DNA三角雙錐結(jié)構(gòu)的放射性標(biāo)記

李劍波, 王雪梅, 包寶亮, 何玉林, 王相成,張國(guó)建, 白　俠, 劉　磊

(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科, 呼和浩特 010050)

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DNA三角雙錐結(jié)構(gòu)的放射性標(biāo)記

李劍波, 王雪梅, 包寶亮, 何玉林, 王相成,張國(guó)建, 白俠, 劉磊

(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科, 呼和浩特 010050)

分別采用點(diǎn)擊化學(xué)方法對(duì)DNA三角雙錐結(jié)構(gòu)進(jìn)行氟-18標(biāo)記研究, 采用二氯亞錫還原法對(duì)DNA三角雙錐結(jié)構(gòu)進(jìn)行锝-99m標(biāo)記研究. 結(jié)果表明， 點(diǎn)擊化學(xué)方法不適用于DNA三角雙錐結(jié)構(gòu)的氟-18標(biāo)記; 而采用二氯亞錫還原法則制得了以DNA三角雙錐結(jié)構(gòu)為載體的分子影像探針99mTc-DBNs.

DNA三角雙錐結(jié)構(gòu); 放射性標(biāo)記; 氟-18; 锝-99m

分子影像技術(shù)是一種實(shí)時(shí)影像技術(shù), 它利用某個(gè)合適的探針可以無侵襲地研究受體表達(dá)狀況, 從而在分子和細(xì)胞水平上對(duì)人體或者其它生命體中特定分子的信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)[1]. 分子影像技術(shù)在臨床上的應(yīng)用有助于了解疾病的機(jī)制、 診斷疾病、 監(jiān)測(cè)疾病的進(jìn)展并提高治療效果[2～4]. 近年來, 分子影像技術(shù)發(fā)展迅速, 涉及生物、 醫(yī)學(xué)及藥物研發(fā)等多個(gè)領(lǐng)域[5～7].

分子影像技術(shù)的發(fā)展不僅依靠于高性能的影像設(shè)備, 更對(duì)性能優(yōu)良的分子影像探針提出了高要求[8,9]. DNA多面體結(jié)構(gòu)具有納米級(jí)結(jié)構(gòu), 其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、 易于合成、 生物相容性好且可以進(jìn)行精確的修飾和定位. 因此, DNA多面體結(jié)構(gòu)在分子影像、 藥物載帶及靶向治療等方面受到關(guān)注[10～16]. 據(jù)文獻(xiàn)[17]報(bào)道, DNA四面體結(jié)構(gòu)載帶siRNA在小鼠體內(nèi)可實(shí)現(xiàn)基因沉默, 說明DNA四面體結(jié)構(gòu)能夠在動(dòng)物模型體內(nèi)實(shí)現(xiàn)一定的穩(wěn)定性并產(chǎn)生生理作用, 但該方法所使用的熒光分子斷層成像融合CT成像(FMT-CT)的分辨率和靈敏度都有較大限制.

本文使用放射性核素對(duì)DNA多面體結(jié)構(gòu)進(jìn)行標(biāo)記, 制備了可用于PET或者SPECT顯像的分子影像探針. 通過對(duì)DNA三角雙錐結(jié)構(gòu)(DBNs)進(jìn)行氟-18和锝-99m標(biāo)記研究, 以得到基于DNA三角雙錐結(jié)構(gòu)為載體的分子影像探針.

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1試劑與儀器

Agilent 1100型色譜儀(美國(guó)Agilent公司); Amicon超濾膜(切割分子量為300000, 美國(guó)Millipore公司); U-3010型紫外分光光度計(jì)(日本 Hitachi公司).

1.2實(shí)驗(yàn)過程

1.2.1DBNs的制備與純化參照文獻(xiàn)[18,19]方法, 由一步退火操作合成DBNs, 如Scheme 1所示. 將等摩爾的6條ssDNA(分別標(biāo)記為a, b, c, A, B和C, 具體的單鏈序列信息參見表1)在TM緩沖液(10 mmol/L Tris-base, 5 mmol/L MgCl2, pH=8.0)中混合均勻, 于95 ℃孵育10 min后, 迅速降溫至4 ℃后孵育20 min, 即得到DBNs.

