一株增香微生物的分離鑒定及其發(fā)酵產(chǎn)香條件優(yōu)化

余　翔，李元實(shí)，劉　棟，王瑞停，帖金鑫，馬　林，*

(1. 鄭州輕工業(yè)學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450002； 2. 吉林煙草工業(yè)有限責(zé)任公司 生產(chǎn)技術(shù)中心，吉林 延吉 133000； 3. 廣東中煙工業(yè)有限責(zé)任公司 技術(shù)中心，廣東 廣州 510385)

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一株增香微生物的分離鑒定及其發(fā)酵產(chǎn)香條件優(yōu)化

余翔1，李元實(shí)2，劉棟3，王瑞停2，帖金鑫1，馬林1，*

(1. 鄭州輕工業(yè)學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450002； 2. 吉林煙草工業(yè)有限責(zé)任公司 生產(chǎn)技術(shù)中心，吉林 延吉 133000； 3. 廣東中煙工業(yè)有限責(zé)任公司 技術(shù)中心，廣東 廣州 510385)

從14種煙葉表面篩選出一株能夠利用煙末發(fā)酵產(chǎn)香的菌株GXY35，通過(guò)生理生化實(shí)驗(yàn)和16S rDNA序列對(duì)其進(jìn)行分析，并用GC/MS對(duì)發(fā)酵液的香氣成分進(jìn)行分析。結(jié)果表明：GXY35分離株屬于克雷伯氏桿菌，發(fā)酵液中特征香味物質(zhì)4-乙烯基愈創(chuàng)木酚的含量最高。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上通過(guò)正交試驗(yàn)，對(duì)菌株的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，最適宜的產(chǎn)香發(fā)酵條件為：料液比1∶20，接種量12%，發(fā)酵溫度37 ℃，發(fā)酵時(shí)間72 h，pH值7.0。在此條件下，特征香味物質(zhì)4-乙烯基愈創(chuàng)木酚的含量最高可達(dá)0.725 mg·mL-1。

生物香料；特征香味物質(zhì)；發(fā)酵產(chǎn)香；卷煙香氣

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外越來(lái)越多的煙草研究者對(duì)煙草香味物質(zhì)進(jìn)行研究，已經(jīng)取得了很大的進(jìn)展，但主要集中在以化學(xué)或者物理方法處理煙葉方面。此外，國(guó)內(nèi)外也有一些關(guān)于利用微生物發(fā)酵或者酶促反應(yīng)來(lái)改善煙葉總體質(zhì)量的研究報(bào)道[1-9]，但多集中在煙葉感官質(zhì)量和常規(guī)化學(xué)成分的變化上，對(duì)利用煙草廢料或廢棄煙末發(fā)酵增香的應(yīng)用研究少有報(bào)道。趙銘欽等[10]研究了不同生物制劑處理對(duì)發(fā)酵烤煙煙葉中香氣物質(zhì)含量的影響，結(jié)果表明：處理后的發(fā)酵煙葉中大多數(shù)香氣成分，如大馬酮、二氫大馬酮、紫羅蘭酮等，含量有一定的增加趨勢(shì)。通過(guò)利用烤煙葉面上存在著的微生物對(duì)煙葉進(jìn)行發(fā)酵增香，可以定向增加煙葉的香氣，充分保持煙葉的原有品質(zhì)。朱大恒等[11]提出了一種新型生產(chǎn)煙草香料的方法，直接利用產(chǎn)香微生物發(fā)酵煙葉制備生物香料。周瑾等[12]從優(yōu)質(zhì)烤煙葉上分離篩選得到一種優(yōu)勢(shì)的微生物菌種，并將其接種于低等級(jí)烤煙煙葉的碎片上，測(cè)定發(fā)酵前后煙葉碎片化學(xué)成分的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵后的低等級(jí)煙葉中，有機(jī)酸含量有一定程度的增加，還原糖含量明顯降低。研究表明：將發(fā)酵后的煙草廢料中提取到的香味物質(zhì)，運(yùn)用到卷煙加香評(píng)吸中，能夠明顯降低卷煙刺激性，增加卷煙香氣，掩蓋煙草雜氣，一定程度上可改善卷煙的吸食品質(zhì)[13]。在烤后煙葉表面上存在著大量的微生物，本文擬從烤后煙葉表面篩選出能夠利用廢棄煙末發(fā)酵產(chǎn)香的微生物，對(duì)其進(jìn)行分離鑒定，并優(yōu)化增香微生物發(fā)酵產(chǎn)香的條件，旨在利用煙葉微生物發(fā)酵廢棄煙末加工生產(chǎn)出帶有煙草天然香韻的生物香料。

