TWS119對(duì)人NK細(xì)胞增殖和殺傷甲狀腺癌BCPAP細(xì)胞的影響

王 海，鄭 璐，湯新星，陳永強(qiáng)，周忠海，陳復(fù)興

（1.江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，江蘇鎮(zhèn)江212002；2.中國(guó)人民解放軍第九七醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，江蘇徐州221004）

TWS119對(duì)人NK細(xì)胞增殖和殺傷甲狀腺癌BCPAP細(xì)胞的影響

王 海1，鄭 璐2，湯新星1，陳永強(qiáng)2，周忠海2，陳復(fù)興2

（1.江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，江蘇鎮(zhèn)江212002；2.中國(guó)人民解放軍第九七醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，江蘇徐州221004）

目的 探討糖原合酶激酶-3β抑制劑TWS119對(duì)NK細(xì)胞增殖和殺傷功能的影響。方法 從健康人外周血中分離單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs），加入到NK完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，分別于第1d和第7d時(shí)，加入TWS119（0～8.0μmol/L）誘導(dǎo)培養(yǎng)。培養(yǎng)10 d后，用CCK-8法測(cè)定NK細(xì)胞增殖和殺傷甲狀腺癌BCPAP細(xì)胞的能力；采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組NK細(xì)胞純度、顆粒酶和穿孔素的表達(dá)。結(jié)果 培養(yǎng)10d后，第1天加入TWS119誘導(dǎo)組對(duì)NK細(xì)胞純度和增殖呈現(xiàn)抑制作用；而第7天加入在一定濃度范圍的TWS119誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)能促進(jìn)NK細(xì)胞的增殖和殺傷指標(biāo)穿孔素的表達(dá)及對(duì)甲狀腺癌BCPAP細(xì)胞的體外殺傷活性。結(jié)論 TWS119在一定濃度范圍能促進(jìn)γδT細(xì)胞增殖和增強(qiáng)對(duì)甲狀腺癌BCPAP細(xì)胞的殺傷功能。

NK細(xì)胞； TWS119； 細(xì)胞增殖； BCPAP細(xì)胞； 穿孔素

甲狀腺癌是內(nèi)分泌系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤，但近年來(lái)其發(fā)病率逐年走高，特別是乳頭狀細(xì)胞癌，臨床可占總病例的60%～70%左右［1］。目前常見(jiàn)的治療方法包括手術(shù)結(jié)合放射碘治療和甲狀腺激素抑制治療，但是這些治療方法易產(chǎn)生并發(fā)癥和抗性的問(wèn)題。近年來(lái)腫瘤細(xì)胞免疫治療成為繼手術(shù)、放療、化療之后第四類(lèi)已被證明具有顯著臨床治療效果及優(yōu)勢(shì)的治療腫瘤的方法。而自然殺傷（natural killer，NK）細(xì)胞在機(jī)體中參與抗病毒、病原微生物和腫瘤的免疫，是機(jī)體先天性免疫的第一道天然防線(xiàn)［2］?；谄湓隗w內(nèi)通過(guò)非MHC限制性方式識(shí)別腫瘤細(xì)胞并對(duì)其進(jìn)行殺傷；另外還通過(guò)分泌多種細(xì)胞因子及趨化因子，對(duì)其他免疫細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)功能進(jìn)行調(diào)節(jié)。因此，近些年來(lái)NK細(xì)胞受到越來(lái)越多研究者的重視，并逐漸應(yīng)用于臨床腫瘤的治療［3-4］。但由于NK細(xì)胞在外周血中僅占淋巴細(xì)胞總數(shù)的5%～10%，臨床療效受限于臨床回輸NK細(xì)胞的數(shù)量。為了建立人外周血NK細(xì)胞的有效擴(kuò)增方法，獲得足夠數(shù)量的NK細(xì)胞以滿(mǎn)足臨床治療的需要，體外提高NK增殖率和殺功能是十分重要的。因此，本研究用不同劑量的TWS119不同的體外誘導(dǎo)方式培養(yǎng)NK細(xì)胞后，觀察其對(duì)NK細(xì)胞增殖和殺傷甲狀腺癌BCPAP細(xì)胞活性的影響。