Scheme 1　Self-assembly process of DBNs

ssDNAOligonucleotidesequenceaAGGCAGTTGAGACGAACATTCCTAAGTCTGAAATTTATCACCCGCCATAGTAGACGTATCACCbCTTGCTACACGATTCAGACTTAGGAATGTTCGACATGCGAGGGTCCAATACCGACGATTACAGcGGTGATAAAACGTGTAGCAAGCTGTAATCGACGGGAAGAGCATGCCCATCCACTACTATGGCGACTGCGCGGATGACTCAACTGCCTGGTGATACGATCTAGTCTCTACGTCAAGTAAGAACCTTAGBCCTCGCATGACATCCGCGCAGCTAAGGTTCAAAGTTCCTGCCGCTTCACGGACGGTATTGGACCCTCTTCCCGACCGTGAAGCGGCAGGAACTTATACTTGACGTAGAGACTAGAAGGATGGGCATGT20-a?TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCTAAGTCTGAAATTTATCACCCGCCATAGTAGACGTATCACCAGGCAGTTGAGACGAACATTCA20AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

利用體積排阻色譜法(SEC)對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分離純化. 高效液相色譜(HPLC)分析條件, Phenomenex BioSec-SEC-4000型色譜柱(300 mm×7.8 mm); 流動(dòng)相:NaCl(450 mmol/L)+Tris-HCl(25 mmol/L, pH=7.3); 紫外檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm; 等度洗脫; 流速0.6 mL/min.

帶有側(cè)臂鏈(T20)的DBNs由6條ssDNA(分別標(biāo)記為T20-a*, b, c, A, B和C, 具體的單鏈序列信息參見表1)組成, 其制備和純化過程與DBNs相同.

1.2.2DBNs的表征利用聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)、 熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)、 HPLC和原子力顯微鏡(AFM)對(duì)純化后的DBNs進(jìn)行了表征[19].

1.2.32-[18F]氟乙基疊氮的制備將18F-溶液富集在QMA柱上, 用1 mL Kryptofix 222和K2CO3混合溶液淋洗. 將得到的18F-溶液在95 ℃下用氮?dú)獯蹈? 再加入500 μL無水乙腈共沸除水, 重復(fù)3次, 保證18F-盡可能處于無水環(huán)境.

2-[18F]氟乙基疊氮參考文獻(xiàn)[20]方法制備. HPLC分析條件:Zorbax C18柱(250 mm×4.6 mm); 流動(dòng)相A為水相[含三氟乙酸(體積分?jǐn)?shù)0.1%)], 流動(dòng)B為乙腈相[含三氟乙酸(體積分?jǐn)?shù)0.1%)]; 紫外檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm; 梯度條件:0～20 min, 95%A(體積分?jǐn)?shù))→50%A(體積分?jǐn)?shù)); 流速1 mL/min.

1.2.4DBNs的氟-18標(biāo)記在組成DBNs的6條ssDNA中任意選取一條進(jìn)行炔基修飾, 然后將炔基修飾的ssDNA與其余5條ssDNA混合, 按照1.2.1節(jié)方法制備炔基修飾的DBNs, 再采用與DBNs相同的方法分離純化得到炔基三角雙錐結(jié)構(gòu)(炔基-DBNs).

將一定量的炔基三角雙錐溶液、 CuSO4溶液、 叔丁基三氯乙酰亞胺酯(TBTA)溶液和抗壞血酸鈉溶液, 與200 μL [18F]FEA的乙腈溶液(約200 μCi)混勻后, 在一定的溫度下進(jìn)行振蕩反應(yīng). 從濃度、 用量、 反應(yīng)溫度、 反應(yīng)時(shí)間和振蕩頻率等方面研究最佳標(biāo)記條件. 利用Radio-HPLC對(duì)標(biāo)記反應(yīng)過程進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)和分析.

1.2.5MAG3-ssDNA的制備與純化將250 μg ssDNA(A20)溶解于4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES, 0.3 mol/L, pH=8.0)溶液中, 再加入NHS-MAG3(300 μg), 使n(ssDNA)∶n(NHS-MAG3)=1∶20.將混合液在室溫下孵育2 h后, 加入乙酸銨溶液(2 mol/L)終止反應(yīng). 將反應(yīng)溶液通過NAP-5柱進(jìn)行純化, 以乙酸銨溶液(0.25 mol/L)為洗脫液, 收集純化的MAG3-ssDNA(A20)溶液, 待用.

