棗果霉?fàn)€病病原鑒定(二)
——引起新疆棗果霉?fàn)€病的幾種青霉菌的分離鑒定

沙娜瓦爾·色買提，玉山江·買買提，郭慶元，白劍宇

(1．新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，烏魯木齊　830052；2．新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，烏魯木齊　830091)

?

棗果霉?fàn)€病病原鑒定(二)
——引起新疆棗果霉?fàn)€病的幾種青霉菌的分離鑒定

沙娜瓦爾·色買提1，玉山江·買買提2，郭慶元1，白劍宇1

(1．新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，烏魯木齊830052；2．新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，烏魯木齊830091)

【目的】棗果霉?fàn)€病是棗干果上的主要病害，青霉菌是引起棗果霉?fàn)€病的重要病原之一。明確新疆棗果霉?fàn)€病病原種類及優(yōu)勢(shì)致病種群，有效防控該病的發(fā)生與危害。【方法】通過組織分離、形態(tài)鑒定及分子鑒定，對(duì)引起棗果霉?fàn)€病的幾種青霉菌進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定，通過人工接種進(jìn)行致病性比較?！窘Y(jié)果】自棗果上分離到的大多數(shù)青霉屬單孢菌株對(duì)棗果具有明顯的致病性；50個(gè)致病的青霉屬單孢菌株分屬于5個(gè)種，分別為波蘭青霉、短密青霉、變幻青霉、產(chǎn)黃青霉、朱黃青霉；其中波蘭青霉分離頻率最高，為青霉菌中的優(yōu)勢(shì)種；變幻青霉在5種青霉菌中致病力最強(qiáng)?！窘Y(jié)論】引起新疆棗果霉?fàn)€病的青霉屬真菌有5種，其中波蘭青霉為優(yōu)勢(shì)種，變幻青霉為致病力最強(qiáng)的種。

棗；果實(shí)霉?fàn)€??；青霉；病原鑒定

0　引 言

【研究意義】棗樹(ZizyphusjujubeMill)原產(chǎn)于我國(guó)黃河流域，至今己有3000多年的栽培歷史[l]，是重要的特產(chǎn)果品資源之一，是我國(guó)第一大干果樹種和第七大果品樹種[2]。棗果因其味甜、肉質(zhì)厚、含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和食療功能等優(yōu)良品質(zhì)而受到消費(fèi)者的喜愛，是國(guó)內(nèi)外知名的果產(chǎn)品[3]。近年來，新疆的棗果產(chǎn)業(yè)蓬勃發(fā)展，初步形成了我國(guó)最具發(fā)展前景的優(yōu)質(zhì)棗果產(chǎn)業(yè)帶。但是，長(zhǎng)期以來，果農(nóng)主要采用傳統(tǒng)露天暴曬的方式制干，使棗果極易受到污染，導(dǎo)致吸濕回潮、褐變、酸甜失衡等問題，在棗果儲(chǔ)運(yùn)過程中很容易發(fā)生霉變引起棗果霉?fàn)€等貯藏期病害,從而造成干果品質(zhì)下降，市場(chǎng)價(jià)格降低。在引起棗果霉?fàn)€病的致病菌中，青霉菌和曲霉菌是其主要的病原[4]。因此，明確棗果霉?fàn)€病的病原種類及優(yōu)勢(shì)致病種群對(duì)有效防控該病的發(fā)生和危害有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】根據(jù)已有報(bào)道，棗果霉?fàn)€病在每年都有大量發(fā)生，有的年份甚至造成 90%以上的損失[4]。棗果霉?fàn)€病包括輪紋爛果病、紅粉病、軟腐病、曲霉病、青霉病、木霉病等多種[4,5]。據(jù)報(bào)道青霉菌侵入棗果后，引起病果變軟、果肉變褐、味苦，濕度高時(shí)果面長(zhǎng)出灰綠色霉層，其病征非常有助于該病的識(shí)別[4]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)引起棗果霉?fàn)€病的青霉菌種類報(bào)道甚少，對(duì)新疆棗果霉?fàn)€病的病原研究未見報(bào)道。針對(duì)棗果霉?fàn)€病危害性，其病原菌種類缺少準(zhǔn)確鑒定，防治上沒有適當(dāng)措施的現(xiàn)狀，研究擬對(duì)引起棗果霉?fàn)€病的青霉菌進(jìn)行大量分離，應(yīng)用傳統(tǒng)真菌形態(tài)學(xué)鑒定和分子鑒定相結(jié)合的方法對(duì)引起棗果霉?fàn)€的青霉菌進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定，并對(duì)多種致病青霉菌進(jìn)行致病性比較。【擬解決的關(guān)鍵問題】通過大量的采樣和嚴(yán)格的分離鑒定，明確其致病種類和優(yōu)勢(shì)致病種群，為該病的有效防控提供依據(jù)。研究在傳統(tǒng)的形態(tài)鑒定基礎(chǔ)上，利用rDNA-ITS將得到的主要病原菌進(jìn)行鑒定，對(duì)引起棗果霉?fàn)€病的青霉菌的致病種類和優(yōu)勢(shì)致病種群進(jìn)行分析，為棗果霉?fàn)€病害的防治提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材 料

