有機無機肥配施提升冷浸田土壤氮轉(zhuǎn)化相關(guān)微生物豐度和水稻產(chǎn)量

解開治，徐培智，蔣瑞萍，盧鈺升，顧文杰，李文英，李　夏，孫麗麗

（廣東省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所，農(nóng)業(yè)部南方植物營養(yǎng)與肥料重點實驗室，廣東省養(yǎng)分資源循環(huán)利用與耕地保育重點實驗室，廣東廣州 510640）

有機無機肥配施提升冷浸田土壤氮轉(zhuǎn)化相關(guān)微生物豐度和水稻產(chǎn)量

解開治，徐培智*，蔣瑞萍，盧鈺升，顧文杰，李文英，李夏，孫麗麗

（廣東省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所，農(nóng)業(yè)部南方植物營養(yǎng)與肥料重點實驗室，廣東省養(yǎng)分資源循環(huán)利用與耕地保育重點實驗室，廣東廣州 510640）

【目的】以南方典型冷浸田為對象，研究化肥配施不同有機肥對冷浸田水稻產(chǎn)量以及土壤氮相關(guān)功能微生物群落豐度的影響，旨在為冷浸田土壤氮素活化和轉(zhuǎn)化過程的定向調(diào)控，氮素利用效率提高及水稻高產(chǎn)施肥提供科學依據(jù)?！痉椒ā客ㄟ^連續(xù) 3年6 季的定位試驗，采用土壤理化分析、酶學分析和熒光實時定量 PCR技術(shù)深入探討化肥配施不同堆肥原料有機肥對冷浸田養(yǎng)分活化、水稻產(chǎn)量提升及土壤氮相關(guān)功能微生物群落豐度的效應。本試驗設 4 個處理，分別為單施化肥（CK）、化肥配施豬糞（PIM）、化肥配施牛糞（CAM）、化肥配施雞糞（CHM）?！窘Y(jié)果】CHM、CAM 處理水稻產(chǎn)量顯著高于化肥處理（P＜0.05），較 CK 平均增產(chǎn) 10.23%、7.62%。連續(xù)施用 CHM、CAM 顯著提高了土壤 pH，增加了土壤有機碳、全氮和銨態(tài)氮含量。三種堆肥原料的有機無機配施均能夠提高土壤氮素循環(huán)相關(guān)功能微生物基因豐度，其中細菌、古細菌總?cè)郝?16s rDNA 豐度和氨氧化古菌（AOA）和氨氧化細菌（AOB）的氨單加氧酶（amoA）基因豐度提高趨勢一致，以 CHM 處理最高，但細菌總?cè)郝?16s rDNA 豐度增幅較小。亞硝酸鹽還原酶（nirK、nirS）基因和一氧化二氮還原酶（nosZ）基因豐度對不同處理的響應并不一致。相關(guān)性分析表明，土壤有機碳和全氮含量是影響 AOA、AOB、nirK、nirS 型反硝化細菌的重要因子。【結(jié)論】化肥配施雞糞有機肥能顯著提高冷浸田土壤銨態(tài)氮、速效磷含量，增加細菌、古菌、AOA 和 AOB 氨單加氧酶（amoA）的基因豐度，增強土壤脲酶、蛋白酶和磷酸酶的活性，提升冷浸田土壤生產(chǎn)力。

堆肥；冷浸田；水稻；氮素循環(huán)；功能微生物

氮素在水稻生產(chǎn)中起著重要作用，是水稻產(chǎn)量提升的關(guān)鍵驅(qū)動力。與土壤氮素循環(huán)密切相關(guān)的氨氧化細菌（ammonia oxidizing bacteria，AOB）、氨氧化古菌（ammonia oxidizing archaea，AOA）和反硝化細菌是參與硝化、反硝化過程的重要功能微生物［1］，其群落豐度、種群結(jié)構(gòu)等因素直接調(diào)節(jié)氮素在土壤中的轉(zhuǎn)化［2-5］。這些微生物又與土壤酶關(guān)系密切，它們共同參與土壤氮素轉(zhuǎn)化的整個生物化學過程，進而影響水稻對氮素的吸收利用［1，6-7］。

