• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    山梨酮脫氫酶模塊與酮古龍酸桿菌底盤細(xì)胞的適配分析

    2016-11-01 02:12:52陳思賈楠丁明珠元英進(jìn)
    生物工程學(xué)報 2016年9期
    關(guān)鍵詞:產(chǎn)酸量山梨糖混菌

    陳思,賈楠,丁明珠,元英進(jìn)

    ?

    山梨酮脫氫酶模塊與酮古龍酸桿菌底盤細(xì)胞的適配分析

    陳思1,2,賈楠1,2,丁明珠1,2,元英進(jìn)1,2

    1 天津大學(xué)化工學(xué)院系統(tǒng)生物工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津 300072 2 天津化學(xué)化工協(xié)同創(chuàng)新中心,天津 300072

    酮古龍酸桿菌是維生素C二步混菌發(fā)酵過程中的產(chǎn)酸菌。山梨酮脫氫酶 (L-sorbosone dehydrogenase,縮寫為SNDH) 作為維生素C直接前體2-酮基-L-古龍酸 (2-KGA) 合成的關(guān)鍵酶,其作用機(jī)制并不十分清楚。借助全基因組測序抽提2個山梨酮脫氫酶基因,分別位于基因組 (縮寫為) 和質(zhì)粒 (縮寫為) 上。通過工程化改造技術(shù)在工業(yè)產(chǎn)酸菌中構(gòu)建山梨酮脫氫酶功能模塊,比較其對2-KGA產(chǎn)量的影響。研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)對菌株產(chǎn)酸影響不明顯,過表達(dá)使菌株明顯產(chǎn)生副產(chǎn)物。將和分別配合輔因子PQQ合成基因,分別構(gòu)建和模塊,得到的工程菌株產(chǎn)酸情況與之前的結(jié)果大致相同。將4株工程菌株分別與內(nèi)生芽孢桿菌混合培養(yǎng)傳代50 d后,分離菌株進(jìn)行混菌發(fā)酵,其2-KGA的轉(zhuǎn)化率分別提高了15.4%、179%、0.65%和125%。表明混菌適應(yīng)性進(jìn)化策略是一種增加功能模塊與底盤細(xì)胞適配性,進(jìn)而快速獲得優(yōu)良性狀菌種的有效方法。

    酮古龍酸桿菌,山梨酮脫氫酶,適配性,適應(yīng)性進(jìn)化,混菌體系

    維生素C是維生素類藥中發(fā)展最快、產(chǎn)量最大、用途最廣的品種[1]。我國VC二步發(fā)酵法由中國科學(xué)院微生物研究所和北京制藥廠于20世紀(jì)70年代初發(fā)明。第一步由氧化葡萄糖酸桿菌將D-山梨醇氧化為L-山梨糖。第二步由酮古龍酸桿菌及伴生菌混合培養(yǎng)將L-山梨糖轉(zhuǎn)化為VC的前體2-酮基-L-古龍酸 (2-KGA)[2]。作為功能菌完成L-山梨糖到2-KGA的轉(zhuǎn)化,單獨(dú)生長時十分緩慢且產(chǎn)酸量很低[3],伴生菌負(fù)責(zé)輔助產(chǎn)酸菌的生長及產(chǎn)酸。其中,山梨糖/山梨酮脫氫酶能將L-山梨糖轉(zhuǎn)化為L-山梨酮,進(jìn)而轉(zhuǎn)化為維生素C的前體2-KGA。PQQ作為醌酶類輔因子,參與氧化還原反應(yīng),調(diào)節(jié)微生物呼吸鏈電子傳遞[4],同時PQQ還作為L-山梨糖/山梨酮脫氫酶的輔因子發(fā)揮重要作用。

    作為非模式微生物,其遺傳背景尚不清晰,基因操作的相關(guān)研究有限,糖酸轉(zhuǎn)化的代謝路徑不清晰且相關(guān)酶系的蛋白結(jié)構(gòu)和催化反應(yīng)機(jī)理不明確,限制了對菌株的工程改造。Cai等[5]利用來源于乳酸菌的葉酸合成基因簇,彌補(bǔ)了體內(nèi)葉酸代謝路徑的缺乏,提高了細(xì)胞密度和產(chǎn)酸能力。杜瑾等通過在體內(nèi)組合表達(dá)山梨糖/山梨酮脫氫酶和輔因子PQQ合成路徑的模塊[6],使混菌發(fā)酵的產(chǎn)酸水平提高了20%。但由于基因組信息的缺乏,對關(guān)鍵酶的研究較為局限,該研究中只選用了1個山梨糖脫氫酶基因和1個山梨酮脫氫酶基因。江南大學(xué)陳堅(jiān)課題組通過在氧化葡萄糖酸桿菌內(nèi)過表達(dá)山梨糖脫氫酶和山梨酮脫氫酶,在該菌中實(shí)現(xiàn)了由山梨糖到2-KGA的轉(zhuǎn)化過程[7],發(fā)酵168 h獲得2-KGA 32.4 g/L。此外,本實(shí)驗(yàn)室曾借助系統(tǒng)生物學(xué)方法對混菌體系進(jìn)行代謝組學(xué)與蛋白組學(xué)偶聯(lián)的解析[8-9],深入挖掘了兩菌間相互作用機(jī)制。同時,利用混菌培養(yǎng)傳代150 d的方式加強(qiáng)混菌的相互作用[10],糖酸轉(zhuǎn)化率提高16%,并借助代謝組[11]與蛋白組[12]成功挖掘了兩菌相互強(qiáng)化的分子機(jī)制。