1.1.1病 果

2014至2015年，先后于阿克蘇地區(qū)(市郊、阿克蘇阿瓦提縣、阿克蘇沙雅縣)、和田地區(qū)(皮山縣、策勒縣、于田縣、洛浦縣)、喀什地區(qū)(沙車縣)等主要棗產(chǎn)區(qū)及烏魯木齊華凌干果批發(fā)市場(chǎng)和烏魯木齊東環(huán)路干果批發(fā)市場(chǎng)進(jìn)行病果收集，從中挑選典型病果進(jìn)行分離。用于分離的主要棗果品種有駿棗、灰棗、哈密大棗等。

1.1.2 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，蔗糖20 g，瓊脂15～20 g，用水定容至1L。

查氏瓊脂培養(yǎng)基(Czapek)：蔗糖30 g，NaNO31 g，K2HPO41 g，KCl 0.5 g，MgSO40.5 g , FeSO40.01 g，瓊脂15～20 g，用水定容至1 L，pH 自然。

水瓊脂培養(yǎng)基(WA)：瓊脂15 g、蒸餾水1 000 mL。

1.2方 法

1.2.1 病原菌分離1.2.1.1 組織分離法

將新鮮病果表面清洗干凈，用70%酒精棉球擦拭棗果表面，用解剖刀削去大部分病部組織，用鑷子夾取病健交界處果肉置于PDA平板培養(yǎng)基上，25℃恒溫箱中培養(yǎng)。

1.2.1.2保濕誘發(fā)分離法

選取典型病果，置入加濾紙的保濕培養(yǎng)皿內(nèi)，待菌落長(zhǎng)出后，從菌落上選擇較為單純的青霉菌轉(zhuǎn)接到新的查氏平板培養(yǎng)基上，25℃恒溫培養(yǎng)5 d后檢查菌落。

1.2.2病原真菌的純化、回接及形態(tài)鑒定

對(duì)各分離物采用單孢分離法進(jìn)行純化[6]。完成所有分離物的單孢分離后，采用離體果針刺接種法將各單孢菌株接種到新鮮、成熟、健康、無傷的紅棗果實(shí)上，觀察其致病與否，由此篩選致病菌株。

將各致病菌株分別接種到查氏平板培養(yǎng)基上，經(jīng)培養(yǎng)后進(jìn)行體視顯微觀察及制作切片鏡檢，觀察描述其產(chǎn)孢方式及分生孢子梗、產(chǎn)孢細(xì)胞和分生孢子/的形態(tài)特征，結(jié)合培養(yǎng)特性，作為鑒定菌種依據(jù)。參照《真菌鑒定手冊(cè)》[7]及《中國(guó)真菌志》青霉屬分冊(cè)[8]，主要以Pitt和Samson(1993)[9]的資料為依據(jù)對(duì)各致病菌株進(jìn)行形態(tài)鑒定。

1.2.3病原菌分子鑒定1.2.3.1基因組DNA的提取

從完成形態(tài)鑒定的各種青霉菌中選取一個(gè)單孢菌株，采用液體靜置培養(yǎng)方法收集菌絲體，用液氮充分研磨菌至粉末后裝入1.5 mL離心管中，參照試劑盒使用說明,用真菌 DNA 提取試劑盒(北京天根生物科技有限公司)提取其基因組DNA。

1.2.3.2rDNA-ITS的擴(kuò)增與測(cè)序

引物：上游引物ITS1(5′-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3′)

下游引物ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)

PCR擴(kuò)增25 μL的反應(yīng)體系，包括Taq(1U/μL) 0.5 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，Mg2+Plus 2.5 μL，dNTP Mixture 3 μL，ITS1 1 μL，ITS4 1 μL，模板DNA 各2 μL，ddH2O 13 μL。

PCR反應(yīng)條件為預(yù)變性95℃ 3 min；變性，95℃ 1 min，退火52℃ 40 s，延伸72℃ 2 min，35個(gè)循環(huán)；補(bǔ)平72℃ 10 min。

擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠，在1×TAE電泳緩沖液中電泳，以凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)并記錄擴(kuò)增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上的圖譜。

用PCR產(chǎn)物切膠、PMD18-T載體純化和連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化方法將擴(kuò)增產(chǎn)物純化后送博士德生物公司測(cè)序部進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3.3BLAST比對(duì)與同源性分析

將測(cè)得的菌株序列在GenBank中進(jìn)行BLAST比對(duì)，根據(jù)待測(cè)菌株與已知種的同源性驗(yàn)證形態(tài)鑒定結(jié)果。

1.2.4病原菌的致病性比較1.2.4.1鮮果接種方法

采集白熟期新鮮健康棗果，用浸泡在70%酒精中的棉球?qū)椆砻嫦?，無菌水沖洗3次，晾干后切成果片并置于保濕培養(yǎng)皿內(nèi)；將各單孢菌株制成直徑4 mm的菌餅作為接種體，貼于棗果片切面上，每果片接種3個(gè)位點(diǎn)；每個(gè)單孢菌株接種3個(gè)果片(3次重復(fù))并置于同一保濕皿中；以果片上放無菌的PDA培養(yǎng)基餅作為對(duì)照。接種后在25℃溫箱中保濕培養(yǎng)，每天觀察記錄果實(shí)發(fā)病情況，10 d后分別統(tǒng)計(jì)發(fā)病率。

1.2.4.2干果接種方法

選健康干果， 用70%酒精棉球作表面消毒后，用無菌水浸泡吸脹，晾干后切成果片并置于保濕培養(yǎng)皿內(nèi)；用與鮮果相同的接種和培養(yǎng)方法觀察記錄果實(shí)發(fā)病情況。

2　結(jié)果與分析

2.1自然發(fā)病棗果的典型癥狀

該病主要為害采收期至儲(chǔ)藏期的果實(shí)，一般在采后晾曬期(10月中、下旬)大量發(fā)生，多從果面蟲眼、裂口、病痕及機(jī)械傷口處發(fā)病。青霉菌侵染棗果后，受害部位果肉變褐、濕度高時(shí)果面可長(zhǎng)出邊緣白色中間灰綠色的霉層。其中灰綠色部分長(zhǎng)有大量的分生孢子穗，邊緣白色部分主要為新生菌絲。

2.2棗果霉?fàn)€病病原菌分離

通過組織分離，從60個(gè)典型病果，約300個(gè)組織塊上獲得15個(gè)青霉屬(Penicilliumspp.)分離物；通過保濕分離，從15個(gè)典型病果上獲得40個(gè)青霉屬分離物；合計(jì)從75個(gè)病果上分離到55個(gè)青毒屬分離物，經(jīng)單孢分離得到165個(gè)單孢菌株(每分離物2～3個(gè))；選取其中117個(gè)單孢菌株進(jìn)行回接，篩選出102個(gè)致病的單孢菌株。它們分別來自于50個(gè)分離物(有5個(gè)分離物的所有菌株無致病表現(xiàn))。這些致病菌株均能侵染棗果，引起果實(shí)表面或內(nèi)部發(fā)病,長(zhǎng)出青色或綠色霉層，最后導(dǎo)致爛果，并從發(fā)病果實(shí)上可重新分離得到與所接菌株的培養(yǎng)性狀相同的病原菌，說明分離得到的病原菌是引起棗果霉?fàn)€病的致病菌。分離過程中還有大量的曲霉屬真菌及少量腐霉屬分離物出現(xiàn)。

表150個(gè)青霉屬菌株所屬的種及其出現(xiàn)頻率
Table 1Frequency of 50 Penicillium .spp

代表菌株Representativestrain相同特征菌株數(shù)Numberofequalcharacteristicstrains出現(xiàn)頻率Occurrencefrequency(%)組織分離Tissueisolation(個(gè))保濕分離Moisturizeisolation(個(gè))組織分離Tissueisolation(%)保濕分離Moisturizeisolation(%)合計(jì)Total(%)鑒定結(jié)果IdentificationresultHMGS1406-1-1RQGS1406-7-4HTGS1406-8-5131326.0026.0052.00波蘭青霉(P.polonicum)HMGS1406-2-2YTGS1406-3-2HTGS1406-8-3244.008.0012.00變幻青霉(P.variabile)HTGS1406-4-1HTGS1406-4-2CLGS1406-9-1060.0012.0012.00產(chǎn)黃青霉(P.chrysogenum)RQGS1406-7-1-3RQGS1406-7-2-2RQGS1406-7-3060.0012.0012.00朱黃青霉(P.minioluteum)CLGS1406-5-7YTGS1406-3-5RQGS1406-7-1-1060.0012.0012.00短密青霉(P.brevicompactum)

