免疫膠體金法定量檢測(cè)促甲狀腺激素的實(shí)驗(yàn)性能測(cè)試

王婷婷，單鳳玲，陸漢魁

（上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，上海200233）

免疫膠體金法定量檢測(cè)促甲狀腺激素的實(shí)驗(yàn)性能測(cè)試

王婷婷，單鳳玲，陸漢魁

（上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，上海200233）

目的 免疫膠體金法用于快速檢測(cè)受試者手指全血的促甲狀腺素（TSH），可以定量分析且快速簡(jiǎn)便。本研究擬對(duì)免疫膠體金法定量檢測(cè)TSH的精密度性能及檢測(cè)儀器間是否存在差異進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。方法 設(shè)計(jì)7個(gè)不同濃度的促甲狀腺激素（TSH）質(zhì)控品和人血清樣本，每天對(duì)各樣本重復(fù)測(cè)定4次，持續(xù)5天，計(jì)算重復(fù)性（批內(nèi)CV）和中間精密度（CV）。選用33份不同濃度的TSH血清標(biāo)本，分別用檢測(cè)儀器1和檢測(cè)儀器2進(jìn)行判讀分析，比較兩者結(jié)果的相關(guān)性。結(jié)果 質(zhì)控品和病人血清TSH濃度為1.20、2.51、3.46、5.02、7.63、10.03、11.08μIU/mL，對(duì)應(yīng)的批內(nèi)CV分別為30.00%、17.84%、16.50%、15.00%、13.92%、10.62%、9.62%，中間精密度CV分別為 29.23%、20.19%、18.15%、16.60%、15.34%、10.42%、8.76%。二臺(tái)檢測(cè)儀器檢測(cè)TSH值相關(guān)性r為0.968，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)論 免疫膠體金法定量檢測(cè)TSH在低濃度TSH水平的精密度變異較大，但在中高濃度TSH尤其＞10μIU/mL情況下，檢測(cè)精密性能良好。不同檢測(cè)儀器間檢測(cè)結(jié)果也無(wú)明顯差異。

精密度； 促甲狀腺激素（TSH）； 免疫膠體金法

采用免疫膠體金法定量TSH快速檢測(cè)儀（immune colloidal goldquantitative TSHanalysis system）可以檢測(cè)受試者手指全血的促甲狀腺素（TSH）水平，該方法可定性及量化TSH檢測(cè)值，操作簡(jiǎn)便，15min即可獲取檢測(cè)結(jié)果。目前該檢測(cè)方法主要用于篩查臨床及亞臨床甲狀腺功能減退癥［1］。免疫膠體金法定量TSH快速檢測(cè)屬于即時(shí)檢測(cè)（point-of-care testing，POCT），即是利用便攜式裝備直接在最接近患者居住地完成標(biāo)本采集、檢測(cè)和結(jié)果報(bào)告等整個(gè)流程的檢驗(yàn)。本研究擬參考美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（CLSI）發(fā)表的EP15-A2文件《用戶(hù)對(duì)精密度和準(zhǔn)確度性能的核實(shí)試驗(yàn)-批準(zhǔn)指南》和中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)發(fā)布的《GB/T29790-2013即時(shí)檢測(cè)質(zhì)量和能力的要求》文件［2-3］的相關(guān)要求驗(yàn)證該檢測(cè)方法的精密度，同時(shí)比較二臺(tái)檢測(cè)儀器間是否存在明顯的檢測(cè)值差異。由于預(yù)試驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)采用靜脈抗凝全血的穩(wěn)定性差，本研究只能采用質(zhì)控品和患者的血清代替全血進(jìn)行檢測(cè)性能驗(yàn)證。

材料和方法

1 材料

（1）質(zhì)控品樣本：檢測(cè)試劑廠家（天津新灣生物科技有限公司）提供了3種濃度TSH質(zhì)控品A、B、C，分別為2.51μIU/mL、7.63μIU/mL、10.03μIU/mL。

（2）制作TSH血清樣本：收集本院檢驗(yàn)科剛完成檢測(cè)的四個(gè)患者的常規(guī)血清樣品，四個(gè)血清樣TSH 濃度為1.20μIU/mL、3.46μIU/mL、5.02 μIU/mL、11.08μIU/mL。所有收集的樣本均無(wú)溶血及無(wú)脂濁。

