液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜負(fù)離子模式測(cè)定雞肉中磺胺硝苯的殘留

魏云計(jì)

摘 要：建立高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定雞肉中磺胺硝苯殘留的方法。樣品經(jīng)過(guò)甲酸-乙酸乙酯（2∶98，V/V）提取，正己烷脫脂，液-液分配凈化后，C18柱分離，甲醇、5 mmol/L乙酸銨為流動(dòng)相梯度洗脫，采用負(fù)離子掃描多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multiple reaction monitoring，MRM）模式下液質(zhì)聯(lián)用儀進(jìn)行定性和定量分析。在2.0～100.0 μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，線性相關(guān)系數(shù)大于0.99，方法的檢出限和定量限分別為0.5 μg/kg和2.0 μg/kg，在2.0、5.0、10.0 μg/kg添加量的回收率為76.0%～83.4%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）小于8.7%。該方法簡(jiǎn)便快捷，可用于雞肉中磺胺硝苯殘留量測(cè)定。

關(guān)鍵詞：液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；負(fù)離子模式；雞肉；磺胺硝苯

Abstract： A method for the determination of sulfanitran in chicken was developed by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Samples were extracted with formic acid-ethyl acetate （2：98， V/V）， and the extract was defatted by hexane extraction and cleaned up by liquid-liquid partitioning. The analyte was separated on a C18 colum using a mobile phase consisting of methanol and 5 mmol/L ammonium acetate solution with gradient elution. The mass spectrometry was operated in negative ion mode using multiple reaction monitoring （MRM） for qualitative and quantitative analysis. The calibration curve of the method was linear in the range of 2.0–100.0 μg/L， with correlation coefficient more than 0.99. The limit of detection （LOD） and limit of quantitation （LOQ） were 0.5 μg/kg and 2.0 μg/kg， respectively. At spiked levels of 2.0， 5.0， 10.0 μg/kg， the recoveries ranged from 76.0% to 83.4% with relative standard deviations （RSD） less than 8.7%. This method proved to be convenient and suitable for the determination of sulfanitran residues in chicken.

Key words： liquid chromatography-tandem mass spectrometry； negative ion mode； chicken； sulfanitran

DOI：10.15922/j.cnki.rlyj.2016.08.007

中圖分類號(hào)：TS251.7 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-8123（2016）08-0035-04

磺胺硝苯屬于磺胺類的一種抗球蟲(chóng)藥物，此藥抑制球蟲(chóng)體內(nèi)的二氫葉酸合成酶阻礙葉酸合成導(dǎo)致核酸合成受阻從而使蟲(chóng)體繁殖受到抑制，該藥作用是在球蟲(chóng)無(wú)性繁殖階段抑制第二代裂殖體的發(fā)育，對(duì)第一代裂殖體也有一定抑制作用，主要用于家禽球蟲(chóng)病的治療與預(yù)防[1]。研究表明，磺胺類藥物在體內(nèi)的作用時(shí)間和代謝時(shí)間較長(zhǎng)，人體長(zhǎng)期食用含有此類藥物的食品會(huì)在體中蓄積，進(jìn)而對(duì)人體機(jī)能產(chǎn)生危害[2-4]，破壞人的造血系統(tǒng)，造成溶血性貧血[5]，并導(dǎo)致病原體產(chǎn)生抗藥性，發(fā)生過(guò)敏反應(yīng)[6-7]。為保障食用者的安全我國(guó)及歐盟規(guī)定肉類食品中的磺胺類藥物的最高殘留限量（maximum residue limit，MRL）為：?jiǎn)我换前奉愃幬?5.0 μg/kg，磺胺類藥物總量100.0 μg/kg[8-14]。

目前使用現(xiàn)代分析儀器對(duì)動(dòng)物源性食品、化妝品及飼料中磺胺硝苯檢測(cè)的方法文獻(xiàn)報(bào)道很多，主要有液相色譜法[15-18]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[19-25]。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜抗干擾能力強(qiáng)、選擇性好檢測(cè)靈敏度高，已被廣泛應(yīng)用于磺胺類獸藥殘留檢測(cè)。文獻(xiàn)所報(bào)道的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)磺胺硝苯的方法均是正離子監(jiān)測(cè)模式，尚未有使用負(fù)離子監(jiān)測(cè)模式的方法報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)分別優(yōu)化了正、負(fù)離子監(jiān)測(cè)模式下的儀器方法。通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，使用負(fù)離子監(jiān)測(cè)模式的靈敏度高于正離子監(jiān)測(cè)模式，降低了磺胺硝苯的檢測(cè)限，更好地保障消費(fèi)者的安全。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞肉樣品購(gòu)于淮安蘇果超市。