2.3青霉種的形態(tài)鑒定

從50個(gè)分離物中各選1個(gè)致病單孢菌株，通過對(duì)各單孢菌株在查氏培養(yǎng)基上的培養(yǎng)形狀及孢子和產(chǎn)孢細(xì)胞的形態(tài)、大小等特征觀察，鑒定出50個(gè)青霉屬菌株分屬于5個(gè)種，分別為波蘭青霉(P.polonicumThom)、變幻青霉(P.variabileSopp)、產(chǎn)黃青霉(P.chrysogenumThom)、朱黃青霉(P.minioluteumDierckx)和短密青霉(P.brevicompactumDierckx)；波蘭青霉的出現(xiàn)頻率最高為52%，其余四種青霉的出現(xiàn)頻率均為12%。此外，從兩種分離方法得到的結(jié)果來看，經(jīng)組織分離法得到的青霉菌菌株很少，而經(jīng)保濕分離法得到的青霉菌菌株數(shù)較多；從組織分離法得到的15個(gè)菌株中，只鑒定出波蘭青霉和變幻青霉兩種，且以波蘭青霉的菌株占約大多數(shù)，而保濕分離得到的35個(gè)菌株中鑒定出了上述所有5個(gè)種，而仍以波蘭青霉的菌株為多。多項(xiàng)分離結(jié)果均顯示波蘭青霉在所有青霉菌株中出現(xiàn)頻率最高，為棗果霉?fàn)€病的優(yōu)勢(shì)病原菌種。表1

2.4各種致病青霉菌的培養(yǎng)性狀及形態(tài)特征

2.4.1波蘭青霉P .polonicum

在查氏培養(yǎng)基上，25℃，培養(yǎng)12 d后，菌落直徑36～41 mm，有明顯的放射狀皺紋，，質(zhì)地絨狀；分生孢子結(jié)構(gòu)大量產(chǎn)生時(shí)，菌落通常呈現(xiàn)較深的綠色，近于暗綠橄欖色、橄欖綠色；菌絲體通常白色；菌落反面黃褐色；分生孢子梗發(fā)生于基質(zhì)，孢梗莖(147～300) μm×(3.5～4) μm，壁通常小疣狀粗糙；帚狀枝三輪生；梗基每輪2～4個(gè)分枝，(11～21) μm×(2.8～3) μm；瓶梗每輪3～7個(gè)，7～10(11)μm×(2～2.5) μm，瓶狀，梗頸較長(zhǎng)；分生孢子多球形(3.8)4～3.5 μm，壁平滑。圖1A

2.4.2變幻青霉 P . variabile

在查氏培養(yǎng)基上，25℃，培養(yǎng)12 d后，菌落直徑30～34 mm，平坦，質(zhì)地絨狀兼有輕微絮狀；分生孢子結(jié)構(gòu)較多，菌落通常呈現(xiàn)黃綠色、藍(lán)綠色；菌絲體淡褐色；滲出液通常缺乏；菌落反面黃色；分生孢子梗發(fā)生于基質(zhì)，孢梗莖(128～151)μm×(1.5～3.2) μm, 壁平滑；帚狀枝雙輪生，緊貼；?；；枯?～8個(gè)，(8～12) μm×(2.5～2.8) μm；瓶梗每輪4～6個(gè)，(10 ～12) μm×(1.5～3) μm，披針形；分生孢子呈現(xiàn)橢圓形，(3.5～5) μm×(2～2.5) μm，壁平滑；分生孢子鏈?zhǔn)杷?。圖1B

2.4.3產(chǎn)黃青霉P .chrysogenum

在查氏培養(yǎng)基上，25℃，培養(yǎng)12 d后，菌落直徑25～30 mm，有大量放射狀皺紋；質(zhì)地通常呈現(xiàn)顯著的絨狀；分生孢子結(jié)構(gòu)大量產(chǎn)生，菌落通常呈現(xiàn)藍(lán)綠色；菌絲體白色；菌落反面呈現(xiàn)不同程度的黃褐色；分生孢子梗發(fā)生于基質(zhì)，孢梗莖30～80(120)μm×(1.6～3) μm, 壁平滑；?；枯?～5個(gè)，(9～12) μm×(2.5～2.8) μm；瓶梗每輪4～80個(gè)，(7～10) μm×(2～2.7) μm，瓶狀，梗勁短；分生孢子呈現(xiàn)橢圓形，(2.8～3.5) μm×(2～2.6) μm，壁平滑；分生孢子鏈通常呈現(xiàn)不規(guī)則的圓柱狀。圖1C