研究表明，施肥會導致這些重要功能微生物群落結(jié)構(gòu)和豐度的變化［7-9］。但大多研究集中在對稻田土壤 AOA 和 AOB 的群落豐度、種群結(jié)構(gòu)的調(diào)查，及其在土壤氨氧化中的作用。Chen 等［10］研究發(fā)現(xiàn)，AOA 是水稻根際土壤的優(yōu)勢菌。Ying 等［11］、賀紀正等［12］研究發(fā)現(xiàn)，在長期施肥處理下，南方酸性土壤中AOA 的群落豐度顯著高于 AOB，在氨氧化作用中起主導作用，且與土壤硝化潛勢有一定的正相關(guān)性。而在潮土中，長期施肥對 AOB 的影響更顯著，且其數(shù)量與硝化潛力的變化相關(guān)性更高［13］。裴雪霞等［8］采用 PCR-DGGE 方法研究了長期施肥對黃棕壤性水稻土氨氧化細菌遺傳多樣性的影響，結(jié)果表明與不施肥處理相比，長期施肥提高了黃棕壤性水稻土有機質(zhì)、全氮、微生物量碳氮含量，并改變了氨氧化細菌的群落結(jié)構(gòu)；有機肥與化肥長期配施處理氨氧化細菌的多樣性高于化肥處理?，F(xiàn)有研究較少涉及到與反硝化作用密切相關(guān)的亞硝酸鹽還原酶（nirK、nirS）基因和一氧化二氮還原酶（nosZ）基因［14］。而關(guān)于冷浸田中土壤硝化、反硝化過程氮相關(guān)功能微生物群落豐度與環(huán)境因子的關(guān)系，及其與各個氮轉(zhuǎn)化過程的耦合關(guān)系更是未見報道，這嚴重阻礙了人們對冷浸田這一特殊類型的水稻中低產(chǎn)田的氮素轉(zhuǎn)化過程及其機制的全面了解，不利于對冷浸田氮肥的合理調(diào)控。

冷浸田是因長期浸水、土層糊爛與還原作用強烈而造成的一種低產(chǎn)田［15］。全國約有346萬公頃，占全國稻田面積的 15.07%，占低產(chǎn)稻田面積的44.2%，是南方稻區(qū)主要的低產(chǎn)稻田類型之一，每公頃稻谷產(chǎn)量一般不及稻田平均每公頃產(chǎn)量的二分之一［16］。造成冷浸田低產(chǎn)的主要原因是早春水熱條件不良，土壤微生物總體活性偏低，速效養(yǎng)分供應不足等。有機肥含有大量有機質(zhì)和作物生長必需的營養(yǎng)元素，不僅可以提高作物的產(chǎn)量品質(zhì)，還能改善土壤的物理化學性質(zhì)，是一種優(yōu)良的土壤改良劑［17-18］。許多研究表明，長期過量施用氮肥容易造成土壤硝態(tài)氮淋溶損失和氮氧化物溫室氣體的排放［19］，而施用有機肥則有助于維持土壤的氮素供應、微生物的多樣性及活性［20-22］。但不同有機肥堆肥原料性質(zhì)的差異可能導致土壤功能微生物種群豐度及群落結(jié)構(gòu)的不同演替［22-23］。

因此，本研究通過大田定位試驗研究不同原料有機肥配施化肥對冷浸田水稻產(chǎn)量、土壤氮循環(huán)相關(guān)功能微生物豐度的影響，旨在為冷浸田土壤氮素活化、土壤氮素轉(zhuǎn)化過程的定向調(diào)控、氮素利用效率提高及水稻高產(chǎn)施肥提供科學依據(jù)。

1　材料與方法

1.1試驗地概況

試驗于 2011年3月29日～2013年11月22日在廣東省惠陽區(qū)良井鎮(zhèn)前鋒村（N 22°50′09.30″，E 114°36′03.55″）進行，該地區(qū)屬南亞熱帶季風氣候。試驗地屬冷浸田（湖洋田），供試土壤的基本理化性質(zhì)為有機質(zhì) 30.4 g/kg、堿解氮 132.1 mg/kg、速效磷 10.5 mg/kg、速效鉀 34.0 mg/kg、pH 5.1，質(zhì)地為粘土。

1.2試驗設計

試驗設 4 個處理：1）單施化肥（CK）尿素（N 46%）325.5 kg/hm2、過磷酸鈣（P2O512%）375 kg/hm2、氯化鉀（K2O 60%）199.5 kg/hm2；2）化肥配施精制豬糞有機肥（PIM）；3）化肥配施精制牛糞有機肥（CAM）；4）化肥配施精制雞糞有機肥（CHM）。有機肥為分別用豬糞、牛糞、雞糞為主要原材料堆制而成的各種精制有機肥合格產(chǎn)品，各種精制有機肥 N、P、K 含量分別接近于 1.5%、1.0%、1.0%，有機質(zhì) 30%，其他主要性質(zhì)見表1。各有機肥處理（PIM、CAM 和 CHM）中，有機肥施用量均為 3000 kg/hm2，尿素用量 228 kg/hm2，氯化鉀 150 kg/hm2。試驗在施用等量氮磷鉀養(yǎng)分的基礎上進行，各處理均施氮 150 kg/hm2、磷（P2O5）45 kg/hm2、鉀（K2O）120 kg/hm2。每個處理3次重復。小區(qū)長 8.7 m、寬 7.1 m，隨機區(qū)組排列。每個小區(qū)四周起壟，并覆塑料膜，防止肥水竄流，同時四周留出排水溝和保護行。每季水稻施肥均按照上述試驗處理的設計用量施用，所有處理化肥和有機肥均在移栽前 1 天一次性施入。