2 檢測(cè)方法和儀器

免疫膠體金法定量TSH快速檢測(cè)儀及其配套試劑盒，試劑盒批號(hào)為：1015214；共兩臺(tái)免疫膠體金法定量TSH快速檢測(cè)儀器（檢測(cè)儀器1，編號(hào)：CHR-110R00371和檢測(cè)儀器 2，編號(hào)：CHR-110R00062）。均由天津新灣生物科技有限公司提供。

3 免疫膠體金法定量TSH快速檢測(cè)儀檢測(cè)TSH原理

免疫膠體金法定量TSH快速檢測(cè)儀由PILOT-110R分析儀、測(cè)試板、智能卡（RFID Tag）、數(shù)據(jù)管理軟件（版本號(hào)：V1.1.0x）、緩沖液組成。其中測(cè)試板以硝酸纖維膜作為固相載體，分別在檢測(cè)區(qū)和質(zhì)控區(qū)劃線包被膠體金標(biāo)記的TSH抗體和質(zhì)控品，當(dāng)待測(cè)樣品滴入加樣孔后，血清中的TSH與包被在聚酯膜上的膠體金標(biāo)記的抗體結(jié)合，結(jié)合物隨之在毛細(xì)效應(yīng)下橫向?qū)游?。?dāng)血清中含有 TSH抗原時(shí)，泳動(dòng)到檢測(cè)區(qū)時(shí)被TSH抗體捕獲，形成免疫復(fù)合物，膠體金富集在檢測(cè)線處形成一條可見(jiàn)的紫紅色線。若樣本中不含TSH抗原，則檢測(cè)線處不發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)，膠體金標(biāo)記物繼續(xù)層析向前與包被于質(zhì)控線處質(zhì)控抗體結(jié)合而形成陽(yáng)性條帶，多余的膠體金標(biāo)記物繼續(xù)層析到吸水墊上。測(cè)試板的檢測(cè)結(jié)果由PILOT-110R分析儀、智能卡和數(shù)據(jù)管理軟件分析并經(jīng)校正后得出最終結(jié)果。該方法的TSH檢測(cè)范圍為0.08～20.00μIU/mL。

4 驗(yàn)證內(nèi)容

參考美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（CLSI）發(fā)表的EP15-A2文件《用戶(hù)對(duì)精密度和準(zhǔn)確度性能的核實(shí)試驗(yàn)-批準(zhǔn)指南》和POCT文件相關(guān)要求驗(yàn)證該檢測(cè)方法的精密度性能，同時(shí)比較二臺(tái)檢測(cè)儀器間是否存在明顯的檢測(cè)值差異。

5 驗(yàn)證方法

5.1 建立室內(nèi)質(zhì)控圖 本研究應(yīng)用Levey-Jennings控制圖（L-J控制圖）［4］來(lái)建立室內(nèi)質(zhì)控。繪制Levey-Jennings控制圖時(shí)，首先要建立基線數(shù)據(jù)。臨床常規(guī)選擇低濃度和高濃度的質(zhì)控品做質(zhì)量控制，故分別對(duì)低濃度質(zhì)控A和高濃度質(zhì)控C連續(xù)測(cè)定20次，獲得一組數(shù)據(jù)，計(jì)算均值x和標(biāo)準(zhǔn)差s，定出質(zhì)控限（TSH質(zhì)控品檢測(cè)結(jié)果均值的上下各兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差的范圍，即x±2s），作為本研究的室內(nèi)質(zhì)量控制的基線。若試驗(yàn)日質(zhì)控結(jié)果超出質(zhì)控限，需再重新測(cè)定樣本。

5.2 精密度 本研究中，用于驗(yàn)證的試劑盒批號(hào)沒(méi)有更換。分別將TSH血清樣本（濃度分別為①1.20μIU/mL、②3.46μIU/mL、③5.02μIU/mL、④11.08μIU/mL）和質(zhì)控品樣本（A.2.51μIU/mL、B. 7.63μIU/mL、C.10.03μIU/mL）按照CLSI EP15-A2標(biāo)準(zhǔn)［2］，連續(xù)5 d實(shí)驗(yàn)，每天做一批，每批4次重復(fù)測(cè)定，計(jì)算重復(fù)性（Sr）和中間精密度（SI）。計(jì)算公式為其中D是總天數(shù)，n是每日重復(fù)次數(shù)，Xdi是第d天i次重復(fù)結(jié)果，x-d是第d天所有結(jié)果的均值，Sb2是 x-d與總體均數(shù)之差的平方和。并檢驗(yàn)所得數(shù)據(jù)是否存在離群值。