磺胺硝苯（純度為98%） 德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司；甲醇、乙酸乙酯均為色譜純 美國(guó)默克公司；正己烷、甲酸均為色譜純 美國(guó)天地公司；無(wú)水硫酸鈉為分析純 南京化學(xué)試劑有限公司；水為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

TSQ Quantum Ultra EMR串聯(lián)質(zhì)譜儀（配有電噴霧離子（electrospray ionization，ESI）源）、Surveyor液相色譜系統(tǒng)（包括自動(dòng)進(jìn)樣器Autosampler 1.3）、MS Pump 2.0質(zhì)譜泵 美國(guó)Thermo Fisher公司；ZORBAX SB-C18色譜柱 美國(guó)Agilent公司；氮吹儀 美國(guó)Organomation

公司；超純水器 美國(guó)Millipore公司；離心機(jī) 美國(guó)Sigma公司；超聲波清洗儀 寧波新芝生物科技公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱取磺胺硝苯標(biāo)準(zhǔn)品10.00 mg，用甲醇溶解并定容至10 mL，配成1.0 g/L標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于冰箱中冷凍避光保存，實(shí)驗(yàn)中根據(jù)需要用甲醇稀釋至適當(dāng)質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3.2 樣品提取

準(zhǔn)確稱取（5.00±0.05） g樣品于50 mL離心管中，加入10 mL甲酸-乙酸乙酯（2∶98，V/V），于渦旋混合器上混勻1 min，超聲波提取10 min；以8 000 r/min的速率離心3 min，轉(zhuǎn)移上層有機(jī)溶液至20 mL氮吹管中；再用8 mL甲酸-乙酸乙酯（2∶98，V/V）重復(fù)提取殘?jiān)? 次，合并2 次提取液于氮吹管中，于45 ℃水浴中氮吹至干，用1.0 mL甲醇-水（2∶8，V/V）溶解，加入1.0 mL正己烷溶液，渦旋混勻，10 000 r/min離心3 min，下層溶液經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾至進(jìn)樣瓶中，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀分析。

1.3.3 HPLC-MS/MS條件

HPLC條件：Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱（150 mm×2.1 mm，3.5 ?m）；進(jìn)樣量：25 μL；柱溫：30 ℃；流動(dòng)相：A為5 mmol/L乙酸銨，B為甲醇；梯度洗脫條件：0～4 min 70%A；4.1～6.5 min 20% A；6.6～8.5 min 70% A；流速：250 μL/min。

MS/MS條件：采用ESI源；負(fù)離子方式掃描；噴霧電壓：2 500 V；離子源溫度：400 ℃；鞘氣：40 bar，輔助氣：15 bar；毛細(xì)管溫度：350 ℃；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multiple reaction monitoring，MRM）方式檢測(cè)；優(yōu)化質(zhì)譜條件見(jiàn)表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

磺胺類藥物為弱堿性，結(jié)構(gòu)式中具有仲氨基或者叔氨基的化學(xué)電離性質(zhì)，文獻(xiàn)[26-28]報(bào)道的都是選用ESI+作為離子化模式。本實(shí)驗(yàn)在已有文獻(xiàn)[29-30]報(bào)道的基礎(chǔ)上，采用注射泵直接進(jìn)樣的方式，將質(zhì)量濃度為1 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，以5 μL/min的流速注入離子源中。首先在正離子模式下進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜分析，得到m/z 336.0分子離子峰，通過(guò)對(duì)輔助氣、噴霧電壓、透鏡補(bǔ)償電壓等參數(shù)優(yōu)化獲得m/z 336.0，最高響應(yīng)值為3.69×105，儀器響應(yīng)強(qiáng)度較低；對(duì)磺胺硝苯在負(fù)離子模式下進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜掃描分析，得到m/z 334.0分子離子峰，通過(guò)優(yōu)化輔助氣、噴霧電壓、透鏡補(bǔ)償電壓等參數(shù)獲得m/z 334.0最高響應(yīng)為1.3×106，是正離子模式響應(yīng)強(qiáng)度的3.5 倍，選定負(fù)離子模式進(jìn)行監(jiān)測(cè)，再對(duì)m/z 334.0準(zhǔn)分子離子峰進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，得到其相應(yīng)的碎片離子信息。然后對(duì)每種物質(zhì)的二級(jí)質(zhì)譜進(jìn)行碰撞能量、碰撞氣、透鏡補(bǔ)償電壓等參數(shù)優(yōu)化，使每種物質(zhì)的分子離子與特征碎片離子產(chǎn)生的離子對(duì)強(qiáng)度達(dá)到最大時(shí)為最佳，得到m/z 136.5、270碎片離子。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相同進(jìn)樣量的磺胺硝苯用Q1掃描ESI（-）比ESI（+）具有更高的響應(yīng)值（圖1），靈敏度大幅度提高，所以磺胺硝苯采用負(fù)離子模式監(jiān)測(cè)。

