青錢柳中黃酮成分提取工藝的優(yōu)化及微量元素分析

鄧佑林，彭繼升，李 芳，朱麗威，于麗敏，王美春，楊盼盼，唐 石

（1.吉首大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，湖南 吉首 416000；2.古丈春風(fēng)合民族食品開發(fā)有限公司，湖南 古丈 416300）

研究與開發(fā)

青錢柳中黃酮成分提取工藝的優(yōu)化及微量元素分析

鄧佑林1，彭繼升2，李 芳1，朱麗威1，于麗敏1，王美春1，楊盼盼1，唐 石1

（1.吉首大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，湖南 吉首 416000；2.古丈春風(fēng)合民族食品開發(fā)有限公司，湖南 古丈 416300）

采用索氏提取法提取青錢柳中的總黃酮，考察了提取液、溶劑濃度、提取時(shí)間和提取次數(shù)對(duì)總黃酮提取率的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，最優(yōu)化的工藝條件為：乙醇作為提取液，乙醇濃度為 80%，提取時(shí)間為2h，提取次數(shù)為3次。另外，原子吸收分光光度法分析結(jié)果表明，青錢柳提取液含有鉀、磷、鈣、鎂、鐵、錳、銅、鋅等微量元素。

青錢柳；黃酮；微量元素

青錢柳是僅存在于我國的一種重點(diǎn)保護(hù)植物，于冰川世紀(jì)幸存下來[1]，在我國南方居多且以湘西南地區(qū)為主。青錢柳在湘西南地區(qū)一直被當(dāng)?shù)睾芏嚅L壽老人稱為“神茶”，到20世紀(jì)70年代，我國科研工作者發(fā)現(xiàn)其優(yōu)點(diǎn)并進(jìn)行研究，但對(duì)青錢柳藥理作用及理化成分的研究則始于20世紀(jì)末[2]。

醫(yī)學(xué)分析表明，黃酮等有機(jī)成分和微量元素具有抗氧化效果，并且有利于人體免疫功能的提高和改善[3-4]。研究已證實(shí)青錢柳中含有大量的黃酮類有機(jī)物成分和很多人體所需的微量元素，具有很好的降血壓、降血脂、降血糖、增強(qiáng)人體免疫等功能。目前國內(nèi)已經(jīng)有利用青錢柳開發(fā)的新型保健品和相關(guān)藥物，其中一種保健茶已經(jīng)得到美國食品與藥品管理局的認(rèn)可[5-9]，由此可見青錢柳茶在茶產(chǎn)業(yè)開發(fā)中獨(dú)領(lǐng)風(fēng)騷，具有很好的市場(chǎng)前景。

利用湘西的青錢柳進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，將豐富青錢柳相關(guān)保健產(chǎn)品的種類，若能實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，可以增加當(dāng)?shù)鼐用竦氖杖?，解決就業(yè)問題，這也為青錢柳的綜合開發(fā)利用，以及尋求經(jīng)濟(jì)環(huán)保高附加值的產(chǎn)業(yè)化開辟新的方向。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器和藥品

1.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

UV-2450型紫外分光光度計(jì)，EX-CG型偏振式能量色散X射線熒光光譜儀，KQ-250E型超聲波清洗器，DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，JA2003N型電子天平，SHB-Ⅲ型臺(tái)式循環(huán)水式多用真空泵，數(shù)顯恒溫水浴鍋。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與材料

青錢柳（湖南省永順縣）；無水乙醇、硝酸鋁、氫氧化鈣、甲醇、亞硝酸鈉、濃硫酸、雙氧水、氫氧化鈉（均為分析純）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 青錢柳樣品的預(yù)處理

青錢柳嫩芽葉采集于湘西永順地區(qū)，洗凈后放入100℃的烘箱內(nèi)烘烤72h，待青錢柳樣品干燥后，將其粉碎至0.25mm備用。

1.2.2 青錢柳中微量元素含量的測(cè)定

1）樣品溶液的制備：采用硫酸-雙氧水消煮法制取樣品[10]。將已經(jīng)粉碎至0.25mm的青錢柳樣品稱取4.0g，放入250mL的錐形瓶中，并且用蒸餾水將粘附在錐形瓶頸上的樣品沖洗進(jìn)溶液中，用25mL的移液管移取16mL濃硫酸（98%）加入到錐形瓶（放置12h），過氧化氫溶液80滴分5批加入，在電爐上加熱硝化，冷卻后再用蒸餾水定容于250mL容量瓶中，搖勻備用。

2）測(cè)量方法：吸取2.5mL樣品定容至25mL的容量瓶中用火焰光度法測(cè)定鉀；吸取2.5mL樣品用二次蒸餾水定容至25mL容量瓶中，用原子吸收分光光度法測(cè)定鐵、錳、銅、鋅、鈣、鎂等元素。