1　材料與方法

1.1材料與設(shè)備

發(fā)酵煙末為河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司廢棄煙葉；牛肉膏、蛋白胨、瓊脂等生化試劑，購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；氯化鈣、硫酸亞鐵、氯化鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、硫酸鎂等試劑，均為分析純，購(gòu)自天津大茂化學(xué)試劑廠。

SW-CJ-2D凈化工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；LDZX-30KBS型立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；LR56495型高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)Thermo Fisher科技公司；HZQ-F160型全溫振蕩培養(yǎng)箱，太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；Veriti 96-Well Thermal Cycler型PCR儀，美國(guó)Applied Systems公司；MiniBIS Pro凝膠成像儀，以色列DNR成像系統(tǒng)有限公司；Leica DM750光學(xué)顯微鏡，德國(guó)徠卡微系統(tǒng)有限公司；T6新世紀(jì)型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京普析儀器有限公司；感量0.000 1 g分析天平，北京賽多利斯天平有限公司；HP6890/5976型GC/MS氣質(zhì)聯(lián)用儀，美國(guó)惠普公司。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1培養(yǎng)基配制

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：牛肉膏3 g·L-1，蛋白胨10 mg·L-1，NaCl 5 g·L-1，瓊脂粉20 g·L-1，pH值為7.2～7.4，0.1 MPa置于高壓蒸汽滅菌鍋中，121 ℃滅菌30 min。

篩選培養(yǎng)基：阿魏酸0.75 g，KH2PO40.9 g，Na2HPO41 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，CaCl20.1 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，無(wú)菌水定容至1 000 mL，置于高壓蒸汽滅菌鍋中，121 ℃下滅菌30 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：按料液比1∶10在篩選培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加發(fā)酵煙末。

1.2.2菌株的分離純化

稱取5 g煙葉于250 mL錐形瓶中，加入100 mL無(wú)菌水。37 ℃，200 r·min-1振蕩培養(yǎng)15～30 min。將菌液依次稀釋成10-1～10-7的濃度梯度，均勻涂布于含有基礎(chǔ)培養(yǎng)基的平板上，放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察平板菌株的生長(zhǎng)情況，選擇最適濃度梯度。挑取出不同形態(tài)的單菌落，采用平板劃線法分離純化菌株，并編號(hào)保存。

1.2.3菌株的篩選

挑取一環(huán)純菌株，接入篩選培養(yǎng)基試管中，將試管置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，37 ℃，150 r·min-1振蕩培養(yǎng)24～48 h。取出后，在通風(fēng)條件較好的環(huán)境下，觀察記錄分離菌株發(fā)酵液的外觀和香氣特征變化情況。

1.2.4菌株的鑒定

產(chǎn)香菌株的生理生化特性按照常規(guī)方法進(jìn)行分析鑒定[14]。

另采用Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒提取菌株總DNA，送交上海生物工程公司測(cè)序。PCR擴(kuò)增使用通用引物，以27F作為上游引物，1492R作為下游引物。

