綿羊胚胎不同發(fā)育階段及其組織中MicroRNA-483-5p表達分析

張譯元，唐 紅，郭延華，王新華，王立民，周 平

(新疆農(nóng)墾科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所/新疆兵團綿羊繁育生物技術(shù)重點實驗室，新疆石河子　832000)

?

綿羊胚胎不同發(fā)育階段及其組織中MicroRNA-483-5p表達分析

張譯元，唐 紅，郭延華，王新華，王立民，周 平

(新疆農(nóng)墾科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所/新疆兵團綿羊繁育生物技術(shù)重點實驗室，新疆石河子832000)

【目的】研究MicroRNA(miR)483-5p在中國美利奴羊胚胎不同發(fā)育階段腎臟和臍帶組織中的表達變化，以了解其在綿羊胚胎發(fā)育中的重要作用?！痉椒ā窟x擇中國美利奴羊胚胎不同發(fā)育時期(45、85、115和135 d 4個時期)腎臟和臍帶組織為研究材料，采用半定量RT-PCR檢測第45 d 綿羊胚胎不同組織中miR-483-5p的表達；同時利用實時熒光定量 PCR對miR-483-5p在綿羊胚胎不同發(fā)育階段腎臟和臍帶組織的表達變化進行實時檢測?！窘Y(jié)果】miR-483-5p在所檢測的綿羊45 d胚胎各組織中廣泛表達，其中以肌肉、心臟和肺臟組織表達豐度最高。實時熒光定量PCR結(jié)果顯示，不同發(fā)育階段綿羊胚胎腎臟和臍帶組織miR-483-5p的表達具有明顯的時空選擇性。臍帶組織miR-483-5p隨著胚胎發(fā)育其表達量呈逐漸下降的趨勢；腎臟組織miR-483-5p則是隨著胚胎發(fā)育在第85 d其表達量下降到最低，其后在115和135 d其表達量又逐漸上升。不同發(fā)育階段胚胎腎臟、臍帶組織miR-483-5p的表達量呈顯著性差異(P<0.05)。【結(jié)論】miR-483-5p在綿羊胚胎不同發(fā)育階段腎臟或臍帶組織中表達明顯不同，表明其表達具有選擇性；依據(jù)miR-483-5p表達的差異性及其涉及的生物學(xué)功能，推測miR-483-5p在綿羊臍帶和腎臟組織中具有一定的調(diào)控作用。研究為進一步了解miR-483-5p在胚胎腎臟和臍帶發(fā)育中的作用機制提供一定的理論依據(jù)。