1.2.3 青錢柳中總黃酮含量的測(cè)定

1）乙醇提取方法：將已經(jīng)粉碎至0.25mm的青錢柳樣品分別稱取兩份各2.0g，裝入250mL索式提取器的濾紙筒中，在2個(gè)圓底燒瓶中分別加入80%和60%的乙醇各150mL以及沸石，在78℃的水浴中加熱，回流提取2h，待索氏提取器中的冷凝液剛剛被虹吸下去時(shí)停止加熱。濾渣相應(yīng)地加80%和60%乙醇各50mL，再回流提取0.5h，過濾，濾渣用10mL乙醇（80%和60%）溶液各洗滌3次。合并濾液與洗液，用石油醚脫色2次，每次使用20mL，將醚層去除，將溶液用80%和60%的乙醇定容至250mL容量瓶。

2）水提取方法：將已經(jīng)粉碎至0.25mm的青錢柳樣品稱取兩份各2.0g，放入250mL索式提取器的濾紙筒中，在圓底燒瓶中加入蒸餾水150mL以及沸石，在100℃的水浴鍋中回流，回流提取時(shí)間2h，待索氏提取器中的冷凝液剛剛被虹吸下去時(shí)停止加熱。濾渣用蒸餾水回流提取0.5h，過濾后的濾渣用30mL蒸餾水分3次洗滌。合并2次蒸餾的濾液與3次洗滌的洗液，將溶液用蒸餾水定容至250mL容量瓶。

1.2.4 對(duì)照品溶液的制備

1）蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備：用電子天平精密稱取2.75mg已在120℃的干燥箱內(nèi)干燥至恒重的蘆丁對(duì)照品，用80%乙醇定容至25mL容量瓶中，可得0.11mg·mL-1的蘆丁對(duì)照樣品。

2）槲皮素標(biāo)準(zhǔn)溶液：用電子天平精密稱取6mg已在120℃的干燥箱內(nèi)干燥至恒重的槲皮素對(duì)照品，用80%乙醇定容至50mL容量瓶中，可得0.12mg·mL-1的槲皮素對(duì)照樣品。

2 結(jié)果與討論

2.1 微量元素提取

青錢柳中提取的微量元素含量用下面的公式進(jìn)行計(jì)算：

式中：M為微量元素含量，mg·(100g)-1；V為萃取液的體積，mL；m為樣品質(zhì)量，g；y為空白溶液的濃度；x為樣品溶液的濃度。

表1 青錢柳中提取的微量元素含量測(cè)定結(jié)果 /×10-6

2.2 提取總黃酮的結(jié)果

2.2.1 蘆丁含量的測(cè)定

取2支30mL具塞試管，分別加入青錢柳提取液、蘆丁對(duì)照品溶液各2mL，依次加入60%的乙醇10mL，用移液管移取5%亞硝酸鈉0.6mL，搖勻，放置6min，后加入10%的硝酸鋁0.6mL，再放置6min，加5%氫氧化鈉8mL，加蒸餾水至刻度，搖勻，放置15min后以蒸餾水為空白對(duì)照進(jìn)行掃描。在500nm處蘆丁有最大吸收，使樣品成為暗紅色。掃描得出樣品在498nm處有一吸收峰。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，青錢柳樣品的最大吸收峰與蘆丁有很好的重合度。

圖1 乙醇和水提取、硝酸鋁絡(luò)合后的紫外可見光譜圖（蘆?。?/p>

2.2.2 槲皮素含量的測(cè)定

取2支30mL具塞試管，分別加入青錢柳提取液、槲皮素對(duì)照品溶液2mL，依次加入60%的乙醇10mL，用移液管移取5%亞硝酸鈉0.6mL，搖勻，放置6min后，加入10%的硝酸鋁0.6mL，再放置6min，加5%氫氧化鈉8mL，加蒸餾水至刻度，搖勻，放置15min后以蒸餾水為空白對(duì)照進(jìn)行掃描。在316nm處槲皮素有最大吸收，樣品顯色后為暗紅色，本實(shí)驗(yàn)掃描得出青錢柳樣品在316nm處有一吸收峰。

圖2 乙醇和水提取硝酸鋁絡(luò)合后的紫外可見光譜圖（槲皮素）

2.2.3 最佳反應(yīng)條件的摸索

首先對(duì)青錢柳提取工藝中的提取液進(jìn)行了探索。分別以80%乙醇、60%乙醇和水為提取液，對(duì)青錢柳葉進(jìn)行提取。實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，乙醇作為提取液時(shí)的提取率高于水提取時(shí)的提取率，其中80%的乙醇提取液對(duì)青錢柳黃酮含量的提取率最高，不同提取液提取的黃酮紫外可見光譜圖如圖3所示。

圖3 乙醇和水提取紫外可見光譜圖（蘆丁）

實(shí)驗(yàn)還對(duì)青錢柳的提取時(shí)間進(jìn)行了探索。分別以80%乙醇、60%乙醇和水為提取液，對(duì)青錢柳葉進(jìn)行提取，并且選用不同的提取時(shí)間進(jìn)行探索。實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，2h的提取時(shí)間，青錢柳中黃酮物質(zhì)的提取率最高。不同提取液提取的黃酮紫外可見光譜圖如圖4、圖5、圖6所示。