材料與方法

1 材料

NK細(xì)胞培養(yǎng)基CellGro? GMP SCGM購(gòu)自德國(guó)Cell Gro公司；RPMI 1640培養(yǎng)基和小牛血清均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；重組人白介素-2（rhIL-2）為北京四環(huán)生物制藥有限公司產(chǎn)品；TWS119購(gòu)自sigma公司；人淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自天津?yàn)笊镏破房萍加邢挢?zé)任公司；CCK-8試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；熒光抗體PerCP-cy5.5-CD3、FITC-CD56、PE-Perforin和PE-Granzyme B和流式細(xì)胞儀均為美國(guó)Becton Dickson公司；人AB型血漿購(gòu)自徐州市中心血站。

2 方法

2.1 NK細(xì)胞的培養(yǎng) 抽取健康人外周血20mL用肝素抗凝，將血緩慢加入淋巴細(xì)胞分離液中后，用1800r/min離心10min，用移液槍輕輕吸取單個(gè)核細(xì)胞層于裝有生理鹽水的離心瓶中1800r/min離心15min進(jìn)行洗滌2次。將洗滌后的細(xì)胞加入裝有NK培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，再根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況及時(shí)添加NK培養(yǎng)基。

2.2 NK細(xì)胞鑒定 將在體外NK培養(yǎng)基中培養(yǎng)10d的NK細(xì)胞置于倒置顯微鏡下進(jìn)行形態(tài)觀察，并用PerCP-cy5.5-CD3和 FITC-CD56抗體標(biāo)記NK細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞儀進(jìn)行表型檢測(cè)。

2.3 TWS119對(duì)NK細(xì)胞和BCPAP細(xì)胞增殖的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期甲狀腺癌BCPAP細(xì)胞，用胰酶消化液消化后制成細(xì)胞懸液接種于96孔板，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中過(guò)夜，使細(xì)胞貼壁。將NK細(xì)胞密度調(diào)整至1.0×105/mL，用移液器吸取180μL接種于96孔板中，每孔再加入不同濃度的TWS119（終濃度分別為0、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0μmol/L），每組設(shè)置4個(gè)復(fù)孔。于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后，每孔加入20μL的CCK-8檢測(cè)液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后于450 nm處測(cè)定光密度值。

2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)NK細(xì)胞上顆粒酶和穿孔素的表達(dá) 將培養(yǎng)獲得的NK細(xì)胞配成濃度為1.0× 105/mL的細(xì)胞懸液，接種于6孔培養(yǎng)板，每孔加3mL，然后加入TWS119（終濃度分別為0、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0μmol/L），每組做 3個(gè)重復(fù)孔。于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。收集細(xì)胞并用PBS洗滌2次，每管加入PerCP-cy5.5-CD3和FITCCD56 NK細(xì)胞標(biāo)記抗體20μL，避光孵育15min，加入固定液100μL室溫避光孵育15min固定細(xì)胞后用PBS洗滌1次。每管再加100μL破膜液進(jìn)行破膜，10μL的PE-Perforin和PE-Granzyme B抗體，室溫避光孵育15min后用PBS洗滌后重懸于0.5 mL的PBS溶液中，分別用流式細(xì)胞儀檢測(cè)NK細(xì)胞中顆粒酶B和穿孔素的表達(dá)情況，結(jié)果采用FlowJo7.6.1軟件進(jìn)行分析。

2.5 TWS119作用NK細(xì)胞后對(duì)甲狀腺癌BCPAP細(xì)胞殺傷活性 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BCPAP細(xì)胞接種于96孔板中作為靶細(xì)胞，接種密度為5× 103/孔，以TWS119處理72h后的NK細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，以10：1的效靶比加入，總體積為200μL/孔，同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照組、靶細(xì)胞對(duì)照組和效應(yīng)細(xì)胞對(duì)照組，每組做4個(gè)重復(fù)孔。培養(yǎng)24h后，每孔加入CCK-8液20μl再繼續(xù)孵育4 h，用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)每孔的OD值，計(jì)算殺傷活性：

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，數(shù)據(jù)以x±s表示，組間采用單因素方差分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 NK細(xì)胞鑒定