2.4.4朱黃青霉P .minioluteum

菌落在查氏培養(yǎng)基上，25℃，培養(yǎng)12 d后，直徑19～24 mm，平坦，邊緣不整齊；質(zhì)地絨狀；分生孢子結(jié)構(gòu)較多，分生孢子面黃綠色；菌絲體白色；菌落反面深紅色；分生孢子梗發(fā)生于氣生菌絲，孢梗莖(40～150) μm×(2.5～3.2) μm，壁平滑；帚狀枝雙輪生彼此緊貼；梗基每輪5～8個(gè)，(8～13) μm×(2.5～3.2) μm；瓶梗每輪6～8個(gè)，(8～11) μm×(1.8～2.2) μm，披針形；分生孢子呈現(xiàn)橢圓形，也有近球形，(2.8～3.5) μm×(2.2～2.8) μm，壁平滑；分生孢子疏松而不規(guī)則。圖1D

2.4.5短密青霉P. brevicompactum

菌落在查氏培養(yǎng)基上，25℃，12 d后，菌落直徑17～20 mm，中部有臍狀突起，其他部位有放射狀皺紋，邊緣通常較薄；質(zhì)地通常絨狀；分生孢子結(jié)構(gòu)大量產(chǎn)生，分生孢子面藍(lán)綠色；菌絲體白色；菌落反面暗黃褐色；分生孢子梗發(fā)生于基質(zhì)，孢梗莖(30.5～165) μm×(3～4.5) μm,壁平滑；帚狀枝主要是三輪生，通常彼此緊貼；副枝1～3個(gè)，(12～18) μm×(2.5～4) μm；?；枯?～7個(gè)，(7.4～10) μm×(2.5～4) μm，頂端膨大呈現(xiàn)囊狀；瓶梗每輪5～8個(gè)，(7～9) μm×(2～2.5) μm，瓶狀，梗勁短；分生孢子呈現(xiàn)橢圓形或近橢圓形， (2.3～3.32) μm×(2.5～3) μm，壁平滑。圖1E

2.5五種青霉菌的rDNA- ITS 序列分析

從幾種青霉菌中各選一個(gè)致病的單孢菌株，以病原菌的 DNA 作為模板，用通用引物擴(kuò)增出約 580～600 bp 左右的 rDNA- ITS 序列，并完成測(cè)序。將所測(cè)得的不同青霉菌株的 rDNA- ITS 序列在GenBank 中與已有的一些青霉菌序列進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果表明，所測(cè)病原菌分屬于半知菌類青霉屬中的確為5個(gè)種。圖2

注：A、B、C、D、E分別代表波蘭青霉、變幻青霉、產(chǎn)黃青霉、朱黃青霉、短密青霉。1、2、3分別代表五種青霉菌的分生孢子穗、分生孢子梗及分生孢子

Note：A，B，C，D，E respectively representP.polonicum、P.brevicompactum、P.vaeiabile、P.minioluteum、Penicilliumminioluteum；1、2、3 respectively represent the morphology characteristic of 5Penicilliumspp. on conidium fringe、conidiophores、conidia

圖1五種青霉的形態(tài)特征
Fig. 1Morphological characteristics of 5 species Penicillium fungus

經(jīng)形態(tài)鑒定的各種青霉菌與GenBank 中登錄的同種青霉菌的rDNA- ITS 序列進(jìn)行同源性比對(duì)，結(jié)果表明：波蘭青霉菌株(HMGS1406-1-1)的ITS 序列與P.polonicum(AF033475，KJ741330，KJ589583等)多個(gè)菌株的ITS序列同源性達(dá)99%～100%；變幻青霉菌株(HTGS1406-8-3)的ITS 序列與P.variabile(HM469398，JF327827，HQ288049等)多個(gè)菌株的ITS序列同源性達(dá)98%～99%；產(chǎn)黃青霉菌株(HTGS1406-4-1)的ITS 序列與P.chrysogenum(JQ776534，AY373903，KF011475等)多個(gè)菌株的ITS序列同源性達(dá)99%～100%；朱黃青霉菌株(RQGS1406-7-1-3)的ITS 序列與P.minioluteum(JF910284，F(xiàn)R670332和GU566240等)多個(gè)菌株的ITS序列同源性達(dá)98%～99%；短密青霉菌株(CLGS1406-5-7)的ITS 序列與P.brevicompactum(AY373897，NR121299和HM469408等)多個(gè)菌株的ITS序列同源性達(dá)99%～100%；其分析結(jié)果與形態(tài)鑒定結(jié)果一致，表明引起新疆棗果霉?fàn)€病的青霉菌確為上述5種。