綿羊；胚胎；miR-483-5p；表達分析

0　引 言

【研究意義】MicroRNA (miRNA，亦稱微RNA) 是一類長約22個核苷酸的小分子非編碼RNA。miRNA主要通過與靶基因mRNA的特定位點結(jié)合，抑制該蛋白的合成或誘導(dǎo)mRNA的降解，從而參與基因的表達調(diào)控[1,2]。miRNA在各種生物中普遍存在，據(jù)統(tǒng)計大約有30%左右的功能基因表達受控于miRNA。這些miRNA只在特定的組織表達[3]。自1993年Lee等[4]在線蟲中發(fā)現(xiàn)第一條miRNA lin-4以來，研究人員陸續(xù)從動物的線蟲、果蠅(Drosophila)、家鼠(Musmusculus)、人(Homosapiens)以及植物的擬南芥等生物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了超過3 000多種miRNA[1,5,6,7]。這些miRNA的功能不但涉及調(diào)控胚胎發(fā)育、細胞增殖、細胞凋亡、細胞死亡、脂肪代謝、細胞分化等方面，還與動物生殖，如卵巢生物學(xué)過程[8,9]、乳腺[10]、睪丸[11]、肌肉[12]等方面息息相關(guān)。miRNAs在動物胚胎發(fā)育中可能起到作用有：在不同發(fā)育周期的空間和時間上調(diào)控某些基因的表達；參與調(diào)控雄性生殖細胞的發(fā)生過程，尤其是生殖細胞的減數(shù)分裂過程；參與胚胎的背腹模式、前后模式、四肢、神經(jīng)系統(tǒng)的形成等?！厩叭搜芯窟M展】miRNA 483-5p是一類具有重要功能的miRNA。已有研究表明，miR-483-5p調(diào)控胰島素樣生長因子2 (亦稱生長調(diào)節(jié)素A) (insulin-like growth factor,IGF2)[13]，IGF2是一種內(nèi)源性印記基因，其在哺乳動物的胚胎發(fā)育過程中起著非常重要的作用。IGF2基因的表達產(chǎn)物IGF2是由前體物質(zhì)通過蛋白質(zhì)水解、加工而形成的單鏈蛋白質(zhì)，由67個氨基酸組成，是胚胎性生長因子[14]。Ning等[15]研究表明，給予廣西巴馬小型豬(Guangxi Bama Mini-pig)供體細胞注射TSA和5-aza-dC能夠?qū)е翴GF2的表達水平顯著升高，體細胞與囊胚的DNA甲基化水平顯著降低，囊胚的成活率顯著提高(由16%提高到25.6%)，提示IGF2可能是胚胎正常發(fā)育過程重要的調(diào)控因子。Gong等[16]研究顯示，超大出生并伴隨心臟與肺臟發(fā)育異常的克隆牛(Bostaurus)腎臟組織IGF2的表達水平極顯著高于正常生理狀態(tài)的克隆牛，進一步說明IGF2基因與動物胚胎發(fā)育正常與否密切相關(guān)。Rojas等[17]利用免疫組化技術(shù)對發(fā)育不良性多囊腎病的人(Homosapiens)胎兒腎臟組織IGF2的表達情況進行了跟蹤檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IGF2基因在阻塞性腎臟組織中呈高豐度表達。在小鼠(Musmusculus)中，miR-483-5p主要結(jié)合在IGF2基因的第二內(nèi)含子區(qū)并調(diào)控此基因的表達[13]。目前有關(guān)miR-483-5p的研究與報道主要以疾病治療等方面為主，至今未見有關(guān)哺乳動物miR-483-5p介導(dǎo)胚胎發(fā)育機理方面的報道。【本研究切入點】近年來，隨著分子技術(shù)的不斷更新，利用轉(zhuǎn)基因手段進行動物分子育種成為國內(nèi)外研究熱點，但不可忽視的是轉(zhuǎn)基因動物胎兒流產(chǎn)率較高，究其實質(zhì)是由胎兒和胎盤異常引起的。臍帶是連接胎兒與母體的重要通道，是胎兒與母體進行營養(yǎng)和代謝物質(zhì)的交換中心；腎臟是動物機體重要的排泄器官，在維持機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定方面扮演著重要的角色。因此從分子水平研究綿羊胚胎臍帶與腎臟的發(fā)育機制具有深遠的科學(xué)實踐意義?！緮M解決的關(guān)鍵問題】實驗室前期通過生物信息學(xué)軟件篩選出可能與IGF2發(fā)生互作的miRNA，結(jié)合Ma等[13]的實驗結(jié)果，推測miR-483-5p可能是影響綿羊胚胎發(fā)育的重要候選miRNA?；诖?，研究獲得了綿羊miR-483-5p成熟體序列；并對其進行組織表達譜分析，同時檢測胚胎不同發(fā)育階段綿羊臍帶和腎臟組織miR-483-5p的表達變化規(guī)律，為進一步了解miR-483-5p在臍帶和腎臟中的具體生物學(xué)功能積累基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1　材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 實驗動物與樣品采集

選擇秋季(8月)購買年齡相近(3～4歲)、健康的中國美利奴成年母羊(購于新疆兵團紫泥泉羊場)15只，在新疆農(nóng)墾科學(xué)院種羊場進行統(tǒng)一飼養(yǎng)。待其生理狀況穩(wěn)定后，通過公羊早晚試情并配種，記錄配種時間，B超儀結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察確定羊只妊娠與否。分別于妊娠45、85、115和135 d時手術(shù)摘取成年母羊妊娠胎兒各3只，迅速采集其心臟、肝臟、腎臟、肺臟、肌肉以及臍帶等組織樣品，置于液氮中保存，以供備用。

1.1.2 主要試劑及儀器

Trizol Reagent試劑、M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于Invitrogen公司(美國)；實時熒光定量PCR反應(yīng)試劑盒(Faster Start Essential DNA Green Master)、LightCycler 480定量儀購于Roche公司(美國)；組織勻漿器(Precellys 24，法國Bertin公司)、核酸蛋白分析儀(美國BIO-RAD公司)。