    本研究中,針對前人較少研究的山梨酮脫氫酶 (L-sorbosone dehydrogenase,縮寫為SNDH) 進(jìn)行序列比對分析,發(fā)現(xiàn)2個山梨酮脫氫酶基因,分別位于基因組 (縮寫為) 和質(zhì)粒 (縮寫為) 上。和序列差異很大,同源性只有30.39%。通過在工業(yè)應(yīng)用的產(chǎn)酸菌HKv604中構(gòu)建兩種山梨酮脫氫酶功能模塊,比較其對2-KGA產(chǎn)量的影響,同時,結(jié)合混菌長期傳代加強(qiáng)兩菌相互作用的適應(yīng)性進(jìn)化策略,讓改造后的工程菌株與伴生菌互為進(jìn)化壓力,研究適應(yīng)性進(jìn)化實(shí)驗(yàn)對2-KGA產(chǎn)量及模塊作用的影響。旨在解析兩種模塊在中的作用機(jī)制的同時,增加山梨酮脫氫酶模塊與底盤細(xì)胞之間的適配,尋找強(qiáng)化產(chǎn)酸路徑及削弱缺陷路徑的方案。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    本文所使用的維生素C二步發(fā)酵菌株為工業(yè)應(yīng)用菌種酮古龍酸桿菌HKv604與伴生菌內(nèi)生芽孢桿菌[13]。構(gòu)建工程菌株所用的質(zhì)粒為廣宿主低拷貝的pBBR1MCS2[14],由軍事科學(xué)院微生物研究所張惟材教授惠贈。脫氧核糖核苷酸 (dATP、dTTP、dGTP和dCTP) 和DNA聚合酶購自北京天根生物技術(shù)有限公司。限制性內(nèi)切酶和連接反應(yīng)試劑為TaKaRa公司產(chǎn)品,質(zhì)粒小量抽提試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、基因組提取試劑盒和PCR產(chǎn)物純化試劑盒為北京天根生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

    1.2 方法

    1.2.1 工程菌株構(gòu)建

    本實(shí)驗(yàn)室先前對菌株Hbe602進(jìn)行了全基因組測序,包含染色體和兩個質(zhì)粒,結(jié)果遞交于NCBI庫中 (CP012908、CP012909、CP012910)。編碼2個山梨酮脫氫酶L-sorbosone dehydrogenase,分別位于染色體DNA (簡稱) 和質(zhì)粒2 (簡稱) 上,GI號分別為939480045和939479492,Blast結(jié)果顯示兩個基因間的同源性只有30.39 %。根據(jù)基因序列設(shè)計引物 (表1),擴(kuò)增菌株基因組上兩個山梨酮脫氫酶基因及PQQ合成基因,構(gòu)建組合模塊 (圖1)。通過電轉(zhuǎn)化法將含有目的基因的質(zhì)粒導(dǎo)入HKv604中,在含卡那霉素的抗性平板篩選陽性轉(zhuǎn)化子提質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證。獲得了過表達(dá)和的4株工程菌株,分別命名為SyBE_Kv0001116021、SyBE_Kv0001116022、SyBE_Kv00011160210和SyBE_Kv00011160220。

    表1 引物序列

    圖1 工業(yè)K. vulgare中L-山梨酮脫氫酶模塊 (A)及其與輔因子合成基因pqqA組合的功能模塊 (B)的構(gòu)建

    1.2.2 培養(yǎng)基配制

    種子培養(yǎng)基 (1 L培養(yǎng)基):玉米漿3 g,牛肉膏3 g,酵母膏3 g,尿素1 g,蛋白胨10 g,KH2PO41 g,MgSO40.2 g,CaCO31 g,定容至0.8 L。配制固體培養(yǎng)基還需添加瓊脂20 g。調(diào)節(jié)pH 6.8,121 ℃滅菌20 min。另稱取20 g/L-山梨糖定容至0.2 L單獨(dú)滅菌,接菌前添加至種子培養(yǎng)基中。

    發(fā)酵培養(yǎng)基 (1 L培養(yǎng)基):玉米漿15 g,尿素12 g,KH2PO41 g,MgSO40.5 g,CaCO32 g,定容至0.8 L,調(diào)節(jié)pH 6.8?7.0,121 ℃滅菌20 min。另稱取80 g山梨糖定容至0.2 L單獨(dú)滅菌,接菌前添加至發(fā)酵培養(yǎng)基中。

    1.2.3 酮古龍酸桿菌單菌發(fā)酵

    將活化的菌株用無菌水從平板上吹洗下來,加入50 mL新鮮培養(yǎng)基 (含50 μg/mL卡那霉素) 內(nèi),在30 ℃、250 r/min搖床中培養(yǎng)48 h,轉(zhuǎn)接培養(yǎng)24 h,獲得種子液。測定種子液的細(xì)胞濃度,計算初始接菌濃度為600=0.3所需的種子液體積,加入新鮮培養(yǎng)基中發(fā)酵。

    1.2.4 底物與產(chǎn)物的檢測

    本研究中底物與產(chǎn)物的測定選用高效液相色譜法 (HPLC)。取菌液1 mL,12 000 r/min離心5 min,將上清轉(zhuǎn)移至離心管中,用0.5 mol/L硫酸溶液稀釋適當(dāng)?shù)谋稊?shù),水系濾膜過濾后,通過HPLC進(jìn)行檢測。色譜柱選用Bio-Rad HPX-87H,流動相為0.5 mol/L H2SO4,流動相流速為0.6 mL/min,柱溫設(shè)定為65 ℃,示差檢測器檢測樣品。

    1.2.5 混菌傳代馴化與發(fā)酵

    改造后的和通過平板活化和種子液培養(yǎng)獲得活性較好的菌種。按初始600比為3∶1進(jìn)行種子液混合,接入有50 mL新鮮種子培養(yǎng)液的250 mL搖瓶中進(jìn)行混菌培養(yǎng),30 ℃、250 r/min搖床振蕩培養(yǎng)24 h。取2 mL混菌培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到50 mL 新鮮種子培養(yǎng)基中在相同的條件下進(jìn)行培養(yǎng),連續(xù)傳代50 d取轉(zhuǎn)接后剩余的混菌培養(yǎng)液1 mL,12 000 r/min離心5 min,將上清移至離心管中用于2-KGA的HPLC測定,菌體經(jīng)1 mL 0.5 mol/L HCl處理用于混菌600的測定。對第50天的混菌分純,將50代與伴生菌配合混菌發(fā)酵,測定產(chǎn)酸量和600值。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 山梨酮脫氫酶功能模塊對的影響