將分離獲得單個(gè)核細(xì)胞用NK細(xì)胞培養(yǎng)液于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3天后NK細(xì)胞開(kāi)始增殖，呈集落式生長(zhǎng)，到10天后出現(xiàn)許多大小不同的細(xì)胞集落，細(xì)胞成橢圓形或梭形。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)NK細(xì)胞比率顯示，在第1天加入TWS119進(jìn)行誘導(dǎo)，CD3-CD56+的NK細(xì)胞比率隨濃度增加逐漸降低，而在第7天加入 TWS119進(jìn)行誘導(dǎo)時(shí)，NK細(xì)胞比率從（64.35±3.29）%升高到（67.35±2.75）%，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖1）。

2 TWS119對(duì)NK細(xì)胞和BCPAP細(xì)胞增殖的影響

在第7天時(shí)加入不同濃度的TWS119（0、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0μmol/L）作用 NK細(xì)胞后，如圖3所示各濃度組對(duì)其增殖率分別為：（100±2.49）%、（115.57±2.53）%、（131.87±3.19）%、（140.89± 3.12）%、（105.43±3.67）%、（86.38±3.58）%，與0μg/mL對(duì)照組相比，0-2.0μmol/L組增殖率顯著高于對(duì)照組（*P＜0.05，**P＜0.01），其中TWS119濃度在2.0μmol/L時(shí)增殖率達(dá)到最高值，濃度超過(guò)2.0μmol/L時(shí)增殖率逐漸下降。而在第1天時(shí)加入TWS119作用NK細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞增值率隨TWS119濃度的增加逐漸降低（**P＜0.01）（表1和圖2A）。

而TWS119對(duì)甲狀腺癌BCPAP細(xì)胞增殖影響檢測(cè)結(jié)果顯示，經(jīng)不同濃度的TWS119 BCPAP細(xì)胞72h后，隨著TWS119濃度的增加，對(duì)BCPAP細(xì)胞增殖抑制作用越明顯（P＜0.05，P＜0.01）（表1和圖2B）。

3 TWS119對(duì)NK細(xì)胞中顆粒酶、穿孔素表達(dá)的影響

TWS119與NK細(xì)胞共同培養(yǎng)72h后，F(xiàn)CM檢測(cè)結(jié)果如圖3顯示，隨TWS119濃度增加，NK細(xì)胞穿孔素的陽(yáng)性表達(dá)率逐漸升高，從對(duì)照組的（73.64±3.04）%升高到（93.02±2.17）%；而顆粒酶B的陽(yáng)性表達(dá)率變化不明顯（表2和圖3）。

表2 TWS119誘導(dǎo)NK細(xì)胞72h后對(duì)顆粒酶B和穿孔素表達(dá)的影響

4 TWS119對(duì)NK細(xì)胞殺傷甲狀腺癌BCPAP細(xì)胞活性的影響

γδT細(xì)胞經(jīng)TWS119誘導(dǎo)72 h后的，在效靶比為10：1時(shí)對(duì)甲狀腺癌BCPAP細(xì)胞的殺傷率分別為：（34.62±3.02）%、（40.37±3.81）%、（51.98± 3.09）%、（55.21±4.69）%和（58.81±2.32）%。與對(duì)照組（30.54±2.89）%相比，隨著作用γδT細(xì)胞的TWS119濃度增加，γδT細(xì)胞殺傷BCPAP細(xì)胞活性增強(qiáng)（表3和圖4）。其殺傷結(jié)果與穿孔素表達(dá)結(jié)果相一致，提示TWS119殺傷甲狀腺癌BCPAP細(xì)胞的的機(jī)制可能是通過(guò)提高穿孔素的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

表3 TWS119處理48h后的NK細(xì)胞對(duì)甲狀腺癌BCPAP細(xì)胞殺傷效應(yīng)