注：M：DNA marker DL2000；1：波蘭青霉(HMGS1406-1-1)；2：變幻青霉(HTGS1406-8-3)；3：產(chǎn)黃青霉(HTGS1406-4-1)；4：朱黃青霉(RQGS1406-7-1-3)；5：短密青霉(CLGS1406-5-7)

Note：M：DNA marker DL2000；1：P.polonicum(HMGS1406-1-1)；2：P.variabile(HTGS1406-8-3)；3：P.chrysogenum(HTGS1406-4-1)；4：P.minioluteum(RQGS1406-7-1-3)；5：P.brevicompactum(CLGS1406-5-7)

圖2五種青霉菌株ITS 區(qū)域的 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物
Fig.2rDNA ITS-PCR products of single spore isolates of 5 spcies Penicillium

2.6五種青霉菌的致病性比較

從5種青霉菌中各選3個(gè)單孢菌株進(jìn)行的致病性分析的結(jié)果表明：5種青霉菌對(duì)棗果的致病力存在明顯的差異，同一種青霉菌對(duì)鮮果和干果的致病力亦有較大差異，其中有4種青霉對(duì)鮮果的致病力明顯大于對(duì)干果的致病力，僅產(chǎn)黃青霉例外，對(duì)鮮果的致病力略小于對(duì)干果的致病力；變幻青霉和朱黃青霉對(duì)棗鮮果致病能力最強(qiáng)(接種發(fā)病率大于81%)，對(duì)干果的致病力也較強(qiáng)(接種發(fā)病率分別為51.84%和33.33%)；產(chǎn)黃青霉對(duì)棗鮮果致病能力最弱(接種發(fā)病率為44.44%)，但對(duì)干果的致病力最強(qiáng)(接種發(fā)病率為66.66%)；其他兩種青霉(波蘭青霉和短密青霉)對(duì)棗鮮果致病能力較強(qiáng)，對(duì)干果的致病力較弱；同時(shí)，同一種青霉菌的不同菌株間的致病力亦有明顯差異。表2

表2五種青霉菌對(duì)棗鮮果及棗干果的致病性比較
Table 2The results of pathogenicity test of Penicillium fungus to jujube fresh fruit and dried fruit

病原名稱Nameofpathogeny菌株編號(hào)Strainnumbers鮮果接種Freshfruit干果接種Driedfruit發(fā)病率Incidencerate(%)種間平均發(fā)病率Averageincidencerateofspecies(%)發(fā)病率Incidencerate(%)種間平均發(fā)病率Averageincidencerateofspecies(%)波蘭青霉HMGS1406-1-188.8874.0777.7729.62P.polonicumRQGS1406-7-433.330.00HTGS1406-8-5100.0011.11變幻青霉HMGS1406-2-2100.0081.4866.6651.84P.variabileYTGS1406-3-2100.0044.44HTGS1406-8-344.4444.44產(chǎn)黃青霉HTGS1406-4-111.1144.4477.7766.66P.chrysogenumHTGS1406-4-288.88100.00CLGS1406-9-133.3322.22朱黃青霉RQGS1406-7-1-3100.0081.4755.5533.33P.minioluteumRQGS1406-7-2-277.770.00RQGS1406-7-366.6644.44短密青霉CLGS1406-5-7100.0070.3622.2218.51P.brevicompactumYTGS1406-3-544.440.00RQGS1406-7-1-166.6633.33CK0.000.000.000.00

3　討 論

青霉屬中有多個(gè)種是引起棗果霉?fàn)€的主要病原菌。在研究中鑒定出的5種青霉菌中，波蘭青霉為優(yōu)勢(shì)菌種，分離頻率最高，致病性較強(qiáng)；變幻青霉為5種青霉菌中致病力最強(qiáng)的種，對(duì)鮮果和干果的致病率最大；但需要說明的是，由于每種青霉菌中僅選用了3個(gè)代表菌株，且菌株間的致病差異很大，因而5種青霉菌的致病力比較會(huì)在一定程度上受到菌株選擇的影響，該5種青霉菌對(duì)棗果的致病力更為準(zhǔn)確的比較，需要選擇更多的菌株并設(shè)置更多的重復(fù)進(jìn)行比較。