    利用傳統(tǒng)的分析手段和基因工程手段,研究者們解析了中將山梨糖轉(zhuǎn)化為古龍酸的反應(yīng)途徑及相關(guān)酶學(xué)特性[15-16],認(rèn)為山梨酮脫氫酶對參與山梨糖轉(zhuǎn)化為2-KGA的過程中起到重要作用。本文的研究工作通過對比兩個山梨酮脫氫酶模塊的效果,進(jìn)一步認(rèn)識其功能。將工程菌SyBE_Kv0001116021和SyBE_Kv0001116022進(jìn)行單菌發(fā)酵,底物L(fēng)-山梨糖的濃度為20 g/L。底物消耗和產(chǎn)物2-KGA濃度隨時間的變化如圖2所示。在48 h發(fā)酵過程中菌株的耗糖速率基本相同,細(xì)胞的生長速率也沒有太大差別。發(fā)酵到36 h后,不再消耗L-山梨糖,2-KGA的產(chǎn)量也趨于穩(wěn)定。過表達(dá)山梨酮脫氫酶基因的菌株產(chǎn)酸量都低于對照菌株,過表達(dá)的菌株生產(chǎn)2-KGA的能力最弱。通過上述數(shù)據(jù)可知,過表達(dá)s并不影響細(xì)胞對底物山梨糖的吸收利用和轉(zhuǎn)化,但是山梨糖流向副產(chǎn)物途徑的通量較大,導(dǎo)致2-KGA產(chǎn)量明顯降低。圖3是24 h測得改造菌株單菌發(fā)酵菌液的HPLC結(jié)果,底物L(fēng)-山梨糖的出峰時間為9.50 min,產(chǎn)物峰為7.87 min。觀察可知過表達(dá)對L-山梨糖代謝路徑?jīng)]有太大影響。過表達(dá)的菌株發(fā)酵液在7.40 min出現(xiàn)了副產(chǎn)物峰,耗糖量并沒有降低。本文采用的高效液相色譜87H柱子上離得近的兩種物質(zhì)一般結(jié)構(gòu)比較接近,從圖3可以肯定該副產(chǎn)物與目標(biāo)產(chǎn)物2-KGA的性質(zhì)較為接近,這與本研究確定的山梨酮脫氫酶的特異性較差的結(jié)論較為一致,而之前的文獻(xiàn)報道有提到一種副產(chǎn)物L(fēng)-艾杜糖酸[17],本研究得到的也有可能是類似物質(zhì)。結(jié)果表明過表達(dá)編碼的蛋白酶能很好地利用底物L(fēng)-山梨糖,但底物有相當(dāng)一部分被轉(zhuǎn)化為副產(chǎn)物,進(jìn)一步說明編碼的山梨酮脫氫酶對L-山梨糖轉(zhuǎn)化2-KGA反應(yīng)專一性較差。

    圖2 山梨酮脫氫酶模塊對K. vulgare耗糖 (A) 與產(chǎn)酸(B)的影響

    圖3 改造K. vulgare發(fā)酵產(chǎn)物的HPLC檢測

    2.2 山梨酮脫氫酶與輔因子PQQ組合對及混菌發(fā)酵的影響

    醌酶與其輔因子PQQ的合成是兩個相對獨(dú)立的過程。大腸桿菌中不含合成PQQ的基因,但有編碼PQQ依賴型葡萄糖脫氫酶的基因[18]。耐輻射球菌中具有合成PQQ相關(guān)基因而不含醌酶合成基因[19]。而中同時具有醌酶和PQQ合成基因,考慮到山梨酮脫氫酶屬于醌酶家族,在參與氧化還原反應(yīng)的過程中需要配合輔因子PQQ進(jìn)行物質(zhì)的氧化,單獨(dú)過表達(dá)山梨酮脫氫酶可能會導(dǎo)致細(xì)胞體內(nèi)輔因子不平衡,從而使氧化還原反應(yīng)受阻。在大腸桿菌、釀酒酵母等模式生物中,針對NADH、NADPH等輔因子的代謝調(diào)控已取得顯著效果[20-21]。為此,本研究進(jìn)行了功能模塊與輔因子配合表達(dá)。

    過表達(dá)的菌株SyBE_Kv0001116021,發(fā)酵48 h消耗底物0.402 g,2-KGA的產(chǎn)量為9.83 g/L;過表達(dá)模塊的菌株SyBE_ Kv00011160210消耗底物0.365 g,2-KGA的產(chǎn)量為9.68 g/L??赡苁禽o因子配合帶來的積極影響與輔因子過表達(dá)對細(xì)胞生長造成的負(fù)擔(dān)相互抵消,導(dǎo)致總體無影響?;炀l(fā)酵120 h,原始菌株SyBE_Kv000111601與伴生菌混菌發(fā)酵的產(chǎn)酸量為70.5 g/L,含空載體的菌株SyBE_Kv0001116010與伴生菌混菌發(fā)酵的產(chǎn)酸量為69.1 g/L,過表達(dá)基因菌株混菌發(fā)酵的產(chǎn)酸量為66.3 g/L,過表達(dá)-的菌株混菌發(fā)酵的產(chǎn)酸量為67.6 g/L (圖4)。改造菌株的混菌發(fā)酵產(chǎn)酸量較對照菌株低,可能由于代謝負(fù)擔(dān)造成。

    圖4 山梨酮脫氫酶模塊及其與輔酶合成模塊組合對混菌發(fā)酵生產(chǎn)2-KGA的影響

    配合輔因子合成基因獲得的菌株SyBE_Kv00011160220的耗糖速率有了較大提高。過表達(dá)的菌株SyBE_Kv0001116022發(fā)酵48 h后消耗底物0.367 g,2-KGA產(chǎn)量為5.75 g/L;過表達(dá)-的菌株SyBE_Kv00011160220底物消耗為0.477 g,2-KGA的產(chǎn)量為6.55 g/L,提升了13.9%。說明輔因子的加入對編碼的山梨酮脫氫酶參與的氧化還原反應(yīng)有積極作用?;炀l(fā)酵結(jié)果,原始菌株混菌發(fā)酵的產(chǎn)酸量為70.5 g/L,含有空載體的菌株混菌發(fā)酵的產(chǎn)酸量為69.1 g/L,過表達(dá)菌株混菌發(fā)酵的產(chǎn)酸量為7.41 g/L,過表達(dá)-的菌株混菌發(fā)酵的產(chǎn)酸量為7.42 g/L。輔因子合成功能模塊對編碼的山梨酮脫氫酶催化反應(yīng)無明顯作用。

