家族遺傳性異常纖維蛋白原血癥家系的基因型分析

彭新國(guó),于永春,成佳景,劉永云,陳　明,崔艷芳*

(1.濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，山東 濱州256603；2.上海第十人民醫(yī)院)

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家族遺傳性異常纖維蛋白原血癥家系的基因型分析

彭新國(guó)1,于永春2,成佳景2,劉永云1,陳明1,崔艷芳1*

(1.濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，山東 濱州256603；2.上海第十人民醫(yī)院)

遺傳性無(wú)纖維蛋白原血癥(inheritdafibrinogenemia)是一種纖維蛋白原基因缺陷引起的常染色體隱性遺傳疾病，患者表現(xiàn)為纖維蛋白原完全缺乏，發(fā)病率大約為百萬(wàn)分之一。與血友病相比，遺傳性無(wú)纖維蛋白原患者黏膜出血較嚴(yán)重，但肌肉和骨骼的出血不如血友病常見(jiàn)[1]。第一例異常纖維蛋白原血癥基因突變發(fā)現(xiàn)于1968年[2]，目前國(guó)內(nèi)外共發(fā)現(xiàn)了約400多例遺傳性異常纖維蛋白原血癥。

纖維蛋白原(fibrinogen,Fg;凝血因子Ⅰ,FⅠ)是一種由2964個(gè)氨基酸組成的大分子糖蛋白，以Aα、Bβ、γ三條多肽鏈為組分，由二硫鍵構(gòu)成對(duì)稱的六聚體結(jié)構(gòu) (Aα、Bβ、γ)2[3]。三條多肽鏈分別由3個(gè)獨(dú)立基因FGA、FGB、FGG編碼，集中于4q28-4q31約50kb的區(qū)域內(nèi)，從著絲粒到端粒有序的排列[4]。

1　對(duì)象和方法

1.1回顧性收集一個(gè)遺傳性異常纖維蛋白原血癥家系的臨床資料，根據(jù)家系成員實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果繪制遺傳圖。如圖1所示此家系患者無(wú)明顯出血癥狀、無(wú)血栓病史。

家系內(nèi)成員進(jìn)行編號(hào)：先證者編號(hào)為S4，先證者的祖母、父親、母親、兒子分別編號(hào)為S1、S2、S3、S5。正常對(duì)照組編號(hào)以隨機(jī)數(shù)字表法編號(hào)，依次編號(hào)為N1、N2、N3-N30。

1.2提取家系成員及對(duì)照組外周血約2ml，進(jìn)行凝血分析。采用promega試劑盒提取外周血DNA和RNA,并對(duì)其純度及濃度進(jìn)行檢測(cè)。設(shè)計(jì)并合成FGA、FGB、FGG基因所有外顯子及側(cè)翼序列的引物，PCR反應(yīng)體系為20ml，以FGA第一外顯子為例，反應(yīng)條件為：94℃，預(yù)變性，30min，94℃，變性，30s，60℃，退火，30s，72℃，延伸，50s，72℃，充分延伸，5min，29個(gè)循環(huán)，擴(kuò)增先證者及對(duì)照組三個(gè)基因的所有外顯子及側(cè)翼序列，PCR產(chǎn)物純化后用BeckmanCoulter公司CEQTMGeneticAnalysisSystem基因分析系統(tǒng)測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與Genebank中的基因序列比對(duì)，部分測(cè)序結(jié)果如圖3。對(duì)幾個(gè)有疑問(wèn)的錯(cuò)義突變位點(diǎn)利用BeckmanCoulter公司的GenomeLabGeXP系統(tǒng)采用引物延伸法進(jìn)行基因型分析。

2　結(jié)果

先證者纖維蛋白原基因FGA、FGB和FGG的所有外顯子及側(cè)翼序列均測(cè)通，對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)堿基的插入或缺失。外顯子區(qū)共發(fā)現(xiàn)7個(gè)單核苷酸突變位點(diǎn)，其中4個(gè)錯(cuò)義突變、2個(gè)同義突變、一個(gè)位于非編碼區(qū)；內(nèi)含子區(qū)先證者發(fā)現(xiàn)1個(gè)SNP位點(diǎn)，正常對(duì)照也表現(xiàn)為同樣的堿基突變。經(jīng)分析，外顯子區(qū)的3個(gè)錯(cuò)義突變位點(diǎn)為可疑致病突變位點(diǎn)。這三個(gè)位點(diǎn)分別為FGGexon8c.902位點(diǎn)、FGAexon1c.16位點(diǎn)和FGBexon8c.1433位點(diǎn)。通過(guò)單堿基引物延伸，本次實(shí)驗(yàn)選取正常對(duì)照30人，在FGGexon8c.902位點(diǎn)上，正常對(duì)照組均為純合子(G/G)，而家系中患者均為該突變位點(diǎn)的雜合子(G/A)，驗(yàn)證了FGG基因第8外顯子上的突變是引起家系成員患遺傳性異常纖維蛋白原血癥的致病突變位點(diǎn)。見(jiàn)下圖1-4。

由圖可見(jiàn)，患者FGG基因cDNA第902位堿基發(fā)生了G→A雜合突變，所編碼的氨基酸由原來(lái)的精氨酸(Arg)變成了組氨酸(His)，即R275H突變。