表1　不同種類有機肥 pH、水溶性有機碳以及功能微生物群落豐度Table 1　pH， water-soluble organic carbon（WSOC）and microbial abundances in different organic fertilizers

試驗所用水稻品種為 ‘黃華占’。移栽行距和株距分別為 20.0 cm、18.0 cm，每公頃27萬穴，田間管理按當?shù)亓晳T進行。

1.3樣品采集

每季水稻成熟收割前，各小區(qū)取 5 株代表性植株樣考查穗粒數(shù)、結(jié)實率和千粒重，各小區(qū)實割測產(chǎn)。連續(xù)試驗至第 6 季水稻收獲前 5 天（2013年11月 8日），采集各處理 0—20 cm 的 5 個代表樣點的土壤（土壤處于水分飽和狀態(tài)），混合后取 1000 g 于冰盒帶回。一部分鮮土保存于 4℃ 冰箱，用于氮素形態(tài)、硝化潛勢和反硝化潛勢的測定；另一部分鮮土保存于-20℃ 冰箱，用于提取土壤 DNA；其余土樣風干后過篩，用于測定土壤理化性質(zhì)。

1.4土壤樣品測定方法

1.4.1土壤分析土壤理化性質(zhì)與養(yǎng)分的測定按照魯如坤［24］的方法進行。土壤酶活性的測定根據(jù)關(guān)松蔭［25］的方法，脲酶采用苯酚鈉比色法，用 1 g 土樣 24 h 生成 NH4+-N 1 mg/（g·d）為 1 個酶活性單位；蛋白酶用茚三酮比色法，以 30℃ 下生成甘氨酸的量 ［mg/（g·d）］為單位；磷酸酶用磷酸苯二鈉法，以 37℃ 下生成酚的量 ［mg/（g·d）］為單位。土壤硝化潛勢根據(jù)修訂的Kurola 方法測定［26］，反硝化潛勢利用乙炔（C2H2）抑制法［27］測定。

1.4.2土壤 DNA 提取采用 NucleoSpin?Soil DNA 試劑盒（Macherey-Nagel GmbH & Co.KG）提取土壤DNA，每 2 mL 管稱取土壤樣品量為 500 mg，操作步驟按照試劑盒操作說明進行。用 0.8% 的瓊脂糖凝膠電泳和核酸蛋白測定儀（Eppendorf， AG， Hamburg，Germany）檢測所提 DNA 片段大小及質(zhì)量。1.4.3熒光實時定量 PCR 分析試驗選取細菌和古菌的 16S rRNA 基因、AOA 和 AOB 的氨單加氧酶（amoA）基因、亞硝酸鹽還原酶（nirK、nirS）基因和一氧化二氮還原酶（nosZ）基因進行定量分析，反應在熒光定量 PCR 儀 ABI PRISM7500（ABI，美國）儀器上分析。細菌 16S rRNA 基因的定量分析采用TaqMan 探針法［26］，反應體系為 25 μL，其中包含SYBR?Premix Ex TaqTM（TaKaRa，日本）12.5 μL，Taqman 探針（3 μmol/L，TaKaRa，日本）0.5 μL，前、后引物（10 μmol/L）各 0.5 μL，DNA 模板 1 μL。其余基因的反應體系均按 SYBR?Premix Ex TaqTM（TaKaRa，日本）說明書操作。質(zhì)粒及標準曲線的制備參照文獻［27］。各基因定量 PCR 分析所用的引物和探針及反應條件見表2。

表2　熒光實時定量 PCR 擴增引物和探針及反應條件Table 2　Primers， probes and reaction procedures of the real-time PCR analysis

1.5數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)應用 SPSS 13.0 軟件進行統(tǒng)計分析。采用單因素方差分析和 Tukey 多重比較法，檢驗各處理間的差異顯著性（P＜0.05）。相關(guān)性分析采用Pearson 相關(guān)分析法進行雙尾檢驗確定顯著性。