    2.3 混菌配合適應(yīng)性進(jìn)化對混菌發(fā)酵的影響

    適應(yīng)性進(jìn)化與理性設(shè)計改造策略不同,能在大量不同基因出現(xiàn)突變,有效提高功能模塊與底盤細(xì)胞間的適配性[22]。運(yùn)用合成生物技術(shù)構(gòu)建工程菌株生產(chǎn)生物燃料、生物化學(xué)品等工作中,結(jié)合適應(yīng)性進(jìn)化能顯著提高菌株適應(yīng)性、底物利用效率和生產(chǎn)速率[23-24]。為此,將改造后的與伴生菌配合進(jìn)行適應(yīng)性進(jìn)化實(shí)驗(yàn),圖5為進(jìn)化50 d過程中4個工程菌混菌體系2-KGA的變化情況。圖中曲線的斷點(diǎn)是因?yàn)樵趥鞔^程中發(fā)生了染菌情況,通過對其中的兩菌進(jìn)行了分離純化后重新混合傳代所致。曲線均存在一定的波動,但總體上趨于穩(wěn)定。適應(yīng)性進(jìn)化的機(jī)制是生物體隨外界環(huán)境條件的改變而改變了自身的特性或生活方式,適應(yīng)于新環(huán)境的基因型會留下更多的子代,從而不斷進(jìn)化。以前研究表明,二步混菌生產(chǎn)維生素C的發(fā)酵體系中,與其伴生菌內(nèi)生芽孢桿菌既存在著代謝物質(zhì)上的交流,營養(yǎng)物質(zhì)和生存空間上的競爭[9]。伴生菌在生長和產(chǎn)芽孢過程中釋放促進(jìn)產(chǎn)酸菌生長和產(chǎn)酸[25],能夠降解培養(yǎng)基中的蛋白為伴生菌提供大量氨基酸,通過促進(jìn)伴生菌快速生長并進(jìn)入衰亡期產(chǎn)生芽孢[26]。借助產(chǎn)酸菌與伴生菌的相互作用,通過傳代的方式,互為環(huán)境壓力,使得兩菌配合更為默契,從而得到更優(yōu)化的發(fā)酵體系。分離菌株進(jìn)行混菌發(fā)酵,經(jīng)過傳代進(jìn)化實(shí)驗(yàn)菌株SyBE_Kv0001116021的2-KGA的產(chǎn)量提高了15.4%,菌株SyBE_Kv0001116022的2-KGA產(chǎn)量提升179%。菌株SyBE_Kv00011160210在進(jìn)化前后2-KGA的產(chǎn)量并未發(fā)生明顯改變,菌株SyBE_Kv00011160220進(jìn)化后2-KGA產(chǎn)量提高了125% (圖6)。由上述結(jié)果可看出適應(yīng)性進(jìn)化對菌株的作用效果明顯,能很好地削弱副產(chǎn)物路徑的作用,提高混菌產(chǎn)酸效率。

    圖5 混菌傳代50 d過程中2-KGA產(chǎn)量

    圖6 傳代菌株混菌發(fā)酵產(chǎn)酸圖

    3 結(jié)論

    本文在工業(yè)中構(gòu)建L-山梨酮脫氫酶基因及其與輔因子組合的-和-模塊,期望通過產(chǎn)酸功能模塊與輔因子合成模塊的適配性研究,比較其作用差異。研究發(fā)現(xiàn),單獨(dú)發(fā)酵時,配合輔因子模塊組合-與功能模塊單獨(dú)表達(dá)對比無明顯區(qū)別,而混菌發(fā)酵時-過表達(dá)使得產(chǎn)酸量獲得了少量的提升。-工程菌單獨(dú)發(fā)酵時產(chǎn)酸量較提升13.9%,然而混菌發(fā)酵無明顯效果。結(jié)合適應(yīng)性進(jìn)化策略,將上述改造的工程菌株與伴生菌混合傳代培養(yǎng),兩菌間互為動態(tài)進(jìn)化壓力?;炀到y(tǒng)在50 d傳代完成后,2-KGA的轉(zhuǎn)化率得到了一定的提升,2-KGA的產(chǎn)量分別提高15.4%、179%、0.65%和125%。從另一角度說明該混菌體系中兩菌的共同進(jìn)化作用,使該模塊產(chǎn)生副產(chǎn)物的作用削弱。由此可見,混菌適應(yīng)性進(jìn)化策略是一種增加功能模塊與底盤細(xì)胞適配性,進(jìn)而快速獲得優(yōu)良性狀菌種的有效方法。

    REFERENCES

    [1] Chauhan AS, Ramteke RS, Eipeson WE. Properties of ascorbic acid and its applications in food processing: a critical appraisal. J Food Sci Technol, 1998, 35(5): 381–392.

    [2] Yin GL, He JM, Ren SX, et al. Production of vitamin C precursor-2-keto-L-gulonic acid from L-sorbose by a novel bacterial component system of SCB329-SCB933. Ind Microbiol, 1997, 27: 1–7.

    [3] Ma Q, Zhang WW, Zhang L, et al. Proteomic analysis ofunder glutathione reveals high demand for thiamin transport and antioxidant protection. PLoS ONE, 2012, 7(2): e32156.

    [4] Wang X, Zhang WC. Advances in biosynthesis of pyrroloquinoline quinone. Lett Biotechnol, 2007, 18(3): 534–538.王歆, 張惟材. 吡咯喹啉醌生物合成研究進(jìn)展. 生物技術(shù)通訊, 2007, 18(3): 534–538.

    [5] Cai L, Yuan MQ, Li ZJ, et al. Genetic engineering offor enhanced production of 2-keto-L-gulonic acid. J Biotechnol, 2012, 157(2): 320–325.

    [6] Du J, Bai W, Song H, et al. Combinational expression of sorbose/sorbosone dehydrogenases and cofactor pyrroloquinoline quinone increases 2-keto-L-gulonic acid production in-consortium. Metab Eng, 2013, 19: 50–56.

    [7] Gao LL, Hu YD, Liu J, et al. Stepwise metabolic engineering ofWSH-003 for the direct production of 2-keto-L-gulonic acid from D-sorbitol. Metab Eng, 2014, 24: 30–37.

    [8] Ma Q, Zhou J, Zhang W, et al. Integrated proteomic and metabolomic analysis of an artificial microbial community for two-step production of vitamin C. PLoS ONE, 2011, 6(10): e26108.

    [9] Du J, Zhou J, Xue J, et al. Metabolomic profiling elucidates community dynamics of theconsortium. Metabolomics, 2012, 8(5): 960–973.

    [10] Zou Y, Hu ML, Lv YJ, et al. Enhancement of 2-keto-gulonic acid yield by serial subcultivation of co-cultures ofand. Bioresource Technol, 2013, 132: 370–373.