青霉屬病原菌的菌落大多呈灰綠色或藍(lán)綠色，通常較難準(zhǔn)確描述和仔細(xì)區(qū)分；根據(jù)分生孢子形態(tài)、大小、分生孢子梗以及菌落形態(tài)來進(jìn)行種的分類，也存在由于培養(yǎng)性狀的可變性及形態(tài)特征的交叉帶來的疑難，所以，應(yīng)用病原形態(tài)學(xué)的方法鑒定植物病原真菌存在需要經(jīng)驗(yàn)以及用時(shí)較長(zhǎng)等一系列的問題[ 9]。已有的研究表明ITS在真菌的種間存在著豐富的變異，而在種內(nèi)不同菌株間卻高度保守，可以為真菌的系統(tǒng)發(fā)育和分類鑒定提供豐富的遺傳信息[10,11]。

根據(jù)相關(guān)報(bào)道，波蘭青霉、變幻青霉、產(chǎn)黃青霉、朱黃青霉、短密青霉等多種病菌，也是引起柑橘、蘋果、梨等許多果蔬貯藏期病害的病原[12,13]。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)引起棗果實(shí)霉?fàn)€病的青霉菌的報(bào)道很少，研究結(jié)果與以往報(bào)道的冬棗霉?fàn)€病青霉屬病原菌種類有所不同[14]，其原因可能是病原菌對(duì)不同棗品種的侵染力不同，以及地理環(huán)境、管理水平和氣候條件等方面的差異，從而導(dǎo)致引起棗霉?fàn)€病的青霉屬病原菌種類存在一定的差異；此外，不同地區(qū)因長(zhǎng)期使用不同化學(xué)藥劑，也可能致使分離所得病原菌種類有所不同。

4　結(jié) 論

引起新疆棗果霉?fàn)€病的青霉菌有波蘭青霉、變幻青霉、產(chǎn)黃青霉、朱黃青霉、短密青霉5種。其中波蘭青霉為分離頻率最高，致病性較強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)菌種，變幻青霉為5種青霉菌中致病力最強(qiáng)的種。

References)

[1] 魏天軍，魏象廷．中國(guó)棗果實(shí)病害研究進(jìn)展[J]．西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2006，15(1)：88-94．

WEI Tian-jun，WEI Xiang-ting．(2006)．Advances in Research on Diseases of Chinese Jujube Fruits (ZizyphusjujubeMill．) [J]．ActaAgriculturaeBoreali-occidentalisSinica，15(1)：88-94．(in Chinese)

[2] 劉孟軍．棗屬植物分類學(xué)研究進(jìn)展[J]．園藝學(xué)報(bào)，1999，26(5)：302-308．

LIU Meng-jun．(1999)．Advances in Taxonomy Study on the Genus Ziziphus [J]．ActaHorticultureaSinica，26(5)：302-308．(in Chinese)

[3] 魏天軍．棗果采后生理特性與保鮮貯藏技術(shù)研究進(jìn)展[J]．寧夏農(nóng)業(yè)科技，2005，(4)：29．

WEI Tian-jun．(2005)．Advances of Research on Postharvest Physiology and Storage Technology of JZizyphusjujubeFruits [J]．NingxiaAgriculturalSciencesandTechnoligy，(4)：29．(in Chinese)

[4] 秦文，柴全喜.棗爛果病的綜合防治[J]．果農(nóng)之友，2014，(8)：26．

QIN Wen，CHAI Quan-xi．(2006)．Zizyphus jujube Fruits mildew pathogen and prevention [J]．FruitGrowers`Friend，(8)：26．(in Chinese)

[5] 張曉申．棗爛果病的種類和防治措施[J]．北京農(nóng)業(yè)，2008，(9)：31．

ZHANG Xiao-shen．(2008)．The type ofZizyphusjujubeFruits mildew pathogen and prevention measures [J]．BeijingAgriculture，(9)：31．(in Chinese)

[6] 方中達(dá)．植病研究方法[M]．(第三版)北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1998．

FANG Zhong-da．(1998)．ResearchMethodofPlantPatholigy[M]．(3rd Ed.) Beijing：China Agriculture Press．(in Chinese)

[7] 魏景超．真菌鑒定手冊(cè)[K]．上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1979：501-512．

WEI Jing-chao．(1979)．ManualfortheIdentificationofFungus[K]．Shanghai：Shanghai Science Technology Press：501-512．(in Chinese)

[8] 孔華志．中國(guó)真菌志(第三十五卷)青霉屬及其相關(guān)有性型屬[M]．科學(xué)出版社，2007．

KONG Hua-zhi．(2007)．FloraFungorumSinicorumPenicilliumetTeleomorphiCognati(vol．35) [M]．Science Press．(in Chinese)

[9]J.I. Pitt, R.A. Samson．(1993)．Names in current use in the family Trichocomaceae, Cladoniaceae, Pinaceae, and Lemnaceae [J]．Koeltz Scientific Books，13-57．