2　結(jié)果與討論

2.1DBNs的制備與純化

Fig.1　HPLC analysis of DBNs

參照文獻(xiàn)[18,19]方法制備DBNs, 并利用HPLC對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行了純化. DBNs色譜出峰時(shí)間在15～16 min之間(見圖1). 將純化后的DBNs溶液用Amicon超濾膜進(jìn)行濃縮, 并利用紫外分光光度計(jì)測(cè)量, 將DBNs溶液濃度調(diào)整到合適的濃度備用. 通過PAGE, FRET, HPLC和AFM對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行了表征, 證明所得產(chǎn)物為DBNs[19].

2.2[18F]2-氟乙基疊氮的制備

向活化的18F-溶液中加入2-疊氮乙基對(duì)甲苯磺酸酯的無水乙腈溶液進(jìn)行反應(yīng), 反應(yīng)結(jié)束后由Radio-HPLC測(cè)得[18F]FEA的標(biāo)記率達(dá)到95%以上.

2.3DBNs的氟-18標(biāo)記

點(diǎn)擊化學(xué)(Click chemistry)反應(yīng)在Cu(Ⅰ)的催化下能夠顯著提高疊氮化合物和端炔修飾化合物的反應(yīng)速率. 本文采用點(diǎn)擊化學(xué)方法對(duì)炔基修飾的DBNs進(jìn)行氟-18標(biāo)記.

考慮到反應(yīng)溫度過低不利于標(biāo)記反應(yīng), 故起始反應(yīng)溫度設(shè)定在25 ℃. 隨著溫度的升高, DBNs結(jié)構(gòu)會(huì)出現(xiàn)一定量的破壞, 故選擇相對(duì)溫和的溫度(25 ℃).

隨著振動(dòng)頻率的加快, DNA三角雙錐結(jié)構(gòu)會(huì)出現(xiàn)一定量的破壞, 實(shí)驗(yàn)將振動(dòng)頻率設(shè)定在500 r/min.

利用點(diǎn)擊化學(xué)方法對(duì)炔基三角雙錐結(jié)構(gòu)進(jìn)行氟-18標(biāo)記, 反應(yīng)體系中含有Cu2+, TBTA保護(hù)劑和抗壞血酸鈉溶液. 以炔基三角雙錐結(jié)構(gòu)的摩爾量為基準(zhǔn), 其余的化合物按照與炔基三角雙錐結(jié)構(gòu)的摩爾比進(jìn)行添加反應(yīng), 結(jié)果如表2所示.

Table 2　Amount of each compound in the click reaction*

* Reaction conditions:200 μL [18F]FEA(200 μCi), 25 ℃, reaction frequency 500 r/min.

首先按照Cu2+離子與炔基三角雙錐結(jié)構(gòu)摩爾比為2∶1進(jìn)行反應(yīng)(表2中Entry 1), 反應(yīng)30 min后取樣檢測(cè), 發(fā)現(xiàn)DNA三角雙錐結(jié)構(gòu)被破壞. 考慮到Cu2+離子對(duì)DNA結(jié)構(gòu)的破壞作用, 逐步降低Cu2+離子的含量, 同時(shí)提高TBTA保護(hù)劑的含量(表2中Entries 2～4). 反應(yīng)開始后, 分別于30和60 min取樣進(jìn)行HPLC檢測(cè), 發(fā)現(xiàn)DNA三角雙錐結(jié)構(gòu)破壞依然嚴(yán)重, 同時(shí)由于Cu2+離子未能等摩爾濃度添加, 導(dǎo)致炔基三角雙錐結(jié)構(gòu)的Click反應(yīng)不成功.

為了保證炔基三角雙錐結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性, 實(shí)驗(yàn)中維持低濃度Cu2+離子, 同時(shí)加大TBTA保護(hù)劑和抗壞血酸鈉的含量(表2中Entry 5), 反應(yīng)開始后分別于30, 60和90 min取樣進(jìn)行HPLC檢測(cè), 發(fā)現(xiàn)反應(yīng)30和60 min時(shí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定, 但是未標(biāo)記成功; 而90 min時(shí)結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重, 仍然未能標(biāo)記成功. 結(jié)果顯示, DNA三角雙錐結(jié)構(gòu)在解鏈后有部分鏈被標(biāo)記上, 但是結(jié)構(gòu)本身已經(jīng)不完整.