    [11] Ding MZ, Zou Y, Song H, et al. Metabolomic analysis of cooperative adaptation between co-culturedand. PLoS ONE, 2014, 9(4): e94889.

    [12] Ma Q, Zou Y, Lv YJ et al. Comparative proteomic analysis of experimental evolution of the-co-culture. PLoS ONE, 2014, 9(3): e91789.

    [13] Jia N, Du J, Ding MZ, et al. Genome sequence ofand analysis of its companion mechanism in the-strain consortium. PLoS ONE, 2015, 10(8): e0135104.

    [14] Kovach ME, Phillips RW, Elzer PH, et al. pBBR1MCS: a broad-host-range cloning vector. Biotechniques, 1994, 16(5): 800.

    [15] Asakura A, Hoshino T. Isolation and characterization of a new quinoprotein dehydrogenase, L-sorbose/L-sorbosone dehydrogenase. Biosci Biotech Biochem, 1999, 63(1): 46–53.

    [16] Miyazaki T, Sugisawa T, Hoshino T. Pyrroloquinoline quinone-dependent dehydrogenases fromcatalyze the direct conversion of L-sorbosone to L-ascorbic acid. Appl Environ Microb, 2006, 72(2): 1487–1495.

    [17] Zou W, Liu LM, Zhang J, et al. Reconstruction and analysis of a genome-scale metabolic model of the vitamin C producing industrial strainWSH-001. J Biotechnol, 2012, 161(1): 42–48.

    [18] Blattner FR, Plunkett G, Bloch CA, et al. The complete genome sequence ofK-12. Science, 1997, 277(5331): 1453–1462.

    [19] Shrivastava M, Rajpurohit YS, Misra HS, et al. Survival of phosphate-solubilizing bacteria against DNA damaging agents. Can J Microbiol, 2010, 56(10): 822–830.

    [20] San KY, Bennett GN, Berrios-Rivera SJ, et al. Metabolic engineering through cofactor manipulation and its effects on metabolic flux redistribution in. Metab Eng, 2002, 4(2): 182–192.

    [21] Heux S, Cachon R, Dequin S. Cofactor engineering in: expression of a H2O-forming NADH oxidase and impact on redox metabolism. Metab Eng, 2006, 8(4): 303–314.

    [22] Portnoy VA, Bezdan D, Zengler K. Adaptive laboratory evolution--harnessing the power of biology for metabolic engineering. Curr Opin Biotech, 2011, 22(4): 590–594.

    [23] Hong KK, Nielsen J. Adaptively evolved yeast mutants on galactose show trade-offs in carbon utilization on glucose. Metab Eng, 2013, 16: 78–86.

    [24] Peng BY, Shen Y, Li XW, et al. Improvement of xylose fermentation in respiratory-deficient xylose-fermenting. Metab Eng, 2012, 14(1): 9–18.

    [25] Zhang J, Liu J, Shi ZP, et al. Manipulation ofgrowth for efficient 2-KLG production by. Process Biochem, 2010, 45(4): 602–606.

    [26] Zhou J, Ma Q, Yi H, et al. Metabolome profiling reveals metabolic cooperation betweenandduring induced swarm motility. Appl Environ Microb, 2011, 77(19): 7023–7030.

    (本文責(zé)編 陳宏宇)

    Fitness analysis between the L-sorbosone dehydrogenase modules andchassis

    Si Chen1,2, Nan Jia1,2, Mingzhu Ding1,2, and Yingjin Yuan1,2

    1 Key Laboratory of Systems Bio-engineering (Ministry of Education), School of Chemical Engineering and Technology, Tianjin University, Tianjin 300072, China 2 Collaborative Innovation Center of Chemical Science and Engineering (Tianjin), Tianjin 300072, China

    is an acid-producing strain in the process of two-step vitamin C fermentation. L-sorbosone dehydrogenase (SNDH) is one of the key enzymes during the biosynthesis of 2-keto-L-gulonic acid (2-KGA), the precursor of vitamin C. However, the catalytic mechanism of SNDH is unclear. According to the whole genome sequencing of, two genes encoding sorbosone dehydrogenases, one derived from the chromosome (named as) and one from plasmid (named as), were introduced into an industrial strainThe overexpression of genehad hardly effect on 2-KGA production, and the overexpression of geneproduced an obvious byproduct in the fermentation broth. Combinational expression ofwith(obtainingandmodules) inresulted in the similar fermentation phenotype to two previous strains. After serial sub-cultivation of co-culturedwith each engineeredfor 50 d, the conversion rate of 2-KGA increased by 15.4%, 179%, 0.65% and 125% compared with that of the parentalwith. This study shows that adaptive evolution of microbial consortium is an effective strategy to increase the fitness between functional modules and chassis, thus quickly getting better strains for production of 2-KGA.

    , L-sorbosone dehydrogenase, fitness, adaptive evolution, mixed culture system

    December 10, 2015; Accepted: January 15, 2016

    Mingzhu Ding. Tel: +86-22-60973987; E-mail: mzding@tju.edu.cn

    Supported by:National Basic Research and Development Program of China (973 Program) (No. 2014CB745100), National Natural Science Foundation of China (No. 21390203), the Ph.D Programs Foundation of Ministry of Education of China (No. 20120032120013).

    國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃 (973計劃) (No. 2014CB745100),國家自然科學(xué)基金 (No. 21390203),教育部博士點(diǎn)基金新教師類課題 (No. 20120032120013) 資助。

    陳思, 賈楠, 丁明珠, 等. 山梨酮脫氫酶模塊與酮古龍酸桿菌底盤細(xì)胞的適配分析. 生物工程學(xué)報, 2016, 32(9): 1224–1232.

    Chen S, Jia N, Ding MZ, et al. Fitness analysis between the L-sorbosone dehydrogenase modules andchassis. Chin J Biotech, 2016, 32(9): 1224–1232.