1.2 方 法

1.2.1 總RNA的提取及cDNA合成

按照Trizol Reagent試劑盒說明書提取45 d中國美利奴羊胚胎心臟、肝臟、肺臟、腎臟、肌肉、臍帶等組織與胚胎不同發(fā)育階段(85、115及135 d)腎臟與臍帶組織的總RNA。0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，核酸蛋白分析儀檢測其純度和濃度。采用Invitrogen公司的M-MLV第一鏈合成試劑盒制備各樣品cDNA。反應(yīng)體系(20 μL)為：5×第一鏈合成緩沖液 4 μL，0.1M DTT 2 μL，10 mM dNTP混合物1 μL，模板(總RNA) 2 μg，引物 2 pmol，RNaseOUTTM核酸酶抑制劑1 μL，M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶(200U) 1 μL。按照試劑盒操作說明中的程序進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：37℃ 50 min，75℃ 15 min。得到的cDNA置于-20℃保存，以供備用。

1.2.2引物的設(shè)計和合成

從miRbase (http://www.miRbase.org)數(shù)據(jù)庫中搜索mus-miR-483-5p成熟體序列設(shè)計引物，反轉(zhuǎn)錄引物：5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCTCCCTTC-3’；設(shè)計miR-483-5p的實時熒光定量PCR上游引物：5’-ACACTCCAGCTGGGAAGACGGGAGGA AAGA -3’，下游引物為通用引物：5’- CTCAACTGGTGTCGTGGAGTC -3’；內(nèi)參基因為5 s，反轉(zhuǎn)錄引物：5’- CTCAACTGGTGTCGTGG-3’，實時熒光定量PCR上游引物：5’- ACACTCCAG CTGGGGAA-3’，下游引物為通用引物(同上)，所有引物均由Invitrogen公司進行合成。

1.2.3 綿羊miR-483-5p成熟體序列的克隆

以反轉(zhuǎn)錄得到的第一鏈cDNA為模板進行RT-PCR擴增，PCR反應(yīng)體系25 μL，其中cDNA模板1 μL、10×TaqBuffer 2.5 μL、dNTPs 2 μL、上下游引物(10 mmol/L)各0.5 μL、TaqDNA聚合酶0.5 μL、ddH2O 18 μL。PCR循環(huán)體系：94℃ 5 min；94℃ 20 s，60℃ 20 s，72℃ 20 s，共35個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。擴增結(jié)束后，瓊脂糖凝膠電泳檢測條帶的大小，并選擇目的條帶進行切膠回收送交北京華諾時代科技有限公司進行測序。

1.2.4miR-483-5p的組織表達譜

以中國美利奴羊45 d胚胎心臟、肝臟、腎臟、肺臟、肌肉、臍帶cDNA為模板進行半定量RT-PCR擴增。①最佳擴增循環(huán)數(shù)的確定：先以5 s為內(nèi)參基因進行PCR擴增，產(chǎn)物利用2.5%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，通過灰度值確定指數(shù)擴增期的最佳循環(huán)數(shù)；②初始模板濃度的確定：根據(jù)5 s指數(shù)擴增期PCR產(chǎn)物灰度值調(diào)整各組織cDNA初始模板濃度，并與miR- 483-5p指數(shù)擴增期PCR產(chǎn)物灰度值進行比較；③半定量RT-PCR：PCR反應(yīng)體系25 μL，其中10×TaqBuffer 2.5 μL、dNTPs 2 μL、上下游引物(10 mmol/L)各0.5 μL、TaqDNA聚合酶0.5 μL、ddH2O 18 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃ 5 min；94℃ 20 s，60℃ 20 s，72℃ 20 s，共30個循環(huán)；然后72℃延伸10 min。半定量分析miR-483-5p在不同組織中的相對表達量。

1.2.5miR-483-5p在中國美利奴羊胚胎不同發(fā)育階段腎臟和臍帶組織中的表達變化規(guī)律

以中國美利奴羊45、85、115和135 d胚胎的腎臟和臍帶組織cDNA為模板，以5 s為內(nèi)參基因，按照Faster Start Essential DNA Green Master試劑盒操作程序，采用SYBR Green I染料法對miR-483-5p的表達進行實時定量PCR檢測。實時熒光定量PCR反應(yīng)體系20 μL：2×Master Mix 10 μL、cDNA模板 1 μL、Forward Primer 0.4 μL、Reverse Primer 0.4 μL、ddH2O 8.2 μL，每個樣品設(shè)3個生物學(xué)重復(fù)，并設(shè)置相應(yīng)的陰性對照。PCR反應(yīng)條件：95℃ 5 min、95℃ 10 s、60℃ 20 s、72℃ 20 s，共計45個循環(huán)；擴增反應(yīng)結(jié)束后進行溶解曲線分析。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