2　結(jié)果與分析

2.1不同施肥處理對水稻產(chǎn)量的影響

有機肥配施化肥處理的產(chǎn)量均高于單施化肥處理（圖1）。早、晚稻產(chǎn)量總體以為雞糞有機肥配施化肥（CHM）處理最高。其中，CHM 處理和 CAM 處理產(chǎn)量與單施化肥（CK）處理比較，3年6 季平均增產(chǎn)10.23%、7.62%，達到顯著水平（P＜0.05）。同時，各處理晚稻產(chǎn)量普遍高于早稻產(chǎn)量，可能是由于冷浸田晚稻較好的水熱條件增強了土壤微生物活性，促進了氮、磷等養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化，提高了水稻對養(yǎng)分的可利用性（表3）。

圖1　不同施肥處理對水稻產(chǎn)量的影響Fig.1　Grain yields in responding to the fertilizer treatments

表3　不同施肥處理土壤基本理化性狀Table 3　Properties of the soils treated with the various fertilizer formulations

2.2不同施肥處理對土壤基本理化性狀的影響

化肥配施有機肥均能提高冷浸田土壤 pH、有機碳、全氮、速效磷和速效鉀含量（表3）。與 CK 處理比較，PIM 處理顯著提高了冷浸田土壤有機碳、全氮和速效磷的含量；CAM 處理顯著提高了土壤pH、有機碳、全氮和速效鉀含量；CHM 處理顯著提高了土壤 pH、有機碳、全氮和速效磷含量。對不同原料有機肥處理進行比較發(fā)現(xiàn)， CAM 處理、CHM處理與 PIM 處理之間土壤 pH 存在顯著差異；PIM處理與 CHM 處理全氮含量存在顯著差異；CAM 處理與 CHM 處理和 PIM 處理之間速效鉀存在顯著差異。

2.3不同施肥處理對土壤氮素轉(zhuǎn)化及相關(guān)酶學性質(zhì)的影響

不同原料有機肥對土壤氮素形態(tài)、硝化勢和反硝化勢影響存在顯著差異（表4）。CAM 處理、CHM處理土壤銨態(tài)氮含量顯著高于 PIM 和 CK 處理，CHM 處理土壤硝態(tài)氮顯著低于其他處理，其余三個處理之間差異不顯著。配施有機肥的三個處理與 CK處理之間亞硝態(tài)氮含量均呈現(xiàn)顯著差異，CAM 處理較 CK 處理提高了 157.8%，PIM、CHM 處理分別較CK 處理降低了 33.8%、22.2%。硝化勢、反硝化勢均是 PIM＞CHM＞CAM＞CK。

與 CK 處理相比，CHM 處理顯著增加了冷浸田土壤脲酶、蛋白酶和磷酸酶的活性；CAM 處理僅顯著增加了土壤蛋白酶和磷酸酶的活性；PIM 處理則僅僅顯著增加了土壤磷酸酶的活性。從土壤酶活性所增加的倍數(shù)來看，CHM 處理對土壤脲酶、蛋白酶和磷酸酶活性影響較大，分別較 CK 處理提高1.36、2.08、1.19 倍（圖2）。

2.4不同施肥處理對土壤氮循環(huán)相關(guān)功能微生物基因豐度的影響

針對細菌和古菌的 16S rRNA 基因、氨氧化細菌（AOB）和氨氧化古菌（AOA）的氨單加氧酶（amoA）基因、亞硝酸鹽還原酶（nirK、nirS）基因和一氧化二氮還原酶（nosZ）基因豐度的測定結(jié)果（圖3）表明，與CK 處理相比，配施有機肥處理的冷浸田土壤上述基因豐度均有所提高。其中以細菌、古菌、氨氧化古菌（AOA）和氨氧化細菌（AOB）的氨單加氧酶（amoA）基因豐度的提高呈現(xiàn)出 CHM 處理＞CAM 處理＞PIM 處理＞CK 處理的趨勢。而亞硝酸鹽還原酶（nirK）基因豐度以 CAM 處理最高，為 6.46×108copies/g。亞硝酸鹽還原酶（nirS）基因以 CHM 處理最高，為 9.20×108copies/g。一氧化二氮還原酶（nosZ）基因以 CAM 處理最高，為 3.46×107copies/g。亞硝酸鹽還原酶（nirK、nirS）基因和一氧化二氮還原酶（nosZ）基因豐度在不同有機肥處理間存在差異，這表明不同堆肥原料的有機肥所參與的土壤氮代謝通路可能不同。

表4　不同施肥處理土壤各氮素形態(tài)含量及硝化勢和反硝化勢的變化Table 4　Quantification of the various forms of soil nitrogen and the nitrification/denitrification activity in the soils treated with the various fertilizer formulations

圖2　不同施肥處理土壤脲酶、蛋白酶、磷酸酶活性Fig.2　Activities of soil urease， prolease， phosphatase under different fertilizer treatments