    猜你喜歡
    產(chǎn)酸量山梨糖混菌
    十二碳二元酸菌種發(fā)酵工藝優(yōu)化
    三種因素對混菌固態(tài)發(fā)酵飼料品質(zhì)的影響
    中國飼料(2022年5期)2022-04-26 13:42:36
    三氯化鐵催化山梨糖醇醚化反應(yīng)的研究
    微液滴適應(yīng)性進(jìn)化強(qiáng)化大腸桿菌耐受高濃度L-山梨糖
    混菌固態(tài)發(fā)酵榛仁粕制備降血壓肽工藝優(yōu)化研究
    產(chǎn)D-乳酸的德氏乳桿菌保加利亞亞種發(fā)酵工藝研究
    提高維生素C發(fā)酵中山梨醇轉(zhuǎn)化率的自動控制補(bǔ)料方法研究
    熱帶醋酸桿菌B104發(fā)酵條件的優(yōu)化研究
    中國釀造(2015年5期)2015-04-24 11:31:40
    山梨糖與羥脯氨酸的美拉德反應(yīng)條件優(yōu)化及抗氧化研究
    椰果表面混菌生物膜培養(yǎng)條件優(yōu)化
    在线天堂最新版资源| 深夜a级毛片| 国产色婷婷99| 国产欧美日韩一区二区精品| 精品久久国产蜜桃| 日本与韩国留学比较| 91在线观看av| 亚洲av电影不卡..在线观看| www.www免费av| 欧美黑人欧美精品刺激| 亚洲专区中文字幕在线| 99国产精品一区二区三区| 国产在线精品亚洲第一网站| 欧美色欧美亚洲另类二区| 免费人成视频x8x8入口观看| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 在线天堂最新版资源| 99久久九九国产精品国产免费| 亚洲午夜理论影院| 欧美一级a爱片免费观看看| 免费在线观看成人毛片| 久99久视频精品免费| 欧美在线一区亚洲| 国产精品女同一区二区软件 | 亚洲,欧美,日韩| 国产高清三级在线| 亚洲av不卡在线观看| 男人的好看免费观看在线视频| 免费看美女性在线毛片视频| 色吧在线观看| 亚洲精品成人久久久久久| 成年版毛片免费区| 国产精品一区二区免费欧美| 亚洲欧美激情综合另类| 97热精品久久久久久| 亚洲自偷自拍三级| 在线观看av片永久免费下载| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 啦啦啦韩国在线观看视频| 两人在一起打扑克的视频| 日本一二三区视频观看| 淫秽高清视频在线观看| 久久精品影院6| 亚洲激情在线av| 久久国产乱子伦精品免费另类| 此物有八面人人有两片| 日韩中文字幕欧美一区二区| 男女那种视频在线观看| 美女 人体艺术 gogo| 啪啪无遮挡十八禁网站| 久久6这里有精品| 97超视频在线观看视频| 国产精品av视频在线免费观看| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 麻豆成人av在线观看| 久久国产精品影院| 搡老熟女国产l中国老女人| 亚洲一区高清亚洲精品| 日韩高清综合在线| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 久久久久久大精品| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 欧美+日韩+精品| 亚洲美女搞黄在线观看 | 日韩精品青青久久久久久| 永久网站在线| 亚洲av五月六月丁香网| 亚洲第一区二区三区不卡| 婷婷精品国产亚洲av在线| 亚洲 国产 在线| 日韩免费av在线播放| 亚洲自拍偷在线| 久久国产乱子免费精品| 欧美在线黄色| 国产精品一区二区三区四区久久| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 亚洲精品成人久久久久久| 亚洲一区二区三区色噜噜| 欧美不卡视频在线免费观看| 亚洲中文日韩欧美视频| 男女那种视频在线观看| 中文字幕免费在线视频6| 51国产日韩欧美| 久久性视频一级片| 嫩草影院入口| 一个人免费在线观看电影| 国产一区二区在线av高清观看| 草草在线视频免费看| 亚洲真实伦在线观看| 身体一侧抽搐| 动漫黄色视频在线观看| 亚洲色图av天堂| 天天一区二区日本电影三级| 人人妻人人看人人澡| 脱女人内裤的视频| 国产在线精品亚洲第一网站| av专区在线播放| 欧美一级a爱片免费观看看| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 久久精品影院6| 欧美日本亚洲视频在线播放| 精品一区二区三区人妻视频| 国产精品亚洲一级av第二区| 欧美区成人在线视频| 亚洲av二区三区四区| 国内精品一区二区在线观看| 欧美激情国产日韩精品一区| 91九色精品人成在线观看| 老司机深夜福利视频在线观看| 在线播放无遮挡| 欧美激情国产日韩精品一区| 日韩国内少妇激情av| 欧美日韩国产亚洲二区| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 精品久久久久久久久久免费视频| 亚洲欧美精品综合久久99| 99热这里只有是精品在线观看 | 级片在线观看| 日韩大尺度精品在线看网址| 精品久久久久久久久久免费视频| 欧美一级a爱片免费观看看| 精品99又大又爽又粗少妇毛片 | 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 亚洲国产精品久久男人天堂| 精品午夜福利视频在线观看一区| 人人妻人人澡欧美一区二区| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 少妇高潮的动态图| 小说图片视频综合网站| 久久精品人妻少妇| 国产三级在线视频| 热99在线观看视频| 国产成人福利小说| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 午夜激情欧美在线| 精品欧美国产一区二区三| 日韩高清综合在线| 国产精品伦人一区二区| 免费观看精品视频网站| 十八禁国产超污无遮挡网站| 搡老熟女国产l中国老女人| 熟女电影av网| 村上凉子中文字幕在线| 搡女人真爽免费视频火全软件 | 午夜精品在线福利| 亚洲国产精品成人综合色| 久久久久久大精品| 亚洲最大成人av| 一个人免费在线观看电影| 日本免费a在线| 俄罗斯特黄特色一大片| 老鸭窝网址在线观看| 日本 欧美在线| 精品乱码久久久久久99久播| 人人妻人人澡欧美一区二区| 国产三级在线视频| 久久亚洲精品不卡| 婷婷精品国产亚洲av在线| 国产一区二区三区视频了| 国产精品一区二区性色av| 免费在线观看影片大全网站| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 国产免费男女视频| 少妇人妻精品综合一区二区 | 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 久久久久免费精品人妻一区二区| h日本视频在线播放| 免费看a级黄色片| 床上黄色一级片| 岛国在线免费视频观看| 在现免费观看毛片| 精品99又大又爽又粗少妇毛片 | 午夜精品一区二区三区免费看| 欧美高清性xxxxhd video| 99精品在免费线老司机午夜| 国语自产精品视频在线第100页| 1000部很黄的大片| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 亚洲电影在线观看av| 在线观看一区二区三区| 偷拍熟女少妇极品色| 亚洲成av人片免费观看| 又爽又黄无遮挡网站| 三级毛片av免费| 久久久色成人| 国产视频内射| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 怎么达到女性高潮| 久久久久免费精品人妻一区二区| 国产色婷婷99| 欧美3d第一页| 国产精华一区二区三区| 免费在线观看成人毛片| 日本 av在线| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 