[10]閔曉芳，鄧伯勛，陳麗鋒，等．柑橘采后致病青霉的鑒定[J]．果樹學(xué)報(bào)，2007，24(5)：653-656．

MIN Xiao-fang，DENG Bo-xun，CHENG Li-feng， et al．(2007)．Molecular identification of Penicillium species causing post- harvest diseases of Citrus fruits[J]．JournalofFruitScience，24(5)：653-656．(in Chinese)

[11] Bailey, J. A., Nash, C., Morgan, L. W., O'connell, R. J., & TeBeest, D. O. (1996). Molecular taxonomy of Colletotrichum species causing anthracnose on the Malvaceae.Phytopathology, 86(10):1,076-1,083.

[12] Martínez-Culebras, P. V., Barrio, E., García, M. D., & Querol, A. (2000). Identification of Colletotrichum species responsible for anthracnose of strawberry based on the internal transcribed spacers of the ribosomal region.FEMSmicrobiologyletters, 189(1):97-101.

[13] Yu, T., Li, H. Y., & Zheng, X. D. (2007). Synergistic effect of chitosan and Cryptococcus laurentii on inhibition of Penicillium expansum infections.Internationaljournaloffoodmicrobiology, 114(3):261-266.

[14] Zhang, H., Zheng, X., & Yu, T. (2007). Biological control of postharvest diseases of peach with Cryptococcus laurentii.FoodControl, 18(4):287-291.

[15] 吳興梅，孫蕾，劉元鉛，等．冬棗貯藏期主要病害的研究[J]．經(jīng)濟(jì)林研究，2003，21(2)：19-22．

WU Xing-mei，SUN Lei，LIU Yuan-qian，et al．(2003)．Research on Main Diseases in Winter Jujube Storage Time[J]．NonwoodForestResearch，21(2)：19-22．(in Chinese)

Fund project:Supported by science and technology planning projects of Xinjiang Uygur Autonomous Region "Research, integration and demonstration of the key technology of high efficiency and safety production of Xinjiang featured fruit tress" (201130102)

Identification of the Pathogen Causing Jujube Fruit Mildew (Part Ⅱ) -Isolation and Identification ofPenicilliumfungus Causing Jujube Fruit Mildew

Shanawaer Semaiti1，Yushanjiang Maimaiti2，GUO Qing-yuan1，BAI Jian-yu1

(1．CollegeofAgronomy，XinjiangAgriculturalUniversity，Urumqi830052，China；2．ResearchInstituteofPlantProtection，XinjiangAcademyofAgriculturalSciences，Urumqi830091，China)

【Objective】 The Jujube fruit mildew is the major disease of dried jujube fruits，andPenicilliumspp. is one of important pathogenic fungus causing jujube fruits mildew．Clarifying pathogen species and advantaged species of jujube fruits mildew in Xinjiang is significantly important to control the occurrence and damage of this diseases．【Method】Tissue isolation，morphological analysis and molecular analysis were used in accurate identification ofPenicilliumfungus of jujube fruits mildew．At the same time，artificial vaccination was used for pathogenicity comparison．【Result】The results showed that majority of single spore isolates ofPenicilliumspp. fom jujube fruit have got pathogenicity to jujube fruit．The identification result demonstrated that 50 mono-spore fungus ofPenicilliumspp. had pathogenicity belonging to five major species，which wereP.polonicum，P.brevicompactum，P.vaeiabile，P.minioluteumandP.minioluteum．Among them, the highest isolate rate wasP.polonicum，which was the advantage species ofPenicilliumfungus；The pathogenicity comparison displayed that P. vaeiabile was the most virulent species in 5 species ofPenicilliumfungus．【Conclusion】There are five species ofPenicilliumspp. which cause jujube fruits mildew in Xinjiang, among which advantaged pathogenetic fungus isP.polonicum，andP.vaeiabileis the most virulent pathogenic species of jujube fruit mildew in Xinjiang．

jujube；fruits mildew；Penicillium；pathogen identification

10.6048/j.issn.1001-4330.2016.04.015

2015-11-18

新疆維吾爾自治區(qū)科技計(jì)劃項(xiàng)目“新疆特色果樹高效安全生產(chǎn)關(guān)鍵技術(shù)研究集成與示范”(201130102)

沙娜瓦爾·色買提(1990-)，女，新疆和田人，碩士研究生，研究方向?yàn)橹参锊±韺W(xué)，(E-mail)senever352@163.com

郭慶元(1962-)，男，四川人，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹参锊±韺W(xué)，(E-mail)guoqingyuan3009@sina.com

S463.65

A

1001-4330(2016)04-0698-08