2.2 流動(dòng)相的選擇

磺胺硝苯采用ESI（-）離子模式監(jiān)測(cè)，在流動(dòng)相中未添加甲酸或者乙酸等酸性供質(zhì)子體物質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)考察了甲醇-水、乙腈-水混合溶劑作為流動(dòng)相對(duì)磺胺硝苯的色譜行為和離子化程度的影響。結(jié)果表明，甲醇-水為流動(dòng)相時(shí)儀器響應(yīng)值、色譜峰面積高于乙腈-水為流動(dòng)相時(shí)儀器響應(yīng)值、色譜峰面積。實(shí)驗(yàn)還比較了在水相加入5 mmol/L乙酸銨對(duì)色譜峰的影響，研究表明，流動(dòng)相為甲醇-5 mmol/L乙酸銨時(shí)，峰形優(yōu)于甲醇-水為流動(dòng)相，因此選擇甲醇-5 mmol/L乙酸銨為流動(dòng)相。

2.3 提取溶劑的選擇

磺胺硝苯具有較強(qiáng)極性，pKa為14.5，易溶于酸性溶液和乙腈、乙酸乙酯、甲醇等極性有機(jī)溶劑。本實(shí)驗(yàn)考察了乙腈、甲酸-乙酸乙酯（1∶199、1∶99、2∶98、3：97、4∶96、5∶95，V/V）和乙酸乙酯的提取效率。結(jié)果表明，上述幾種溶劑對(duì)磺胺硝苯均有較好的提取效果，乙腈對(duì)肌肉組織滲透能力較強(qiáng)，沉淀蛋白的效果較好，提取的脂肪含量較少，但是提取的基質(zhì)干擾較大，磺胺硝苯受基質(zhì)效應(yīng)影響較強(qiáng)，添加回收率較低；乙酸乙酯提取的基質(zhì)干擾較少，但提取出較多的脂肪，可以通過(guò)正己烷脫脂凈化處理去掉脂肪，添加回收率明顯優(yōu)于乙腈；磺胺硝苯易溶于酸性溶液，使用酸性乙酸乙酯提取回收率高于乙酸乙酯，實(shí)驗(yàn)對(duì)甲酸的用量進(jìn)行優(yōu)化，當(dāng)隨著甲酸體積分?jǐn)?shù)加大，磺胺硝苯的回收率逐漸提高，當(dāng)其體積分?jǐn)?shù)大于2%時(shí)回收率增加不明顯，加大甲酸用量可以加強(qiáng)沉淀蛋白的效果，但是隨著甲酸體積分?jǐn)?shù)的提高，提取的基質(zhì)干擾較多，因此，采用甲酸-乙酸乙酯（2∶98，V/V）混合溶液作為提取溶劑。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)、準(zhǔn)曲線線性范圍及定量限

2.5 方法的回收率和精密度

選取陰性雞肉樣品，添加磺胺硝苯標(biāo)準(zhǔn)品，添加水平為2.0、5.0、10.0 μg/kg，每個(gè)水平進(jìn)行5 次平行實(shí)驗(yàn)，按上述優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定各組分的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見(jiàn)表2。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)建立了負(fù)離子監(jiān)測(cè)模式測(cè)定雞肉中磺胺硝苯殘留的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)法，較正離子監(jiān)測(cè)模式儀器靈敏度大幅度提高，采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)減弱基質(zhì)效應(yīng)對(duì)磺胺硝苯定量分析的影響。該方法操作簡(jiǎn)便快速，靈敏度較高，回收率較好，滿足實(shí)際檢測(cè)工作的需要。

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