亚洲av免费高清在线观看| 亚洲人成网站在线播| 18+在线观看网站| 欧美激情国产日韩精品一区| 好男人电影高清在线观看| 亚洲美女视频黄频| 香蕉av资源在线| 亚洲18禁久久av| 中亚洲国语对白在线视频| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 搡老熟女国产l中国老女人| 国产高清视频在线播放一区| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 天美传媒精品一区二区| 亚洲欧美激情综合另类| 成人精品一区二区免费| 欧美日韩黄片免| 亚洲 国产 在线| 神马国产精品三级电影在线观看| 午夜影院日韩av| 少妇被粗大猛烈的视频| 精品一区二区免费观看| 精品乱码久久久久久99久播| 在线免费观看的www视频| 制服丝袜大香蕉在线| 日韩高清综合在线| 成年免费大片在线观看| 老司机午夜十八禁免费视频| 成人性生交大片免费视频hd| 久久午夜福利片| 一本一本综合久久| 久久性视频一级片| 国产精华一区二区三区| 亚洲国产高清在线一区二区三| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 亚洲国产欧洲综合997久久,| 日韩欧美免费精品| 国产美女午夜福利| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 欧美最新免费一区二区三区 | 丰满乱子伦码专区| 精品人妻熟女av久视频| 老师上课跳d突然被开到最大视频 久久午夜综合久久蜜桃 | 欧美精品啪啪一区二区三区| 国产三级中文精品| 黄色视频,在线免费观看| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 久久久久久久久久黄片| bbb黄色大片| 亚洲最大成人中文| 久久中文看片网| 日韩有码中文字幕| 国产精品亚洲美女久久久| 男人舔女人下体高潮全视频| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 脱女人内裤的视频| 2021天堂中文幕一二区在线观| 成人无遮挡网站| 99精品在免费线老司机午夜| 村上凉子中文字幕在线| 男女之事视频高清在线观看| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 男女那种视频在线观看| 亚洲第一区二区三区不卡| 精品午夜福利在线看| 一区二区三区四区激情视频 | 国产成人欧美在线观看| 91九色精品人成在线观看| av在线观看视频网站免费| 亚洲av电影在线进入| 国产真实乱freesex| 看免费av毛片| 黄色配什么色好看| av在线蜜桃| 国产不卡一卡二| 丰满乱子伦码专区| 精品欧美国产一区二区三| 亚洲不卡免费看| 黄色一级大片看看| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 国产一区二区在线av高清观看| 亚洲av免费高清在线观看| 老司机午夜福利在线观看视频| 欧美日韩国产亚洲二区| 午夜影院日韩av| 搡老岳熟女国产| or卡值多少钱| 日韩亚洲欧美综合| 蜜桃久久精品国产亚洲av| xxxwww97欧美| 国产精品一区二区免费欧美| .国产精品久久| 大型黄色视频在线免费观看| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 成年免费大片在线观看| 国产成+人综合+亚洲专区| 亚洲国产精品999在线| 观看美女的网站| 性欧美人与动物交配| 婷婷亚洲欧美| 国产精品免费一区二区三区在线| 欧美色视频一区免费| 日本在线视频免费播放| 99久久九九国产精品国产免费| 他把我摸到了高潮在线观看| 美女cb高潮喷水在线观看| 欧美另类亚洲清纯唯美| h日本视频在线播放| 丰满人妻一区二区三区视频av| 给我免费播放毛片高清在线观看| 午夜久久久久精精品| 身体一侧抽搐| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 久久草成人影院| 国内精品一区二区在线观看| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 亚洲欧美清纯卡通| 99热精品在线国产| 日本与韩国留学比较| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 午夜福利成人在线免费观看| 内射极品少妇av片p| 国产男靠女视频免费网站| 90打野战视频偷拍视频| 国产真实乱freesex| 亚洲人成网站高清观看| 欧美区成人在线视频| 最新中文字幕久久久久| 极品教师在线免费播放| 简卡轻食公司| 国产色婷婷99| 亚洲国产高清在线一区二区三| 在线免费观看的www视频| 真人一进一出gif抽搐免费| 国产探花在线观看一区二区| 午夜福利高清视频| 床上黄色一级片| 精品一区二区三区视频在线| 国产色爽女视频免费观看| 在线a可以看的网站| 久久久成人免费电影| 99在线视频只有这里精品首页| 日本一本二区三区精品| 中文亚洲av片在线观看爽| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 麻豆国产av国片精品| 日本在线视频免费播放| 亚洲av二区三区四区| 久久久成人免费电影| 免费人成视频x8x8入口观看| 国产成人啪精品午夜网站| 18+在线观看网站| 欧美三级亚洲精品| 国产91精品成人一区二区三区| 丰满乱子伦码专区| 亚洲成a人片在线一区二区| 午夜免费男女啪啪视频观看 | 欧美zozozo另类| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 美女xxoo啪啪120秒动态图 | 3wmmmm亚洲av在线观看| 免费观看的影片在线观看| 91在线观看av| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 亚洲最大成人手机在线| 日日夜夜操网爽| 国产野战对白在线观看| 中国美女看黄片| av专区在线播放| 久久精品国产自在天天线| 最后的刺客免费高清国语| 麻豆一二三区av精品| 久久精品国产自在天天线| 91在线观看av| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 熟女人妻精品中文字幕| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 一级毛片久久久久久久久女| 日本一本二区三区精品| 亚洲精品亚洲一区二区| 欧美zozozo另类| 免费观看精品视频网站| 无遮挡黄片免费观看| 午夜老司机福利剧场| 免费一级毛片在线播放高清视频| 波多野结衣高清无吗| 一区二区三区四区激情视频 | www.熟女人妻精品国产| 久久国产精品影院| 精品乱码久久久久久99久播| 给我免费播放毛片高清在线观看| 亚洲人成网站高清观看| 两个人的视频大全免费| 九九热线精品视视频播放| 亚洲成a人片在线一区二区| 国语自产精品视频在线第100页| 亚洲av免费在线观看| 国产日本99.