熒光定量數(shù)據(jù)分析：以中國美利奴羊45 d胚胎的腎臟和臍帶組織miR-483-5p的表達量為1，以持家基因5 s為參照，Ct法(Qr=2-ΔΔCt)分析中國美利奴羊胚胎不同發(fā)育階段腎臟和臍帶組織miR-483-5p的相對表達量。

2　結(jié)果與分析

2.1中國美利奴羊miR-483-5p成熟體的擴增

以中國美利奴羊腎臟cDNA為模板，經(jīng)RT-PCR擴增獲得了一條長度為73 bp的序列片段，與預(yù)期大小相一致，將該序列與GenBank中公布的miR-483-5p成熟體序列比對發(fā)現(xiàn)，是實驗所需的目的片段。

2.2 綿羊45 d胚胎不同組織miR-483-5p的組織表達譜

5 s基因在31和32個循環(huán)時目的條帶亮度基本保持一致，說明擴增已進入平臺期，其中在30個循環(huán)GAPDH基因以指數(shù)形式擴增，因此確定30個循環(huán)為擴增循環(huán)數(shù)。

以5 s為內(nèi)參基因，利用半定量RT-PCR對中國美利奴羊45 d胚胎的心臟、肝臟、肺臟、腎臟、肌肉、臍帶組織中miR-483-5p表達情況進行了初步檢測。結(jié)果顯示，5 s在各個組織中呈高豐度表達，條帶亮度基本一致，可以作為內(nèi)參來定量miR-483-5p基因的表達。經(jīng)檢測， miR-483-5p在中國美利奴羊45 d胚胎心臟、肝臟、腎臟、肺臟、肌肉、臍帶中均有表達。其中，miR-483-5p在心臟、肺臟以及肌肉組織中呈高豐度表達，在肝臟、腎臟和臍帶組織中的表達量相對較低；心臟、肌肉、肺臟組織miR-483-5p的相對表達量均極顯著高于肝臟、腎臟和臍帶組織(P<0.01)。圖1

注：小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)，大寫字母不同表示差異極顯著(P<0.01)，字母相同表示差異不顯著(P>0.05)，下同

Note：The different small letters mean the difference atP<0.05, the different capital letters mean the difference atP<0.01, and the same letters means less obvious difference atP>0.05，the same as below

圖1綿羊45 d胚胎不同組織miR-483-5p的表達
Fig.1 Analysis of the relative expression of miR-483-5p in different tissues of 45 d sheep embryos

2.3 miR-483-5p在中國美利奴羊胚胎不同發(fā)育階段腎臟和臍帶組織中的表達變化規(guī)律

為了進一步了解miR-483-5p對中國美利奴羊胚胎發(fā)育的影響，研究對中國美利奴羊胚胎不同發(fā)育階段腎臟與臍帶組織miR-483-5p的表達變化情況進行了實時熒光定量PCR檢測。研究采用相對定量方法，以5 s為內(nèi)參基因，并定義miR-483-5p基因在45 d胚胎的腎臟和臍帶組織表達水平為1，以便于對miR-483-5p在中國美利奴羊胚胎不同發(fā)育階段腎臟和臍帶組織的表達水平進行相對定量。圖2

2.3.1腎臟組織

miR-483-5p在中國美利奴羊胚胎不同發(fā)育階段的表達量由高到低為：135 d>115 d>45 d>85 d，miR-483-5p在45、115和135 d腎臟的表達量呈高豐度表達，在85 d的表達量相對較低；胚胎不同發(fā)育階段腎臟組織間miR-483-5p的表達量呈顯著性差異(P<0.05)，45、115和135 d腎臟組織miR-483-5p的表達量顯著高于85 d (P<0.05)，而45、115和135 d的表達量無明顯差異(P<0.05)。

2.3.2臍帶組織

臍帶組織miR-483-5p的表達量則是隨著天數(shù)的增加表達量呈逐漸下降的趨勢，其表達量由高到低為：45 d>85 d>115 d>135 d。不同發(fā)育階段臍帶組織間miR-483-5p的表達量呈顯著性差異(P<0.05)，45 d臍帶組織miR-483-5p的表達量顯著高于85、115和135 d (P<0.05)，其他三個發(fā)育階段臍帶組織miR-483-5p的表達量無明顯差異(P>0.05)。

