研究熒光原位雜交技術(shù)用于急性早幼粒細(xì)胞白血病患者診治中的臨床效果

廖麗娟

【摘要】 目的 研究在急性早幼粒細(xì)胞白血?。ˋPL）患者診治中應(yīng)用熒光原位雜交技術(shù)（FISH）的臨床效果。方法 20例疑似APL患者作為研究對象， 應(yīng)用FISH檢測PML-RARa融合基因， 分析檢測結(jié)果。結(jié)果 20例患者中確診為APL患者有15例， 其中 PML-RARa融合基因檢測結(jié)果為陽性的有14例， 陰性的有1例， 這1例患者經(jīng)檢查診斷為APL變異型， 誘導(dǎo)治療沒有取得顯著效果；疑似APL的5例患者 PML-RARa融合基因檢測結(jié)果都為陰性， 經(jīng)其他檢查診斷為急性髓細(xì)胞白血病M2。PML-RARa融合基因檢測敏感度為93.3%， 特異性為100.0%。結(jié)論 FISH能夠準(zhǔn)確檢測 PML-RARa融合基因， 提高APL的診斷準(zhǔn)確率， 值得推廣。

【關(guān)鍵詞】 熒光原位雜交技術(shù)；急性早幼粒細(xì)胞白血病；診治

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2016.25.029

APL是一種特殊的急性白血病， 患者會有嚴(yán)重的出血傾向， 并且很容易伴發(fā)彌散性血管內(nèi)凝血， 死亡率較高[1]。APL患者中絕大多數(shù)都存在特異的染色體易位t， 從而有PML-RARa融合基因形成[2]。PML-RARa融合基因是APL的一項(xiàng)重要指標(biāo)， 可以作為診斷標(biāo)準(zhǔn)之一。FISH操作簡便， 結(jié)果的準(zhǔn)確性高[3]。本研究主要分析FISH對于APL的診治效果， 報(bào)告如下。

1 資料與方法

1. 1 一般資料 選取本院2014年7月～2015年7月收治的20例疑似APL患者， 其中男13例， 女7例， 平均年齡（44.9±9.3）歲， 平均病程（1.42±0.97）年；有9例患者出血是主要臨床癥狀， 其中2例為結(jié)膜出血、1例為皮膚紫癜、3例為鼻出血、3例為齒齦出血；有8例患者乏力、頭暈為主要臨床癥狀；有3例患者發(fā)熱為主要臨床癥狀。20例患者經(jīng)臨床診斷確診為APL的患者有15例。

1. 2 方法

1. 2. 1 制備細(xì)胞 選取患者1 ml肝素抗凝骨髓， 利用Ficoll對單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行分離， 利用0.56%氯化鉀溶液對細(xì)胞進(jìn)行低滲處理， 然后完成固定和滴片。

1. 2. 2 融合基因探針 PML探針為紅色熒光信號， RARa探針為綠色信號。

1. 2. 3 雜交 在70%甲酰胺/2×SSC的溫度為73℃變性液中將玻片浸泡5 min， 然后借助乙醇進(jìn)行1 min的脫水處理， 氣干待用。在73℃水浴中將探針混合物進(jìn)行5 min的變性， 滴在45℃預(yù)溫的帶雜交玻片上， 然后完成蓋片和封膠處理， 放入37℃的濕盒中進(jìn)行16～20 h的雜交處理。按照順序浸入73℃ 0.4×SSC、2×SSC/0.1% NP40中進(jìn)行漂洗， 在避免陽光直射的條件下氣干， 添加10 DAPI進(jìn)行復(fù)染， 然后進(jìn)行蓋片封片。

1. 3 判定標(biāo)準(zhǔn) 在同一視野下借助顯微鏡利用兩種濾光片對雜交信號進(jìn)行觀察， PML-RARa融合基因陰性細(xì)胞可以觀察到2綠和2紅分離的雜交信號， 陽性細(xì)胞可以觀察到1紅1綠和2紅綠融合的4個(gè)信號。每例計(jì)數(shù)>200個(gè)中期分裂象， 計(jì)算陽性率。陰性對照：選擇10例正常骨髓樣本， 選擇PML-RARa融合基因探針完成FISH檢查， 有陽性信號出現(xiàn)百分率均數(shù)為0.8%， 標(biāo)準(zhǔn)差為1.03%， 異常閾值為均數(shù)與3倍標(biāo)準(zhǔn)差之和， 最后計(jì)算出為3.9%。所以， 陽性病例標(biāo)準(zhǔn)為陽性信號細(xì)胞百分率>3.9%。