免费观看| 国产毛片a区久久久久| 美女黄网站色视频| 精品欧美国产一区二区三| 成人一区二区视频在线观看| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 91在线精品国自产拍蜜月| 国产av一区在线观看免费| 日韩免费av在线播放| 日本免费a在线| 老女人水多毛片| 亚洲欧美日韩无卡精品| 69av精品久久久久久| 色av中文字幕| 免费av不卡在线播放| 国产私拍福利视频在线观看| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 99久久九九国产精品国产免费| 成年女人永久免费观看视频| 国产精品永久免费网站| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 天天躁日日操中文字幕| 国产伦精品一区二区三区四那| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 亚洲真实伦在线观看| 99国产精品一区二区蜜桃av| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 亚洲成人中文字幕在线播放| 亚洲国产色片| 亚洲经典国产精华液单 | 美女被艹到高潮喷水动态| av欧美777| 久99久视频精品免费| av天堂中文字幕网| 亚洲无线在线观看| 精品久久久久久久久久免费视频| 99国产极品粉嫩在线观看| 国模一区二区三区四区视频| 少妇的逼水好多| 国产精品av视频在线免费观看| 无人区码免费观看不卡| av天堂中文字幕网| 一个人免费在线观看电影| 国产精品电影一区二区三区| 婷婷六月久久综合丁香| 欧美黄色淫秽网站| 日本黄大片高清| 亚洲五月婷婷丁香| 国产精品久久久久久久电影| 欧美黑人巨大hd| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 日日干狠狠操夜夜爽| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 女人被狂操c到高潮| 婷婷精品国产亚洲av在线| 国产亚洲av嫩草精品影院| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 男女下面进入的视频免费午夜| 成人性生交大片免费视频hd| 99视频精品全部免费 在线| 久久久久久久精品吃奶| 亚洲成av人片在线播放无| 亚洲熟妇熟女久久| 真实男女啪啪啪动态图| avwww免费| 亚洲成a人片在线一区二区| 日韩人妻高清精品专区| 在现免费观看毛片| 免费av不卡在线播放| 有码 亚洲区| 怎么达到女性高潮| 国产精品免费一区二区三区在线| 日韩欧美在线二视频| 亚洲精品成人久久久久久| 亚洲人与动物交配视频| 婷婷亚洲欧美| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 成人毛片a级毛片在线播放| 桃红色精品国产亚洲av| 一级黄色大片毛片| 一夜夜www| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 十八禁网站免费在线| 级片在线观看| 婷婷六月久久综合丁香| 校园春色视频在线观看| 午夜免费成人在线视频| 真人一进一出gif抽搐免费| 女同久久另类99精品国产91| 欧美成人a在线观看| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 制服丝袜大香蕉在线| 免费av观看视频| 久久久久久久久久黄片| 国产精品永久免费网站| 在线观看一区二区三区| 国产v大片淫在线免费观看| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 亚洲人与动物交配视频| 国产精品综合久久久久久久免费| 真人一进一出gif抽搐免费| 久久精品91蜜桃| 最近最新免费中文字幕在线| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 中文字幕久久专区| 又粗又爽又猛毛片免费看| 国产精品久久久久久久电影| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 久久久久久国产a免费观看| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 国产成年人精品一区二区| 中文在线观看免费www的网站| 国产主播在线观看一区二区| 成熟少妇高潮喷水视频| 成人三级黄色视频| 日本黄色片子视频| 亚洲真实伦在线观看| 99热6这里只有精品| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 一个人免费在线观看电影| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 欧美一区二区亚洲| 99精品在免费线老司机午夜| 国产黄a三级三级三级人| av在线老鸭窝| 亚州av有码| 精品一区二区三区av网在线观看| 国产精品一及| 久久国产精品人妻蜜桃| 国产精品免费一区二区三区在线| 老女人水多毛片| 黄片小视频在线播放| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 国产精品av视频在线免费观看| 亚洲av电影不卡..在线观看| av欧美777| 直男gayav资源| 一区福利在线观看| 国产精品永久免费网站| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 精品久久久久久久久久久久久| 国产高清激情床上av| 级片在线观看| 在线免费观看的www视频| 亚洲人成网站高清观看| 久久久久久久久久黄片| 欧美一级a爱片免费观看看| 国产成年人精品一区二区| 国产在线精品亚洲第一网站| 久久久久久久久久黄片| 国产 一区 欧美 日韩| 精华霜和精华液先用哪个| 日本黄色片子视频| 亚洲成人中文字幕在线播放| 人妻久久中文字幕网| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 亚洲久久久久久中文字幕| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 久久伊人香网站| 午夜福利在线在线| 国产精品亚洲av一区麻豆| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | 变态另类丝袜制服| 脱女人内裤的视频| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 赤兔流量卡办理| 亚洲性夜色夜夜综合| 欧美乱色亚洲激情| 色播亚洲综合网| 国产熟女xx| 69人妻影院| 亚洲av二区三区四区| a在线观看视频网站| 国产午夜福利久久久久久| 亚洲欧美日韩高清专用| 好男人电影高清在线观看| 麻豆av噜噜一区二区三区| 久久人人精品亚洲av| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 亚洲美女黄片视频| 午夜福利成人在线免费观看| 亚洲片人在线观看| 精品久久久久久成人av| 最好的美女福利视频网| 最近在线观看免费完整版| 身体一侧抽搐| 真人一进一出gif抽搐免费| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 久久6这里有精品| 久久国产精品影院| 亚洲国产色片| 亚洲真实伦在线观看| 精品日产1卡2卡| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 久久国产精品人妻蜜桃| 床上黄色一级片| 国产精品不卡视频一区二区 | 国产熟女xx| 狠狠狠狠99中文字幕| 一个人看的www免费观看视频| 午夜免费激情av| 成人av一区二区三区在线看| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 欧美bdsm另类| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 亚洲av成人av| 欧美日韩国产亚洲二区| 欧美黑人巨大hd| 亚洲第一区二区三区不卡| 可以在线观看的亚洲视频| 久久国产乱子免费精品| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 欧美黑人欧美精品刺激| 18+在线观看网站| 欧美成人性av电影在线观看| 亚洲av二区三区四区| 精品欧美国产一区二区三| 国产野战对白在线观看|