圖4 80%乙醇提?。?h）硝酸鋁絡(luò)合后的紫外可見光譜圖（蘆丁）

2.2.4 總黃酮含量的計(jì)算

圖5 60%乙醇提?。?h）硝酸鋁絡(luò)合后的紫外可見光譜圖（蘆?。?/p>

圖6 蒸餾水提?。?h）硝酸鋁絡(luò)合后的紫外可見光譜圖（蘆?。?/p>

取12只30mL具塞試管，分別用移液管吸取蘆丁樣品溶液和槲皮素樣品溶液0.0mL、2.0mL、4.0mL、 6.0mL、8.0mL、10.0mL，加60%的乙醇10.0mL，加5%亞硝酸鈉0.6mL，搖勻，放置6min，加10%硝酸鋁0.6mL，再放置6min，加5%氫氧化鈉8.0mL，加蒸餾水至刻度，搖勻，放置15min后以零管作為空白，于200~600nm波長下測(cè)定相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度。以蘆丁含量(μg)對(duì)吸光度作圖，得出其標(biāo)準(zhǔn)曲線，以槲皮素含量(mg)對(duì)吸光度作圖，得出其標(biāo)準(zhǔn)曲線。

蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)曲線：A=0.01204C- 0.00263，R2=0.9996

槲皮素的標(biāo)準(zhǔn)曲線：C=119.41A+0.0204，R2=0.9994

式中：C為標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，mg·mL-1；A為吸光度。

表2 3種提取液提取2h的總黃酮含量

本實(shí)驗(yàn)中用硝酸鋁顯色法顯色，其原理是先用亞硝酸鈉還原黃酮類物質(zhì)，再加硝酸鋁與黃酮類物質(zhì)絡(luò)合，最后為了使黃酮類化合物開環(huán)，生成新物質(zhì)2’-羥基查耳酮而向其中加入氫氧化鈉溶液。總黃酮含量為其黃酮類成分的總量，非黃酮類成分不和該氫氧化鈉溶液發(fā)生反應(yīng)，在所選最大吸收波長處非黃酮類成分不會(huì)有吸收。

3 結(jié)論

采用火焰光度法測(cè)定青錢柳中的K，用原子吸收分光光度法測(cè)定青錢柳中的Fe、Mn、Cu、Zn、Ca、Mg等，結(jié)果表明青錢柳中含有K、Fe、Mn、Cu、Zn、Ca、Mg等元素，其中Mg、Zn、Mn、Ca等元素含量較多。

本實(shí)驗(yàn)采用索式提取法提取青錢柳中的總黃酮，提取效果好，操作簡單，不影響提取產(chǎn)物活性，具有較好的應(yīng)用價(jià)值。結(jié)果表明，在提取液為80%乙醇，提取時(shí)間為2h的條件下，總黃酮的提取含量達(dá)到42.782mg·g-1。無論是乙醇提取液還是在水提液中，槲皮素等黃酮類化合物的含量都較高。從含量上看，水提取的黃酮含量約只有乙醇提取的一半。

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Extraction Process Optimization of Total Flavonoids in Cyclocarya Paliurus and Trace Element Analysis

DENG You-lin1, PENG Ji-sheng2, LI Fang1, ZHU Li-wei1, YU Li-min1, WANG Mei-chun1, YANG Pan-pan1,TANG Shi1
(1.College of Chemistry and Chemical Engineering, Jishou University, Jishou 416000, China; 2.Guzhang Spring Together National Food Development Limited Corporation, Guzhang 416300, China)

A extraction procedure for total favonoids from cyclocarya paliurus by soxhlet extraction, was studied. The infuence of extracting solution, solvent strength, extraction time and extraction degree on the total favonoids extraction rate was investigated. The results showed that the best factors were: ethanol concentration of 80%, the extraction time was 2h, extraction for 3 times. The content of 8 kinds of mineral elements in the extraction solution, such as potassium, phosphate, calcium, magnesium, iron, manganese, copper and zinc, were confrmed by absorption spectrophotometry.

cyclocarya paliurus; favonoids; trace element

R 284.2

A

1671-9905(2016)04-0001-04

國家自然基金資助項(xiàng)目（21462017）；林產(chǎn)化工工程湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金項(xiàng)目（JDZ201402）；吉首大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院研究生專項(xiàng)科研課題；吉首大學(xué)湖南省研究生培養(yǎng)創(chuàng)新基地（2014KFXM06）

鄧佑林（1990-），男，湖南衡陽人，吉首大學(xué)碩士研究生，主要從事天然產(chǎn)物化學(xué)、有機(jī)化學(xué)研究。電話：15200791307，

E-mail：461958538@qq.com

唐石（1979-），男，湖南衡陽人，吉首大學(xué)教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事有機(jī)化學(xué)、天然產(chǎn)物化學(xué)研究

2016-02-26