5.3 免疫膠體金法定量TSH快速檢測(cè)儀兩臺(tái)檢測(cè)儀器間的對(duì)比 收集33份不同濃度的TSH血清標(biāo)本，同一份血清標(biāo)本，分別用檢測(cè)儀器1和檢測(cè)儀器2進(jìn)行分析判讀結(jié)果。分析兩臺(tái)檢測(cè)儀器的檢測(cè)值之間是否存在差異。

6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均用Microsoft Excel2013記錄并處理；用SPSS 16.0檢驗(yàn)數(shù)據(jù)是否有離群值。

結(jié) 果

1 室內(nèi)質(zhì)控結(jié)果

經(jīng)計(jì)算，Levey-Jennings控制圖低、高濃度 x±2s的范圍分別為（1.37，2.89）μIU/mL和（7.92，12.84）μIU/mL。試驗(yàn)日的低濃度質(zhì)控A和高濃度質(zhì)控C質(zhì)控結(jié)果均沒(méi)有超過(guò)質(zhì)控圖的x±2s的范圍，即質(zhì)控結(jié)果在可控范圍內(nèi)，說(shuō)明試驗(yàn)日的驗(yàn)證數(shù)據(jù)可靠。見(jiàn)圖1。

2 精密度驗(yàn)證結(jié)果

2.1 數(shù)據(jù)離群值檢驗(yàn)結(jié)果 分別對(duì)7份樣本5d的數(shù)據(jù)結(jié)果用箱式圖進(jìn)行離群值檢驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖2。其中，樣本C有一個(gè)疑似離群值（圖2中所示的圓圈），根據(jù)拉依達(dá)法判斷［5］，該離群值與該組數(shù)據(jù)平均值之差的絕對(duì)值小于3倍的標(biāo)準(zhǔn)差（Sr），則不可以認(rèn)為該離群值為異常值，應(yīng)予保留。

經(jīng)對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算，患者血清樣本中，TSH濃度對(duì)應(yīng)的批內(nèi)CV以及中間精密度CV；質(zhì)控品樣本中，TSH濃度對(duì)應(yīng)的批內(nèi)CV以及中間精密度CV。見(jiàn)表1。Microsoft Excel2013移動(dòng)平均值分析顯示隨著TSH濃度的升高，批內(nèi)CV值和中間精密度CV均降低。見(jiàn)圖3。

表1 TSH測(cè)定的精密度

2.3 二臺(tái)免疫膠體金法定量TSH快速檢測(cè)儀間的結(jié)果對(duì)比

檢測(cè)儀器1和檢測(cè)儀器2檢測(cè)TSH結(jié)果的相關(guān)系數(shù)r為0.968，相關(guān)性好，兩者差異無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.01）。但是，在TSH低于5.00μIU/mL時(shí)，有5個(gè)點(diǎn)波動(dòng)比較大（見(jiàn)圖4中遠(yuǎn)離直線的5個(gè)點(diǎn)），說(shuō)明在低TSH濃度時(shí)，兩臺(tái)檢測(cè)儀器得出的結(jié)果是存在一定偏差的，這可能是因?yàn)樵赥SH濃度水平偏低時(shí)其CV比較大。

討 論

本研究中的免疫膠體金法定量TSH快速檢測(cè)儀是由天津新灣生物科技有限公司生產(chǎn)用于臨床上篩查甲狀腺功能減退癥的儀器。本研究小組前期做了對(duì)該檢測(cè)方法的臨床實(shí)用性評(píng)估的研究工作［1］。