2.5土壤性質(zhì)與氮循環(huán)相關(guān)功能微生物基因的相關(guān)分析

土壤微生物豐度與土壤性質(zhì)的相關(guān)分析（表5）表明，土壤 pH 與細菌 16S rRNA 基因、nosZ 基因拷貝數(shù)呈顯著正相關(guān)，與古菌、AOA、AOB、nirK 呈極顯著正相關(guān)。土壤有機碳與本研究中氮循環(huán)相關(guān)功能微生物基因拷貝數(shù)呈極顯著正相關(guān)。速效鉀與AOA 顯著正相關(guān)，與 nirK、nosZ 極顯著正相關(guān)。速效磷與細菌、古菌、AOB 顯著正相關(guān)，與 nirS 極顯著正相關(guān)。除了全氮和銨態(tài)氮與細菌、銨態(tài)氮與nirS 呈顯著正相關(guān)外，與其余基因豐度均呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)。硝態(tài)氮與細菌、古菌、nirS 顯著負相關(guān)，與 AOA、AOB 呈極顯著負相關(guān)。硝化勢僅與 nirS呈顯著正相關(guān)，反硝化勢除與古菌、nirS 極顯著正相關(guān)外，其余均為顯著正相關(guān)。土壤酶（脲酶、蛋白酶、磷酸酶）活性除蛋白酶與細菌、脲酶與 nirK 和nosZ 呈顯著正相關(guān)以外，與其余基因豐度均呈極顯著正相關(guān)。不同冷浸田土壤氮循環(huán)相關(guān)功能微生物之間，除細菌與 nirK 和 nirS、nirS 與 nirK 和 nosZ 呈顯著正相關(guān)以外，其余兩兩之間均呈極顯著正相關(guān)（表6）。

3　討論

3.1化肥配施不同堆肥原料有機肥產(chǎn)品對冷浸田土壤生產(chǎn)力的提升作用

圖3　不同施肥處理土壤中細菌和古菌、AOB、AOA、nirK、nirS 和 nosZ 基因型硝化、反硝化細菌的拷貝數(shù)Fig.3　Copy number of 16S rRNA， amoA， nirK， nirS and nosZ amplicons in soils sampled from the various fertilizer treatments

表5　土壤微生物豐度與土壤性質(zhì)的相關(guān)分析Table 5　Correlations between soil microbial abundances and soil properties

有研究表明，長期施用有機肥料可顯著改良土壤［29-31］，促進礦物質(zhì)土層氮的轉(zhuǎn)化釋放，增加 20 cm土層的氮含量［32］，提高氮肥效率［30］，改善土壤的生物和化學特性［33］。本研究通過 3年6 季水稻田間試驗，發(fā)現(xiàn)連續(xù)施用化肥配施不同有機肥使冷浸田土壤主要理化性質(zhì)得到明顯改善（表3、表4、圖2）。與 CK處理相比，CAM 和 CHM 處理的土壤 pH 值顯著提高（P＜0.05），分析其主要原因：一是與有機物料本身的灰化堿含量和有機氮的礦化密切相關(guān)；二是與有機物料在稻田淹水還原條件下，通過微生物的作用，被分解產(chǎn)生有機酸陰離子，有機酸陰離子進一步被微生物分解產(chǎn)生過量陽離子有關(guān)；三是由于部分分解的有機材料含有許多酚、羧酸，能消耗質(zhì)子與腐殖化物質(zhì)結(jié)合形成烯醇基團。這與 Naramabuye等［34］研究表明，長期施用有機物如家禽牛糞可提高土壤 pH 值的結(jié)論一致。大量研究表明，化肥配施有機肥是提升土壤有機質(zhì)含量的一種理想施肥方式［18，35］。本項目組通過對我國冷浸田主要分布的 7 個省份的冷浸田及相同耕作制度下正常稻田的土壤養(yǎng)分指標、微生物特征進行分析發(fā)現(xiàn)，土壤速效養(yǎng)分含量低、微生物總量偏低且活性弱是影響冷浸田土壤生產(chǎn)力的主要限制因子［36-37］。尤其是本試驗點高產(chǎn)田土壤中速效磷含量（434.02 mg/kg）達到了極豐富水平，但冷浸田含量僅為 9.00 mg/kg，遠低于正常田。且冷浸田土壤中可培養(yǎng)的細菌、真菌、放線菌、氨化細菌、固氮菌、纖維素分解菌的數(shù)量分別僅為高產(chǎn)田土壤的 53.93%、43.33%、47.32%、51.98%、44.83%和 47.80%。可見，在現(xiàn)有有機無機肥料配施可顯著改良土壤的基礎上，深入探討化肥配施不同有機肥對冷浸田養(yǎng)分活化、水稻產(chǎn)量提升及土壤氮相關(guān)功能微生物群落豐度的效應至關(guān)重要。本研究顯示，化肥配施不同堆肥原料有機肥均顯著增加冷浸田土壤有機碳和全氮的含量，PIM 和 CHM 處理還可活化冷浸田土壤氮、磷養(yǎng)分，顯著增加銨態(tài)氮、速效磷含量，有效緩解因冷浸田速效養(yǎng)分不足而引起的禾苗“坐兜”現(xiàn)象。研究還表明，盡管 CHM 處理銨態(tài)氮含量最高，硝化反應的底物濃度最大，但相應硝化產(chǎn)物的濃度卻最低，分別為硝態(tài)氮 3.98 mg/kg 和亞硝態(tài)氮 0.249 mg/kg。主要原因可能是該處理土壤反硝化菌活性高于硝化菌（圖3），硝態(tài)氮含量與土壤AOA、AOB 豐度呈極顯著負相關(guān)，反硝化作用強于硝化作用的結(jié)果（表4、表5）。因此，通過對冷浸田土壤主要理化性質(zhì)進行綜合分析可看出，CHM 處理土壤生產(chǎn)力提升得最為明顯。該處理顯著提高了冷浸田土壤 pH 值，增加了有機碳、全氮、速效磷和銨態(tài)氮的含量，提高了氮相關(guān)轉(zhuǎn)化酶（脲酶、蛋白酶和磷酸酶）的活性，減少了硝態(tài)氮、亞硝態(tài)氮淋溶損失的風險。同時，結(jié)合各處理的水稻產(chǎn)量水平，進一步表明化肥配施雞糞有機肥能顯著提升冷浸田土壤生產(chǎn)力。