圖 2綿羊胚胎不同發(fā)育階段腎臟和臍帶組織中miR-483-5p的表達Fig 2Analysis of the relative expression of miR-483-5p in kidney and umbilical cord tissues of sheep embryos at different developmental stages

3　討 論

近年來，miRNA已成為生命科學(xué)領(lǐng)域研究熱點。miRNA是一類廣泛存在于生物機體內(nèi)對基因表達進行微調(diào)的小RNA分子。參與機體一系列重要的生命進程，包括：細胞增殖、胚胎發(fā)育、細胞凋亡、脂質(zhì)代謝等，在調(diào)控發(fā)育中扮演著非常重要的角色[18,19]。這種調(diào)控機制主要通過其與靶基因mRNA的3 UTR區(qū)結(jié)合導(dǎo)致mRNA降解或阻斷mRNA實現(xiàn)的。目前有關(guān)miRNA的定量表達方法主要有兩種：3′端加接頭和stem-loop(頸環(huán)引物)兩種方法，其中頸環(huán)引物qRT-PCR由于其快速、簡單、準確性高等特點，被廣泛地應(yīng)用于miRNA的表達研究[20]。

已有報道m(xù)iR-483-5p靶向定位于基因組常染色體11p15.5IGF2基因第二內(nèi)含子內(nèi)[13]，了解IGF2基因的功能有助于對miR-483-5p功能的研究，IGF2基因除了參與細胞增殖、細胞生長、腫瘤細胞的增值、肌纖維的分化，還參與大腦的發(fā)育、神經(jīng)的旁分泌和自分泌，此外，IGF2基因是與胚胎發(fā)育密切相關(guān)的重要調(diào)控因子[17,21]。另有研究表明，miR-483-5p能夠與MeCP2，F(xiàn)IS1，TGF-β等不同靶標(biāo)基因結(jié)合參與血管形成、炎癥反應(yīng)以及等多種生物學(xué)過程[9,13,22,23]。迄今為止，有關(guān)miR-483-5p在動物胚胎發(fā)育中的研究尚未見到有研究報道，為了解miR-483-5p在中國美利奴羊胚胎不同發(fā)育階段及不同組織中的表達情況，試驗進行了初步研究。

研究首次克隆了綿羊miR-483-5p的成熟序列并對其組織表達譜進行了分析。結(jié)果顯示，miR-483-5p在所檢測的45 d綿羊胚胎心臟、肝臟、肺臟、腎臟、臍帶以及肌肉組織中均有表達，其中在心臟、肝臟和肌肉組織中的表達豐度最高，腎臟和臍帶組織表達相對較低。Ward 等[25]、Shi等[26]、Li等[24]、Song等[27]、Han等[22]研究表明，miR-483-5p在人的心臟、卵巢、肝臟、肺臟、海馬、腎臟等組織中均有表達，與研究結(jié)果相近。與在心臟、肝臟和肌肉組織中高表達相反，miR-483-5p在腎臟和臍帶組織中表達較低，造成這種原因可能是由于miR-483-5p在45 d胚胎腎臟和臍帶發(fā)揮調(diào)控功能導(dǎo)致，具體功能機制還需進一步的實驗論證。