圖4中前后兩峰為marker,分別在13堿基和88堿基的位置。Marker之間的峰，為目的峰，從左到右依次為FGG第8外顯子上的堿基突變位點(diǎn)(c.902)、FGA第一外顯子上的堿基突變位點(diǎn)(c.16)和FGB第8外顯子上的堿基突變位點(diǎn)(c.1433)。正常對(duì)照(N1)這三個(gè)位點(diǎn)均為純合子，堿基分別為G、A、G。

圖1　家系遺傳圖譜(箭頭所示為先證者S4)

圖2　FGA、FGB、FGG基因大部分外顯子56℃PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

圖3　FGG基因第8外顯子及其側(cè)翼序列PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果

3　討論

通過(guò)單堿基延伸法對(duì)有疑問(wèn)的幾個(gè)突變位點(diǎn)與對(duì)照組進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)在FGGexon8c.902位點(diǎn)，對(duì)照組全部為純合子G；在FGAexon1c.16和FGBexon8c.1433位點(diǎn)，對(duì)照組表現(xiàn)出G/A多態(tài)性。可以得出結(jié)論：FGG基因第八外顯子c.902G>A雜合性堿基置換，導(dǎo)致Arg275His雜合錯(cuò)義突變，是引起該家系遺傳性異常纖維蛋白原血癥的原因之一，而FGAexon1c.16和FGBexon8c.1433是人類基因多態(tài)性位點(diǎn)。方怡等發(fā)現(xiàn)FGG基因第8外顯子的g.5678G>A雜合堿基置換,而致Arg275His的錯(cuò)義突變是家族性異常纖維蛋白原血癥的原因之一[5]。另外趙曉娟等也發(fā)現(xiàn)對(duì)1個(gè)遺傳性異常纖維蛋白原血癥家系成員位于纖維蛋白原FGA基因上的2號(hào)外顯子g1233→a雜合堿基改變，導(dǎo)致Arg16His錯(cuò)義突變[6]。

圖4　正常對(duì)照(N1)三個(gè)SNP位點(diǎn)的堿基

本研究家系患者無(wú)明顯的臨床出血癥狀、無(wú)血栓病史。分析原因，可能此家系的纖維蛋白原活性雖然低，但是血管壁、血小板等的功能正常，起到代償作用。γ鏈275位氨基酸Arg275His雜合錯(cuò)義突變是引起此家系遺傳性異常纖維蛋白原血癥的原因，此氨基酸位點(diǎn)上的錯(cuò)義突變，臨床表現(xiàn)差異大，ReinCM報(bào)道了一個(gè)γR275C雜合錯(cuò)義突變的病例，患者表現(xiàn)出嚴(yán)重的出血癥狀[7]。

遺傳性異常纖維蛋白原血癥(inheritddisfibrinogenemia)是常染色體顯性遺傳性疾病，具有很高的外顯率，絕大多數(shù)是雜合子，約40%無(wú)癥狀。江明華等對(duì)8例遺傳性異常纖維蛋白原血癥先證者分析，發(fā)現(xiàn)了p.BβAsn190Ser、p.AαArg35His和p.γArg301His，3個(gè)突變所致，提示p.BβAsn190Ser和p.γArg301His可能是國(guó)人的熱點(diǎn)突變[8]。本實(shí)驗(yàn)所研究的遺傳性異常纖維蛋白原血癥家系，四代4個(gè)成員均為遺傳性異常纖維蛋白原血癥患者，符合常染色體顯性遺傳的特點(diǎn)

遺傳性疾病對(duì)人類健康的危害很大，若能發(fā)現(xiàn)患病家系的遺傳特點(diǎn)，并在基因水平進(jìn)行診斷和預(yù)防，則能提高出生人口的的質(zhì)量。產(chǎn)前診斷是預(yù)防出生缺陷、降低缺陷兒出生的有效措施之一。由于目前對(duì)遺傳性纖維蛋白原血癥無(wú)有效的治療手段。

所以，進(jìn)行產(chǎn)前診斷的目的就是杜絕純合子胎兒的出生，減少或預(yù)防雜合子胎兒的出生。如能從孕婦體內(nèi)檢測(cè)到胎兒的DNA，就可實(shí)現(xiàn)無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前診斷，使從基因水平診斷遺傳性纖維蛋白原疾病成為可能。1997年，Lo等首次發(fā)現(xiàn)了孕婦血中存在胎兒游離DNA，為無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前診斷奠定了基礎(chǔ)[9]。Neerman-Arbez等已運(yùn)用STR位點(diǎn)連鎖分析及直接測(cè)序的方法進(jìn)行了首例遺傳性無(wú)纖維蛋白原血癥家系的產(chǎn)前診斷，產(chǎn)前診斷的廣泛開(kāi)展及基因治療的積極探索將為解決Fg基因缺陷打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)[10]。

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濱州市科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2013ZC1717)，濱州醫(yī)學(xué)院科技計(jì)劃項(xiàng)目(BY2011KZ08，BY2013KJ28)

1007-4287(2016)09-1589-03

2015-12-24)