表6　土壤微生物豐度之間的相關(guān)分析Table 6　Correlations between soil microbial abundances and soil properties

3.2化肥配施不同堆肥原料有機肥產(chǎn)品對冷浸田土壤氮相關(guān)微生物豐度的影響

土壤氮相關(guān)微生物是土壤氨化、硝化、反硝化的驅(qū)動者。與化學肥料比較，施用堆肥可為土壤微生物提供持久全面的養(yǎng)分和更多的碳源、能源，更有利于微生物生長，從而提高了微生物數(shù)量［28，32］。Kemnitz 等［28］認為，芳香植物廢料堆肥可用于增強土壤微生物活性，從而促進植物的生長。本研究表明，配施有機肥可顯著提高土壤古菌、AOA、AOB、nirK、nirS、nirZ 的基因豐度。朱海平等［38］研究表明，施用有機肥的土壤細菌數(shù)量和活性遠高于單施化肥處理，但本研究中僅 CHM 處理的細菌豐度與 CK 處理的差異顯著。另外，本研究中 AOB 的數(shù)量高于 AOA，是 AOA 的 1.5 倍。這一結(jié)果與已有的大多研究認為的酸性土壤 AOA 的數(shù)量遠高于 AOB的結(jié)論有很大的不同［35］，這可能與有機肥的施入有關(guān)，具體的影響機理尚需進一步深入研究。