討 論

Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在胸腺細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育和T淋巴細(xì)胞的遷移中起著重要的作用［5-6］。4，6-二取代吡咯并嘧啶（TWS119）是糖原合酶激酶-3β（Glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）抑制劑，研究人員發(fā)現(xiàn)TWS119通過(guò)激活CD8+T淋巴細(xì)胞Wnt/β-catenin信號(hào)通路獲得干細(xì)胞樣記憶細(xì)胞（Stem cellsmemory T cells，TSCM）和早期分化T細(xì)胞，這群細(xì)胞在體內(nèi)具有強(qiáng)增殖能力和抗腫瘤活性［7-9］。陳永強(qiáng)等［10］研究發(fā)現(xiàn)TWS119體外可以促進(jìn)γδT細(xì)胞增殖和CD62L和CD45RA的表達(dá)。然而，TWS119對(duì)體外誘導(dǎo)培養(yǎng)的NK細(xì)胞的純度、增殖及殺傷甲狀腺癌BCPAP細(xì)胞活性的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在第1天加入TWS119進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)，對(duì)NK細(xì)胞的增殖及純度呈抑制作用，而在第7天加入TWS119進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)，濃度在0.5～2μmol/L范圍時(shí)能促進(jìn)γδT細(xì)胞的增殖。提示TWS119對(duì)NK細(xì)胞的增殖有一定程度的促進(jìn)作用，這可能對(duì)于體外培養(yǎng)獲得足量的NK細(xì)胞用于腫瘤的免疫治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

NK細(xì)胞是一群細(xì)胞表面標(biāo)記為CD3-CD56+的淋巴細(xì)胞，在機(jī)體中通過(guò)MHC非限制性方式對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行識(shí)別，然后再通過(guò)釋放穿孔素、顆粒酶B和Fas/FasL等方式進(jìn)行殺傷。穿孔素是表達(dá)于T淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中的細(xì)胞毒顆粒，當(dāng)這些免疫細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞接觸后，釋放出穿孔素并在腫瘤細(xì)胞膜上形成管狀通道，使腫瘤細(xì)胞內(nèi)外通透導(dǎo)致靶細(xì)胞溶解破壞［11］。而顆粒酶B則是T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞中重要的絲氨酸蛋白酶，其通過(guò) caspases依賴(lài)和非依賴(lài)途徑殺傷靶細(xì)胞［12］。本研究流式檢測(cè)結(jié)果顯示，TWS119作用NK細(xì)胞后，穿孔素的陽(yáng)性表達(dá)率較對(duì)照組明顯升高，且具有一定的劑量依賴(lài)性，而顆粒酶的表達(dá)變化不明顯；另外體外殺傷實(shí)驗(yàn)顯示，經(jīng)TWS119作用的NK細(xì)胞對(duì)甲狀腺癌BCPAP細(xì)胞的殺傷顯著升高，與穿孔素的檢測(cè)結(jié)果相一致，提示TWS119殺傷甲狀腺癌BCPAP細(xì)胞的的機(jī)制可能是通過(guò)提高穿孔素的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

本研究結(jié)論是TWS119在一定濃度范圍內(nèi)能促進(jìn)NK細(xì)胞的增殖和增強(qiáng)對(duì)甲狀腺癌BCPAP細(xì)胞的殺傷功能。我們研究結(jié)果為進(jìn)一步提高NK細(xì)胞治療甲狀腺癌提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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（李 凌編輯）

Effects of TWS119 on Human NK Cells Grow th and K illing Function

WANG Hai，ZHENG Lu，TANG Xin-xing，CHEN Yong-qiang，ZHOU Zhong-hai，CHEN Fu-xing
（Department of Nuclear Medicine，the Affiliated People Hospital of Jiangsu University，Zhenjiang 212002，China）

Objective To investigate the effects of 4，6-disubstituted pyrrolopyrim idine（TWS119），a glycogen synthase kinase-3β（GSK-3β）inhibitor on human NK cells grow th and killing function.M ethods Using SCGM medium to cultivate human peripheral blood NK cells in vitro.Different concentrations of TWS119 were added in the culture at day one and day 7，proliferation rates and killing activities of NK cells in each group were determ ined by CCK-8 and flow cytometry.Results After 10 days of culture，TWS119 inhibited the grow th ratio of NK cells in day one group.In day 7 group，TWS119 could promote the grow th of NK cells when the concentration was increased from 0 to 2.0μmol/L and decreased thereafter.In addition，TWS119 at0.5-8.0μmol/L could increase the expression of perforin and enhance the cytotoxic activity of NK cells to BCPAP cells.Conclusion TWS119 could promote the proliferation of NK cells and enhance the cytotoxic activity of NK cells to BCPAP cells.

NK cells； TWS119； BCPAP cells； Perforin； Cells grow th

10.11748/bjm y.issn.1006-1703.2016.05.025

2016-02-15；

2016-03-28