利用點(diǎn)擊化學(xué)方法對(duì)炔基修飾的DNA三角雙錐結(jié)構(gòu)進(jìn)行氟-18標(biāo)記. 結(jié)果表明, 反應(yīng)中標(biāo)記效果不理想, 炔基三角雙錐結(jié)構(gòu)在標(biāo)記過程中結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重.

2.4DBNs的锝-99m標(biāo)記

DBNs的锝-99m標(biāo)記流程如Scheme 2所示.

Scheme 2　Schematic diagram of radiolabeling DBNs with technetium-99m

Fig.2　HPLC analysis of 99mTc-DBNs(A) Radioactive detector; (B) UV detector.

參照文獻(xiàn)[19]方法, 將MAG3配體基團(tuán)偶聯(lián)在ssDNA(A20)上, 得到MAG3-ssDNA(A20); 隨后使用二氯亞錫還原法對(duì)MAG3-ssDNA(A20)進(jìn)行锝-99m標(biāo)記, 再將锝-99m標(biāo)記的A20單鏈與含有T20手臂鏈的DBNs進(jìn)行雜交, 標(biāo)記反應(yīng)的時(shí)間通常約為30 min, 利用Radio-HPLC進(jìn)行分析放化產(chǎn)率, 反應(yīng)標(biāo)記率在90%以上, 產(chǎn)物放化純度大于90%. 如圖2所示, 锝-99m標(biāo)記DNA三角雙錐結(jié)構(gòu)(99mTc-DBNs)的放射性信號(hào)的保留時(shí)間為13.8 min. 可見, 利用锝-99m對(duì)DNA三角雙錐結(jié)構(gòu)進(jìn)行標(biāo)記, 制得了99mTc-DBNs分子探針.

3　結(jié)　　論

研究了DNA三角雙錐結(jié)構(gòu)的氟-18和锝-99m的標(biāo)記方法, 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 點(diǎn)擊化學(xué)方法不適用于DNA三角雙錐結(jié)構(gòu)的氟-18標(biāo)記; 而通過二氯亞錫還原法制得了99mTc-DBNs分子探針, 發(fā)展了一類以DNA多面體結(jié)構(gòu)為載體的分子影像探針.

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(Ed.:P, H, D, K)

? Supported by the National Natural Science Foundation of China(No.81360227) and the Natural Science Foundation of Inner Mongolia, China[No.2015BS(LH)0803].

Radiolabeling of DNA Bipyramid Nanostructures?

LI Jianbo*, WANG Xuemei, BAO Baoliang, HE Yulin, WANG Xiangcheng,ZHANG Guojian, BAI Xia, LIU Lei

(Department of Nuclear Medicine, Inner Mongolia Medical University Affiliated Hospital, Hohhot 010050, China)

DNA bipyramid nanostructures were radiolabeled with fluorine-18 through click chemistry. Reactant concentration, catalyst dosage, reaction time, temperatureand reaction frequency in the CuAAC reaction were studied. DNA bipyramid nanostructures were also radiolabeled with technetium-99m through stannous chloride lableling method. The results showed that it was not a good idea to radiolabel DNA bipyramid nanostructures with fluorine-18 through click chemistry. At the same time99mTc-DBNs were successfully prepared. Radioactive molecular imaging probes would be obtained based on the nanoplatforms of DNA bipyramid nanostructures.

DNA bipyramid nanostructure; Radiolabeling; Fluorine-18; Technetium-99m

10.7503/cjcu20160407

2016-06-06. 網(wǎng)絡(luò)出版日期:2016-08-23.

國(guó)家自然科學(xué)基金(批準(zhǔn)號(hào):81360227)和內(nèi)蒙古自治區(qū)自然科學(xué)基金[批準(zhǔn)號(hào):2015BS(LH)0803]資助.

O621.3

A

聯(lián)系人簡(jiǎn)介:李劍波, 男, 博士, 助理研究員, 主要從事分子影像探針方面的研究. E-mail:lijianbo_1235@163.com