為了進一步了解miR-483-5p對綿羊胚胎發(fā)育的影響，研究重點針對中國美利奴羊不同發(fā)育階段胚胎腎臟和臍帶組織miR-483-5p的表達情況進行了實時定量PCR檢測。結(jié)果表明，腎臟組織miR-483-5p隨著胚胎發(fā)育在第85 d其表達量下降到最低，其后在115 d和135 d其表達量又逐漸上升。不同發(fā)育階段胚胎腎臟組織miR-483-5p的表達量呈顯著性差異(P<0.05)。Liu等[28]研究表明，miR-483-5p存在于IGF2的內(nèi)含子區(qū)，并能夠與IGF2的5′非翻譯區(qū)結(jié)合以正調(diào)控的方式增強胎兒期(成年期不能增強IGF2的轉(zhuǎn)錄)其的轉(zhuǎn)錄；Hale等[29]研究顯示，缺失P2啟動子的成年轉(zhuǎn)IGF2基因小鼠，會導(dǎo)致其體內(nèi)的IGF2量顯著降低，繼而引發(fā)IGF信號通路減弱，最終導(dǎo)致腎小體發(fā)生病變；范秀軍等[30]認為小尾寒羊(Small tailed han sheep)120 d左右胚胎腎小體發(fā)育成熟，結(jié)合實驗的研究結(jié)果，研究推斷，miR-483-5p在綿羊胚胎發(fā)育后期可能通過調(diào)節(jié)IGF2基因的轉(zhuǎn)錄參與了胚胎期腎臟組織的正常發(fā)育。同時研究還發(fā)現(xiàn)，臍帶組織miR-483-5p隨著胚胎發(fā)育其表達量呈逐漸下降的趨勢，這種表達差異是否與臍帶形成初期發(fā)育相關(guān)還有待進一步研究。另外，由于此次采樣僅僅選取了4個胚胎發(fā)育階段，未對其他發(fā)育階段腎臟和臍帶樣品組織進行檢測分析，miR-483-5p確切的生物學(xué)功能尚需進一步的實驗佐證。

4　結(jié) 論

研究獲得了綿羊miR-483-5p的成熟體序列，并利用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測了其在中國美利奴羊胚胎不同發(fā)育階段腎臟和臍帶組織中的表達變化規(guī)律。miR-483-5p在45、115和135 d腎臟的表達量呈高豐度表達，在85 d的表達量相對較低；胚胎不同發(fā)育階段腎臟組織間miR-483-5p的表達量呈顯著性差異(P<0.05)；而在臍帶組織miR-483-5p的表達量則是隨著天數(shù)的增加表達量呈逐漸下降的趨勢，不同發(fā)育階段臍帶組織間miR-483-5p的表達量呈顯著性差異(P<0.05)。研究結(jié)果為進一步研究該miRNA在綿羊胚胎臍帶和腎臟發(fā)育中的功能提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

References)

[1] Matsuyama, R., Okuzaki, D., Okada, M., & Oneyama, C. (2015). Mir-27b suppresses tumor progression by regulating arfgef1 and the focal adhesion signaling.CancerScience.

[2] Liang, B., Yin, J. J., & Zhan, X. R. (2015). Mir-301a promotes cell proliferation by directly targeting timp2 in multiple myeloma.InternationalJournalofClinical&ExperimentalPathology, 8(8):9,168-9,174.

[3]Stark A, Brennecke J, Bushati N, et al. Animal MicroRNAs confer robustness to gene expression and have a significant impact on 3'UTR evolution[J].Cell, 2005, 123(6): 1，133-1，146.

[4]Lee RC, Feinbaum RL, Ambros V. The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14 [J].Cell, 1993, 75(5): 843-854.

[5] Van Wynsberghe, P. M., & Pasquinelli, A. E. (2014). Period homolog lin-42 regulates mirna transcription to impact developmental timing.Worm,3(4):e974453.

[6] Lau, N. C., Lim, L. P., Weinstein, E. G., & Bartel, D. P. (2001). An abundant class of tiny rnas with probable regulatory roles in caenorhabditis elegans.Science, 294(5543):858-862.

[7] Lagos-Quintana, M., Rauhut, R., Yalcin, A., Meyer, J., Lendeckel, W., & Tuschl, T. (2002). Identification of tissue-specific micrornas from mouse.CurrentBiologyCb, 12(9):735-739.

[8] Mcbride, D. ,., Carré, W. ,., Sontakke, S. D., Hogg, C. O., Law, A. ,., & Donadeu, F. X., et al. (2012). Identification of mirnas associated with the follicular-luteal transition in the ruminant ovary.Reproduction, 144(2): 221-233.

[9] Ling YH, Ren CH, Guo XF, et al. Identification and characterization of miRNAs in the ovaries of multiple and uniparous goats (Capra hircus) during follicular phase.BMCGenomics, 2014, 15(1): 339.

[10] Ji, Z., Wang, G., Xie, Z., Zhang, C., & Wang, J. (2012). Identification and characterization of microrna in the dairy goat ( capra hircus ) mammary gland by solexa deep-sequencing technology.MolecularBiologyReports,39(10): 9，361-9，371.

[11] Wu, J., Zhu, H., Song, W., Li, M., Liu, C., & Li, N., et al. (2014). Identification of conservative micrornas in saanen dairy goat testis through deep sequencing.ReproductioninDomesticAnimals, 49(1):32-40.