3.3冷浸田土壤氮相關(guān)功能微生物豐度與土壤性質(zhì)的相關(guān)關(guān)系

AOA、AOB、硝化反硝化細菌是參與土壤氮轉(zhuǎn)化的主要微生物。它們所含有的功能基因—amoA、nirK、nirS、nosZ 分別驅(qū)動氮素轉(zhuǎn)化的不同階段，易受土壤理化性質(zhì)的影響。由AOA 和 AOB 驅(qū)動氨氧化作用是硝化過程的第一步，是硝化反應的限速步驟。AOA 和 AOB 基因豐度與土壤 pH、有機碳、全氮、銨態(tài)氮極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)介于0.771～0.928；與硝態(tài)氮含量極顯著負相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為-0.712、-0.757；與反硝化勢顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為 0.586、0.698。這與 He 等［26］報道的土壤 pH 值與 AOB 豐度（r=0.719，P＜0.05，n=8）和 AOA 豐度（r=0.775，P＜0.05，n=8）顯著相關(guān)的結(jié)論一致。參與反硝化作用過程的反硝化菌 nirK、nirS 基因豐度均與有機碳、全氮含量極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)介于 0.699～0.885。這也表明土壤有機碳和全氮含量是影響 nirK、nirS 型反硝化細菌的重要因子［1］。同時，nirK 基因豐度還與土壤 pH（r=0.780，P＜0.01）、速效鉀（r=0.819，P＜0.01）、銨態(tài)氮（r=0.854，P＜0.01）極顯著正相關(guān)，與反硝化勢（r=0.645，P＜0.05）顯著正相關(guān)；nirS 基因豐度與土壤速效磷（r=0.766，P＜0.01）、反硝化勢（r=0.826，P＜0.01）極顯著正相關(guān)，與銨態(tài)氮（r=0.624，P＜0.05）、硝化勢（r=0.682，P＜0.05）顯著正相關(guān)。上述 nirK、nirS 基因豐度與其他土壤理化性質(zhì)之間的相關(guān)性差異，說明二者在作用反硝化的代謝通路或機理上存在不同。而參與反硝化作用過程的 nosZ 基因豐度與土壤理化性質(zhì)的相關(guān)性與 nirK 趨勢基本一致，僅是相關(guān)系數(shù)偏小。與土壤氮素轉(zhuǎn)化密切相關(guān)的土壤酶（脲酶、蛋白酶、磷酸酶）活性與大多數(shù)氮相關(guān)功能微生物豐度呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），相關(guān)系數(shù)介于 0.710～0.935（表5）。說明土壤酶活性與細菌、古菌以及重要功能氨氧化菌 AOA 和 AOB、反硝化菌 nirK、nirS、nosZ 型基因豐度，土壤不同氮素形態(tài)養(yǎng)分含量之間具有密切的關(guān)系。

3.4不同堆肥原料有機肥產(chǎn)品對冷浸田產(chǎn)量提升的機理探討

長期施用有機肥是改良土壤，提高水稻產(chǎn)量的一種有效手段［20，32，39］。Shu 等［20］研究指出，化肥配施有機肥能顯著促進水稻的生長和對養(yǎng)分的吸收。在本研究中，連續(xù) 3年6 季水稻產(chǎn)量結(jié)果表明，化肥配施有機肥可提高冷浸田水稻產(chǎn)量，尤其是 CHM 和CAM 處理，6 季平均增產(chǎn) 10.23%、7.62%（P＜0.05）。而化肥配施不同堆肥原料有機肥產(chǎn)品對冷浸田水稻增產(chǎn)幅度的不同可能有三個方面的原因：一是不同堆肥原料有機肥對冷浸田土壤 pH、速效養(yǎng)分活化、微生物豐度、土壤酶活性等的影響不同（表3、表4、圖2、圖3）；二是飼喂豬、牛、雞的飼料差異較大，雞飼料相比豬、牛飼料含有更多的能量和蛋白，如谷實類、糠麩類、植物性蛋白質(zhì)等。盡管不同原料堆肥后用化肥調(diào)配了全量氮、磷、鉀養(yǎng)分相對一致，但自身氮、磷及微量元素有效性仍存在較大差異，不同堆肥物料對土壤微生態(tài)的調(diào)控亦有不同；三是不同的有機碳營養(yǎng)供給水平。有機碳營養(yǎng)是指水溶性高、易被植物吸收的有機碳化合物，如糖、醇、酸（含氨基酸）等，即不僅有含氮的有機碳營養(yǎng)（如氨基酸），還包括不含氮的碳營養(yǎng)。眾所周知，碳營養(yǎng)的重要性在于其提供構(gòu)建植物體內(nèi)各有機成分的必需成分—碳架，它是植物合成糖類、蛋白質(zhì)、氨基酸、酶、激素、信號傳遞物質(zhì)的基礎物質(zhì)。經(jīng)典植物營養(yǎng)原理的最小因子律用木桶原理形象地顯示了營養(yǎng)元素短板對增產(chǎn)的重要性。但是碳在經(jīng)典理論中雖有其名而在現(xiàn)有文獻中的木桶圖中卻未得到應有的重視。長期以來，在氮磷鉀施肥量大幅度增加的情況下，沒有考慮對碳的補充，作物依靠自然狀態(tài)獲得碳營養(yǎng)僅能滿足其需求的 1/5，作物遠處于碳饑餓中，嚴重制約了作物產(chǎn)量潛力的提升，而通過施肥補碳調(diào)整及優(yōu)化植物營養(yǎng)平衡可消除碳饑餓［40］。本研究三種畜禽對來源不同的飼料消化吸收差異較大，導致不同堆肥有機肥中有機碳的水溶性不同。雞糞有機肥的水溶性有機碳為3.58%，分別是豬糞有機肥、牛糞有機肥的 3.5 倍和9.7 倍，從補碳角度而言，其肥效增強了 3 倍以上。本研究不僅為選擇適宜的有機肥來改良冷浸田、提升水稻產(chǎn)量提供了理論依據(jù)，更是為植物營養(yǎng)平衡中碳平衡的研究提供了實踐基礎。