2 結(jié)果

2. 1 15例被確診為APL的患者14例PML-RARa融合基因結(jié)果為陽性， 在陽性樣本中， 陽性細(xì)胞率在9.5%～80.2%之間（異常閾值=3.9%）， 檢測敏感度為93.3%， 特異性為100.0%；PML-RARa融合基因結(jié)果為陰性的患者有1例， 對該患者進(jìn)一步進(jìn)行骨髓染色體檢查以及流式細(xì)胞學(xué)檢查最后診斷為變異型M3。疑似APL的5例患者利用FISH技術(shù)檢測PML-RARa融合基因結(jié)果顯示都是陰性， 另外進(jìn)一步骨髓染色體檢查以及流式細(xì)胞學(xué)檢查也無法診斷為APL。

2. 2 14例PML-RARa融合基因結(jié)果為陽性的患者接受并完成誘導(dǎo)治療的患者有12例， 其中2例在10 d內(nèi)死亡， 其余患者在結(jié)束治療后癥狀均有明顯緩解。12例患者中進(jìn)行維持和鞏固治療的患者有10例， 其余2例失訪。10例接受鞏固維持治療的患者中有9例直到現(xiàn)在仍為緩解狀態(tài)， 借助FISH技術(shù)檢測PML-RARa融合基因結(jié)果都是陰性。在治療期間出現(xiàn)病情加重的患者有1例， 借助FISH技術(shù)檢測PML-RARa融合基因結(jié)果為陽性， 最后由于心力衰竭死亡。

2. 3 PML-RARa融合基因結(jié)果為陰性的1例APL患者進(jìn)行了誘導(dǎo)治療60 d后還是沒有全部緩解， 借助FISH技術(shù)對PML-RARa融合基因進(jìn)行檢測結(jié)果都顯示為陰性， 直到現(xiàn)在病情都沒有得到改善。

2. 4 疑似APL的5例患者， 借助FISH技術(shù)對PML-RARa融合基因進(jìn)行檢測結(jié)果都是陰性， 之后經(jīng)其他方式診斷為急性髓細(xì)胞白血病M2。給予常規(guī)化療治療后得到有效緩解。

3 討論

近些年對于分子生物學(xué)以及細(xì)胞遺傳學(xué)研究的不斷深入， 以往對于FAB的分型基礎(chǔ)為細(xì)胞化學(xué)和形態(tài)學(xué)， 當(dāng)前逐漸形成了MICM分型， 聯(lián)合了分子生物學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)、免疫學(xué)、細(xì)胞形態(tài)學(xué)[4]。以往FAB分型主要不足包括：①由于基礎(chǔ)為細(xì)胞化學(xué)檢查和細(xì)胞形態(tài)學(xué)， 導(dǎo)致其診斷準(zhǔn)確性只有65%左右， 部分APL的細(xì)胞形態(tài)很容易混淆急性髓細(xì)胞白血病M2。②診斷APL一個(gè)重要的標(biāo)準(zhǔn)是早幼粒細(xì)胞>30%， 另外急性髓細(xì)胞白血病M2診斷的一個(gè)重要標(biāo)準(zhǔn)是早幼粒細(xì)胞>10%， 而計(jì)數(shù)早幼粒細(xì)胞有50%都是靠醫(yī)生直接的肉眼觀察[5， 6]。所以這兩類分型的白細(xì)胞主觀性比較強(qiáng)。

本研究對PML-RARa融合基因借助FISH技術(shù)進(jìn)行檢測， 結(jié)果敏感性為93.3%， 疑似APL的5例患者檢測結(jié)果均為陰性， 通過其他各類檢查排除APL， 這也很好的說明了PML-RARa融合基因借助FISH技術(shù)檢測的敏感性較高， 用于APL診斷中的價(jià)值非常顯著， 值得臨床推廣。

參考文獻(xiàn)

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[收稿日期：2016-04-22]