[12] Zhang, X. D., Zhang, Y. H., Ling, Y. H., Liu, Y., Cao, H. G., & Yin, Z. J., et al. (2013). Characterization and differential expression of micrornas in the ovaries of pregnant and non-pregnant goats (capra hircus).BMCGenomics, 14(10):1-10.

[13] Ning, M., Xidi, W., Yu, Q., Fuyuan, L., Yang, H., & Chaoxia, Z., et al. (2011). Coexpression of an intronic microrna and its host gene reveals a potential role for mir-483-5p as an igf2 partner.Molecular&CellularEndocrinology, 333(333):96-101.

[14] Dechiara, T. M., Robertson, E. J., & Efstratiadis, A. (1991). Parental imprinting of the mouse insulin-like growth factor ii gene.Cell, 64(4):849-859.

[15]Shu-Fang, N., Qing-Yang, L., Ming-Ming, L., Xiao-Gan, Y., Hui-Yan, X., & Yang-Qing, L., et al. (2013). Methylation characteristics and developmental potential of guangxi bama minipig (sus scrofa domestica) cloned embryos from donor cells treated with trichostatin a and 5-aza-2'-deoxycytidine.Zygote, 21(2):1-9.

[16] Z-J, G., Y-Y, Z., Xu, M. ,., Cai, Q. ,., Li, H. ,., & J-B, Y., et al. (2012). Aberrant expression of imprinted genes and their regulatory network in cloned cattle.Theriogenology, 78(4):858-866.

[17] Rojas, C. P., Urbiztondo, A. K., Bruce, J. H., & Rodriguez, M. M. (2011). Comparative immunohistochemical study of multicystic dysplastic kidneys with and without obstruction.Fetal&PediatricPathology, 30(4):209-219.

[18] Kulkarni S, Savan R, Qi Y, et al. Differential microRNA regulation of HLA-C expression and its association with HIV control[J].Nature, 2011, 472(7344): 495-498.

[19] Sonkoly E, Stahle M, Pivarcsi A, et al. MicroRNAs and immunity: novel players in the regulation of normal immune function and inflammation.SeminarsinCancerBiology, 2008, (18): 131-140.

[20] Pieter, M., Tom, F., Nathalie, B., Simone, G., Caifu, C., & Frank, S., et al. (2008). High-throughput stem-loop rt-qpcr mirna expression profiling using minute amounts of input rna.NucleicAcidsResearch, 36(21):345-350.

[21]Ferrón, S. R., Radford, E. J., Domingo-Muelas, A., Kleine, I., Ramme, A., & Gray, D., et al. (2015). Differential genomic imprinting regulates paracrine and autocrine roles of igf2 in adult neurogenesis.NatureCommunications, 6.

[22] Kihoon, H., Vincenzo Alessandro, G., Yoontae, L., Kaifang, P., Kazue, H. T., & Sanaa, C., et al. (2013). Human-specific regulation of mecp2 levels in fetal brains by microrna mir-483-5p.Genes&Development,27(5):485-490.

[23] Song, F., Chen, W. X., Lv, X. B., Tang, Q. L., Sun, L. J., & Liu, B. D., et al. (2015). Mir-483-5p determines mitochondrial fission and cisplatin sensitivity in tongue squamous cell carcinoma by targeting fis1.CancerLetters, 362(2):183-191.

[24] Li, F., Ma, N., Zhao, R., Wu, G., Zhang, Y., & Qiao, Y., et al. (2014). Overexpression of mir-483-5p/3p cooperate to inhibit mouse liver fibrosis by suppressing the tgf-β stimulated hscs in transgenic mice.JournalofCellular&MolecularMedicine, 18(6):966-974.

[25] Ward, J. A., Nada, E., Rahul, P., Freedman, J. E., Keaney, J. F., & Kahraman, T., et al. (2013). Circulating cell and plasma microrna profiles differ between non-st-segment and st-segment-elevation myocardial infarction.FamilyMedicine&MedicalScienceResearch, 2(2):108.

[26] Lin, S., Shan, L., Zhao, W., & Shi, J. (2015). Mir-483-5p and mir-486-5p are down-regulated in cumulus cells of metaphase ii oocytes from women with polycystic ovary syndrome..ReproductiveBiomedicineOnline,31(4):565-572.