免疫膠體金法用于免疫檢測(cè)中，具有以下優(yōu)點(diǎn)：試劑和樣本量少；不需γ-計(jì)數(shù)器、熒光顯微鏡、酶標(biāo)檢測(cè)儀等貴重儀器，更適合現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用；沒(méi)有諸如放射性同位素、鄰苯二胺等有害物質(zhì)污染環(huán)境；實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以長(zhǎng)期保存；檢測(cè)時(shí)間大大縮短，提高了檢測(cè)速度。盡管膠體金法存在著上述優(yōu)點(diǎn)，但由于技術(shù)限制造成它的檢測(cè)靈敏度低，因此本研究沒(méi)有驗(yàn)證該方法的檢測(cè)靈敏度。因?yàn)樵摲椒ㄊ侨獪y(cè)量，全血的TSH標(biāo)準(zhǔn)非常難以建立，因此我們簡(jiǎn)化以精密度進(jìn)行驗(yàn)證，沒(méi)有評(píng)估其準(zhǔn)確度。

為了探討其精密度性能是否符合臨床應(yīng)用的要求，參考CLSIEP15-A2文件和POCT文件的相關(guān)要求驗(yàn)證免疫膠體金法定量TSH快速檢測(cè)儀的精密度性能，同時(shí)對(duì)免疫膠體金法定量TSH快速檢測(cè)儀進(jìn)行了檢測(cè)儀器間對(duì)比。

該檢測(cè)方法實(shí)際臨床應(yīng)用中，測(cè)定TSH的樣本是采集的受試者指尖血即全血檢測(cè)，在驗(yàn)證該檢測(cè)方法精密度性能時(shí)，取全血樣本不便且不易儲(chǔ)存、影響全血穩(wěn)定性的因素較多，故本研究采用血清樣本及質(zhì)控品來(lái)驗(yàn)證其精密度，對(duì)驗(yàn)證該檢測(cè)方法的穩(wěn)定性影響不大?？紤]到正常參考區(qū)間上下限左右處以及醫(yī)學(xué)決定水平處的精密度性能，本研究選擇7個(gè)濃度水平進(jìn)行評(píng)價(jià)，包括了該檢測(cè)方法示值范圍的濃度和醫(yī)學(xué)決定水平處的濃度?？紤]到基質(zhì)效應(yīng)及樣本穩(wěn)定性，同時(shí)檢測(cè)了新鮮患者標(biāo)本與質(zhì)控標(biāo)本。

通過(guò)建立室內(nèi)質(zhì)控，確保驗(yàn)證結(jié)果可靠。通過(guò)精密度驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，該方法在不同的TSH濃度范圍內(nèi)，其精密度性能有波動(dòng)，呈負(fù)相關(guān)性變化，在TSH低濃度水平時(shí)重復(fù)性和中間精密度變異比較大，在中高濃度時(shí)性能良好。圖2可以看到，隨著TSH濃度的升高，批內(nèi)精密度和中間精密度逐漸降低，尤其當(dāng)TSH濃度超過(guò)10.00μIU/mL時(shí)，批內(nèi)CV和中間CV均明顯的降低。臨床上當(dāng)TSH超過(guò) 10.00μIU/mL同時(shí)伴有FT3和FT4升高［6］，診斷為臨床甲狀腺功能減退癥。根據(jù)TSH濃度與精密度的關(guān)系可以推斷，該方法應(yīng)用于臨床篩查甲狀腺功能減退癥時(shí)，當(dāng)受另外，CLSIEP文件是目前最為規(guī)范的檢驗(yàn)方法或檢測(cè)系統(tǒng)分析性能評(píng)價(jià)工具，涉及精密度的有EP5-A2，EP10-A2和EP15-A2［7］。其中EP15-A2是針對(duì)臨床實(shí)驗(yàn)室而設(shè)計(jì)，試驗(yàn)和統(tǒng)計(jì)過(guò)程均較簡(jiǎn)單，主要用于驗(yàn)證確認(rèn)檢驗(yàn)方法或檢測(cè)系統(tǒng)的精密度性能。應(yīng)用EP15-A2文件評(píng)價(jià)其精密度性能簡(jiǎn)便實(shí)用，在滿足質(zhì)量管理要求的同時(shí)，費(fèi)用也較低廉。