4　結(jié)論

1）化肥長期配施牛糞和雞糞有機肥能顯著增加冷浸田的水稻產(chǎn)量，而配施豬糞的增產(chǎn)作用不明顯。

2）三種有機無機肥配施均能夠顯著增強冷浸田土壤的硝化勢和反硝化勢；但是，不同種類的有機無機肥對冷浸田土壤的養(yǎng)分含量影響不同，長期配施牛糞和雞糞有機肥顯著提高了土壤 pH、有機碳、全氮和銨態(tài)氮含量，而配施豬糞對土壤有機碳、全氮、速效磷和亞硝態(tài)氮含量有顯著的增加作用。

3）相關(guān)性分析表明，土壤有機碳和全氮含量是AOA、AOB、nirK 和 nirS 型反硝化細菌的重要環(huán)境影響因子，有機無機肥配施能夠顯著提高這些細菌的基因豐度，且以配施雞糞效果最佳。

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Combined application of inorganic and organic fertilizers improve rice yield and the abundance of soil nitrogen-cycling microbes in cold waterlogged paddy fields

XIE Kai-zhi，XU Pei-zhi*，JIANG Rui-ping，LU Yu-sheng，GU Wen-jie，LI Wen-ying，LI Xia，SUN Li-li
（Institute of Agricultural Resources and Environment， Guangdong Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Plant Nutrition and Fertilizer in South Region， Ministry of Agriculture/Key Laboratory of Nutrient Cycling and Farmland Conservation， Guangzhou 510640， China）

【Objectives】 Taking the typical cold waterlogged paddy fields in the South China as a research object， the effects of chemical fertilizers combined with different manures on the grain yield of paddy rice and the abundance of soil nitrogen-cycling microbes were compared. The study could provide scientific basis for the theory and practice of nitrogen mobilization， nitrogen redirection control and use efficiency， and fertilizer application scheme for high yield in cold waterlogged fields.【Methods】A three year-study was conducted to analyze the influences of the fertilizers combined with different organic manures on nutrient mobilization， riceyield and the abundance of nitrogen-cycling bacteria in cold waterlogged soils on the basis of soil properties，enzymatic characteristics and real-time quantification PCR. The field experiment included four treatments: chemical fertilizers（CK）， chemical fertilizers combined with pig manure（PIM）， chemical fertilizers combined with cattle manure（CAM）or chemical fertilizers combined with chicken manure（CHM）.【Results】 The grain yields responded positively to both CHM and CAM application， and were increased by 10.2% and 7.6% over the yield of CK， respectively. The soil pH， organic carbon， total nitrogen content and ammonium nitrogen content were all increased after continuous application of CHM or CAM. The abundance of microbial genes related to soil nitrogen-cycling was significantly enhanced by the additions of the three fertilizer formulations. Furthermore， the 16s rDNA abundance of bacteria and archae bacteria， and amoA（ammonia monooxygenase）abundance of ammonia-oxidizing archaea（AOA）and anaerobic oxidizing bacteria（AOB）presented consistent increasing patterns， and the highest abundances were exhibited in the CHM-treated soil and the increase rate of bacteria 16s rDNA was smaller than others. However， the gene abundances of nitrite reducate（nirK， nirS）and nitrous oxide reducate（nosZ）responded differently to the fertilizer formulations. Correlation analysis showed that the contents of soil organic carbon and total nitrogen appeared to be the key factors influencing the abundance and diversity of AOA-， AOB-， nirK-and nirS-type denitrifying bacteria.【Conclusion】 The application of the fertilizers combined with chicken manure could significantly increase the contents of soil ammonium nitrogen and available phosphate， improve the gene abundances of bacteria， archaebacteria， AOA and AOB-type amoA and enhance the activities of soil urease， protease and phosphatase， thereby improving the productivity of cold waterlogged soils.

compost； cold waterlogged paddy field； rice； nitrogen cycling； function microorganism

S153；S154

A

1008-505X（2016）05-1267-11

2015-07-08接受日期：2016-02-01

日期：2016-05-26

公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項（201003059-04）；廣東省農(nóng)業(yè)科學院院長基金項目（201416）；廣東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)體系建設項目“水稻產(chǎn)業(yè)體系”（粵財教［2009］356號）；廣州市農(nóng)業(yè)科技攻關(guān)項目（GZCQC0902FG06017）；廣東省協(xié)同創(chuàng)新與平臺建設專項資金項目（2015A020224010）資助。

解開治（1977—），男，甘肅民勤人，博士，主要從事植物營養(yǎng)與環(huán)境微生物方向的研究。E-mail：xiekzgsau@163.com

E-mail：pzxu007@163.com