[27] Song Q, Xu Y, Yang C, Chen Z, et al. (2014). miR-483-5p promotes invasion and metastasis of lung adenocarcinoma by targeting RhoGDl1 and ALCAM.CancerResearch, 74(11):3,031-3,042.

[28] Mingzhu, L., Anna, R., Min, Y., Robert, M., Francesca, B., & Rivera, M. N., et al. (2013). The igf2 intronic mir-483 selectively enhances transcription from igf2 fetal promoters and enhances tumorigenesis.Genes&Development, 27(23):2，543-2，548.

[29] Hale, L. J., Welsh, G. I., Perks, C. M., Hurcombe, J. A., Moore, S. , & Hers, I. , et al. (2013). Insulin-like growth factor-ii is produced by, signals to, and is an important survival factor for the mature podocyte in man and mouse.JournalofPathology, 230(1):95-106.

[30] 范秀軍.妊娠中后期小尾寒羊胎兒成熟監(jiān)測[D]. 哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士論文, 2003.

FAN Xiu-jun. (2003).Themonitoringstudiesonthesheepfetusduringthemidtolatepregnancyperiod[D]. Master Dissertation. Northeast Agricultural University, Harbin.

Fund project:Supported by the National Natural Science Foundation of China (NSFC) (No:31160227), Academician special foundation of XPCC (No.2015AG018), Science foundation for Young Scientists of Xinjiang Academy of Agricultural and Reclamation Science (No.YQJ201502)

Analysis of the Relative Expression of MicroRNA-483-5p during Different Developmental Stages and Various Tissues of Sheep Embryo

ZHANG Yi-yuan, TANG Hong, GUO Yan-hua, WANG Xin-hua, WANG Li-min, ZHOU Ping

(ResearchInstituteofAnimalHusbandryandVeterinaryMedicine,XinjiangAcademyofAgriculturalandReclamationSciences/KeyLaboratoryofOvineBreedingBiologyTechnologyofXinjiangProductionandConstructionCorps,ShiheziXinjiang832000，China)

【Objective】 The aim of this study is to detect the expression of MicroRNA (miR) 483-5p in kidney and umbilical cord tissues at different stages of embryos in Chinese Merino and to explore the roles of miR-483-5p in embryonic development. 【Method】In this study, different development periods (45 d, 85 d, 115 d and 135 d 4 times) kidney and umbilical cord tissue of Chinese Merino sheep embryo were taken as the research material, the expression of miR-483-5p in different tissues of 45th day embryos of sheep was analyzed by RT-PCR. On the basis, the expression of miR-483-5p in kidney and umbilical cord tissues at different stages of embryos were analyzed and compared by Real-time PCR.【Result】The results showed that miR-483-5p were widely expressed in the tested tissues, in which the expression level of muscle, heart and lung was much higher than the others. The real-time PCR showed that the expression of miR-483-5p in kidney and umbilical cord tissues at different stages embryos of sheep had obvious temporal selectivity. In the wake of embryo development the expression of miR-483-5p in umbilical cord tissues was gradually decreased, but in kidney tissues, the expression of miRNA 483-5p was declined to the lowest in 85 d of embryonic development, then gradually increased in the 115 d and 135 d. There were significant differences for expression change extent of miR-483-5p in kidney or umbilical cord in different development stages of embryo.【Conclusion】These results suggested that the expression of miR-483-5p in kidney or umbilical cord at different development stages and various tissues of embryos were obviously different, which suggested that miRNA 483-5p was selectively expressed in sheep embryonic development. It was deduced that miR-483-5p had regulation function in kidney and umbilical cord according to the difference of expression and the reported function of miR-483-5p. These results might provide the theoretical basis for further study of mechanism of microRNAs in kidney and umbilical cord of sheep embryo.

sheep; embryo; miR- 483-5p; expression analysis

10.6048/j.issn.1001-4330.2016.04.025

2015-11-12

國家自然科學(xué)基金項目(31160227)；兵團院士資金專項(2015AG018)；新疆農(nóng)墾科學(xué)院青年科學(xué)基金(YQJ201502)

張譯元(1988-)，女，山東單縣人，助理研究員，研究方向為動物體細胞克隆，(E-mail)zhangyiyuan1988@sina.com

王立民(1980-)，男，內(nèi)蒙古包頭人，副研究員，研究方向為綿羊體細胞克隆與胚胎發(fā)育，(E-mail)wanglm1980@126.com

S827.1

A

1001-4330(2016)04-0778-07