檢者全血中TSH濃度處于低濃度水平時(shí)，因該檢測(cè)法在低濃度時(shí)性能不夠穩(wěn)定，需謹(jǐn)慎對(duì)待檢測(cè)結(jié)果，不可以此來(lái)判斷受檢者的TSH水平；當(dāng)受檢者全血中TSH在正常值上限和10.00μIU/mL之間時(shí)，檢測(cè)結(jié)果比較穩(wěn)定，可以建議受檢者去專(zhuān)科醫(yī)院進(jìn)行甲狀腺功能的檢查；當(dāng)受檢者全血中TSH值在10.00μIU/mL以上時(shí)，檢測(cè)結(jié)果是比較可靠的，特別當(dāng)受檢者有畏寒、乏力、手足腫脹感、嗜睡、記憶力減退、少汗、關(guān)節(jié)疼痛、體重增加、便秘、女性有月經(jīng)紊亂或者月經(jīng)過(guò)多、不孕等典型臨床甲減的癥狀和體征時(shí)，要建議其去專(zhuān)科醫(yī)院進(jìn)行詳細(xì)的甲狀腺功能檢查。因此，該方法在篩查臨床甲狀腺功能減退癥中結(jié)果是可以接受的。免疫膠體金定量TSH快速檢測(cè)儀二臺(tái)檢測(cè)儀器（檢測(cè)儀器1和檢測(cè)儀器2）的檢測(cè)結(jié)果無(wú)顯著差異，說(shuō)明，該方法在同一檢測(cè)系統(tǒng)不同檢測(cè)儀器檢測(cè)結(jié)果是可靠的，符合POCT產(chǎn)品的臨床應(yīng)用要求。

免疫膠體金法定量TSH快速檢測(cè)儀應(yīng)用于臨床上篩查甲狀腺功能減退癥時(shí)在低TSH濃度水平的檢測(cè)結(jié)果需要謹(jǐn)慎對(duì)待，在高TSH濃度水平，尤其大于10.00μIU/mL且有臨床癥狀和體征的臨床甲狀腺功能減退癥的人群時(shí)，結(jié)果是可靠的。同時(shí)，使用者需了解該方法的特點(diǎn)及優(yōu)缺點(diǎn)，結(jié)合其他臨床檢查及方法做到合理應(yīng)用。

［1］Wang T T，Lu H K，Ruan M F.Evaluation on clinical utility of immune colloidal gold method for rapid qualitative and quantitative test of thyroid stimulating hormone.Abstract presented at the 11thAsia Oceania Thyroid Association Congress（AOTA），Kochi Kerala India，September 25-28，2014.61.

［2］Clinical and Laboratory Standards Institute.User demonstration of performance for precision and accuracy EP15-A2.Wayne，USA. CLSI，2004.

［3］GB/T29790-2013.即時(shí)檢測(cè)質(zhì)量和能力的要求.北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2014.

［4］Levey S，Jennings E R.The use of control charts in the clinical laboratory.Am JClin Pathol，1950，20：1059-1066.

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［7］楊有業(yè)，張秀明.臨床檢驗(yàn)方法學(xué)評(píng)價(jià).北京：人民衛(wèi)生出版社，2008.126.

（潘子昂編輯）

Performance Assessment of Quantitative Thyroid Stimulating Hormone by Immune Colloidal Gold Assay

WANG Ting-ting，SHAN Feng-ling，LU Han-kui
（Department of Nuclear Medicine，Sixth People's Hospital Affiliated Shanghai Jiaotong University，Shanghai200233，China）

Objective Immune colloidal gold（ICG）assay has been applied for detecting of thyroid stimulating hormone（TSH）using finger blood.The aim of the study is to evaluate the precision and manufacture error between different instruments on ICG quantitative TSH analysis.M ethods Seven TSH samples w ith different concentration were chosen for the study.Each samplewas tested 4 times intraassay every day and lasted for 5 days.The intraassay and intermediate CV（%）were calculated.In addition，33 blood samples w ith different TSH concentrationswere tested by two ICG instruments to check their differences.Results The intraassay and intermediate CV（%）were 30.00%，17.84%，6.50%，15.00%，13.92%，10.62%，9.62%and 29.23%，20.19%，18.15%，16.60%，15.34%，10.42%，8.76%for TSH samples w ith concentration 1.20，2.51，3.46，5.02，7.63，10.03，11.08μIU/m L，respectively.Between two ICG instruments，the correlation coefficientwas 0.968 and there was no significant difference.Conclusion The precision performance of ICG TSH assay was less stable at low TSH concentration；when TSH≥10.00μIU/m L the precision performance was satisfactory.No difference was found between two ICG TSH instruments.

Precision； Thyroid stimulating hormone； Immune colloidal gold

10.11748/bjm y.issn.1006-1703.2016.05.026

2015-07-21；

2015-08-21