìn)一步研究表明，在腦微血管內(nèi)皮系統(tǒng)損傷中，Occludin含量降低，伴隨著B(niǎo)BB通透性的降低。與此同時(shí)，研究顯示 JAM-1參與緊密連接創(chuàng)傷后的再修復(fù)及上皮屏障功能的調(diào)節(jié)，JAM-1的表達(dá)與Occludin相一致，提示JAM-1同樣參與腦組織緊密連接的構(gòu)成。本研究通過(guò)對(duì)TJPs的蛋白表達(dá)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)隨著I/R后時(shí)間的延長(zhǎng)，JAM-1及Occludin蛋白的表達(dá)水平降低，伴隨著血腦屏障通透性的增加以及腦含水量的增加。據(jù)此我們推測(cè)I/R導(dǎo)致的腦損傷是通過(guò)下調(diào)TJPs的表達(dá)，包括JAM-1及Occludin在內(nèi)的相關(guān)蛋白表達(dá)水平下降，從而降低了血腦屏障完整性，增加了I/R后血腦屏障的通透性，從而造成了不斷加重的腦水腫癥狀。

MMP-9 是腦缺血后過(guò)度表達(dá)的炎癥因子。研究證實(shí)[13-14]，MMP-9可以通過(guò)降解Occludin等緊密連接蛋白，導(dǎo)致血腦屏障通透性增加。腦缺血時(shí)給予MMP-9組織抑制劑或MMP-9中和抗體治療，可明顯降低血腦屏障通透性，減小梗死體積[15]。進(jìn)一步闡明腦水腫發(fā)生過(guò)程中TJPs表達(dá)降低的具體病理生理過(guò)程，我們檢測(cè)了MMP-9蛋白的表達(dá)水平。Western blot結(jié)果顯示，隨著I/R后腦損傷的加劇，MMP-9的表達(dá)也是相伴增加的。

由此，我們推測(cè)I/R后伴隨著腦組織損傷而產(chǎn)生的腦水腫可能是因?yàn)镸MP-9蛋白的過(guò)表達(dá)，導(dǎo)致腦組織中大量的JAM-1及Occludin蛋白的降解，破壞了腦血腦屏障的結(jié)構(gòu)與功能，大量的AQP4蛋白的表達(dá)，使得腦組織水及電解質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)紊亂，各種炎性介質(zhì)也隨之進(jìn)入腦組織，從而導(dǎo)致腦水腫的發(fā)生與不斷的發(fā)展?？傊?，本部分研究?jī)?nèi)容從分子角度初步探究了I/R后腦水腫形成的病理生理過(guò)程，為進(jìn)一步藥物干預(yù)研究提供了研究基礎(chǔ)和理論依據(jù)，也為臨床預(yù)防和治療腦水腫將提供重要的參考。

(致謝:本實(shí)驗(yàn)全部由中國(guó)藥科大學(xué)藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)室吳玉林老師課題組獨(dú)立完成，感謝我的導(dǎo)師吳玉林老師在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)思路上提出的建議和意見(jiàn)及實(shí)驗(yàn)技術(shù)上給予的指導(dǎo)。)

Fig 11　Expression of mRNA levels of related factors with AQP4 in brain for I/R rats at different time ±s,n=6)

A:Relative mRNA expression of AQP4;B:Relative mRNA expression of MMP-9;C:Relative mRNA expression of JAM-1;D:Relative mRNA expression of Occludin.#P<0.05,##P<0.01vsSham;*P<0.05,**P<0.01vsI/R-6 h

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Dynamic expression of AQP4 in early stageof ischemia/reperfusion rats and cerebral edema

XU Shu-hong1,2, KANG Chen3, CHEN Mei-ling1,ZHOU Pei-pei1,HE Guang-wei4,CUI Ya-jiao1, YANG Di1, WU Yu-lin1

(1.InstituteofBasicMedicineandClinicalMedicine,ChinaPharmaceuticalUniversity,Nanjing211198,China;2.Instituteofmedicine,ChineseAcademyofMedicalSciences,PekingUnionMedicalCollege,Beijing100050,China;3.DivisionofPharmacology,CollegeofPharmacy,TheOhioStateUniversity,Columbus,OH,USA43210;4.HefeiMedicalProfessionalsPharmaceuticalCo.,LTD,Hefei230031,China)

AimTo make a research of rats with focal cerebral ischemia/reperfusion injury on pathological changes in brain and the changes of AQP4 and related proteins, in order to explore the relationship between AQP4 and brain edema.MethodsAdult male SD rats, weighting 250～300 g, were randomly divided into Sham group and cerebral ischemia/reperfusion(I/R) injury model group.The I/R model group was divided into the I/R-6 h, 12 h, 24 h, 48 h-four time point groups. The animal model of the right MCA ischemia/reperfusion was established by suture method in mature SD rats.The nerve symptom score was conducted in the corresponding time points. Then, the permeability of brain tissue was detected by EB staining; TTC staining was conducted to observe the cerebral infarction volume; the dry wet weight method was used to detect the changes of brain water content; immunohistochemical(IHC), WB and RT-PCR were applied to detect the expression of AQP4, and the related factors at different time points of the model rats after ischemia-reperfusion around infarcts.ResultsCompared with the Sham group, then ever function score of the rats in I/R model groups were much higher. With the increase of the reperfusion time, the cerebral infarction volume, brain tissue permeability and the brain water content were also increased. IHC results showed that AQP4 expression gradually rose with widen distribution. WB and RT-PCR results verified the increasing level of AQP4 expression. The detection of the related proteins expression showed apparent changes. The expression of MMP-9 was increased, while the Occludin and JAM-1 expression showed a decreasing trend.The I/R-48 h model group showed the most obvious differences in the expression of the related proteins and mRNA(P<0.01vsSham, respectively).ConclusionAccompanied with the aggravating cerebral injury after cerebral ischemia/reperfusion, the expression of AQP4 and MMP-9 level were activated, while the degradation of TJPs, Occludin and JAM-1,was increased. These factors are combined to make the formation of brain edema. This study makes a further research on the formation mechanism of the early stage for cerebral edema on I/R model and offers a potential for intervention in the filed of looking for a reliable drug therapy on cerebral edema.

ischemia/reperfusion；cerebral edema；AQP4；MMP-9；Occludin；JAM-1

時(shí)間：2016-9-22 11:14

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160922.1114.040.html

2016-06-19,

2016-08-26

國(guó)家“科技部重大新藥創(chuàng)制”科技重大專(zhuān)項(xiàng)基金資助項(xiàng)目(No 2009ZX09103-123)

許淑紅(1989-)，女，碩士生，研究方向：心腦血管藥理學(xué)，E-mail：2339855844@qq.com；

吳玉林(1956-)，男，副教授，研究方向：心腦血管藥理學(xué)，通訊作者，E-mail：wylcpu0801@163.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.10.020

A

1001-1978(2016)10-1433-09

R-332；R322.81；R341；R742；R743.31；R973.3；R977.6