1.2.5發(fā)酵液香味成分的分析及發(fā)酵條件優(yōu)化

將產(chǎn)香菌接入不含瓊脂的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，37 ℃，150 r·min-1振蕩培養(yǎng)24 h。再按一定比例，將種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)72 h。用二氯甲烷萃取發(fā)酵液，收集有機(jī)相于三角瓶中，添加一定量無(wú)水硫酸鈉，4 ℃靜置過(guò)夜。加入1 mL乙酸苯乙酯作為定量分析的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，經(jīng)濃縮處理，得到1 mL淡黃色揮發(fā)性物質(zhì)，進(jìn)行GC/MS定性定量分析，確定其特征香味物質(zhì)。通過(guò)3次重復(fù)單因素試驗(yàn)探究料液比、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、起始pH值以及微生物接種量對(duì)發(fā)酵液產(chǎn)香效果的影響，并用SPSS 19.0 軟件對(duì)各因素進(jìn)行方差分析，同時(shí)通過(guò)正交試驗(yàn)對(duì)其最佳發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化[15-16]。

2　結(jié)果與分析

2.1菌株的篩選分離及鑒定

從不同原材料中共分離出71株菌，其中18株對(duì)篩選培養(yǎng)基有產(chǎn)香效果，將其分別接入發(fā)酵培養(yǎng)基后，最終選出1株有明顯增香效果的菌種，編號(hào)為GXY35，發(fā)酵增香菌的生理生化鑒定結(jié)果見(jiàn)表1。PCR產(chǎn)物經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化，篩選陽(yáng)性克隆和測(cè)序，得到長(zhǎng)度為1 058 bp的序列，提交到GenBank，采用BLAST程序與已知序列進(jìn)行相似性分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵增香菌GXY35與Klebsiellasp. SHN-1，Klebsiellasp. SFR-111，Klebsiellavariicolastrain XF13等克雷伯氏桿菌屬(Klebsiellasp.)的菌株同源性均為99%，且其生理生化鑒定結(jié)果也與之符合，故將GXY35鑒定為克雷伯氏桿菌屬(Klebsiellasp.)。

2.2發(fā)酵液特征香味成分分析

準(zhǔn)確量取50 mL發(fā)酵液于圓底燒瓶中，再向其中加入300 mL蒸餾水和30 g NaCl，以60 mL二氯甲烷作為萃取劑，在60 ℃水浴中進(jìn)行同時(shí)蒸餾萃取，結(jié)果如圖1。萃取150 min后，分離有機(jī)相，加入1 mL乙酸苯乙酯作為定量分析的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，在60 ℃水浴中減壓濃縮，除去大部分有機(jī)溶劑，得到淡黃色揮發(fā)性物質(zhì)。所得揮發(fā)性組分進(jìn)行GC/MS分析。

表1菌株GXY35生理生化反應(yīng)鑒定結(jié)果

Table 1Identification result of strain GXY35 by physiological and biochemical test

測(cè)試項(xiàng)目測(cè)試結(jié)果測(cè)試項(xiàng)目測(cè)試結(jié)果革蘭氏染色-V-P-鞭毛染色-淀粉水解-芽孢染色-硝酸鹽-伴孢晶體-吲哚-莢膜染色+石蕊牛奶+檸檬酸鹽+甲基紅M-R+葡萄糖產(chǎn)酸-明膠液化-

注：-為陰性； +為陽(yáng)性。

采用同時(shí)蒸餾萃取方法，得到一個(gè)峰面積相對(duì)于其他成分較高的香味物質(zhì)，通過(guò)質(zhì)譜分析后，確定該香味物質(zhì)成分為4-乙烯基愈創(chuàng)木酚(圖2)，并以4-乙烯基愈創(chuàng)木酚作為該產(chǎn)香菌株的特征發(fā)酵產(chǎn)香物質(zhì)。

圖1　同時(shí)蒸餾萃取發(fā)酵液氣質(zhì)色譜圖Fig.1　Temperament chromatogram of fermentation broth by SED

2.3菌株產(chǎn)香發(fā)酵條件優(yōu)化

2.3.1發(fā)酵溫度對(duì)香味物質(zhì)含量的影響

從圖3可以看出，溫度對(duì)微生物的生長(zhǎng)及特征香味物質(zhì)含量有顯著影響。發(fā)酵溫度過(guò)高或過(guò)低都不利于微生物的生長(zhǎng)，在37 ℃時(shí)，香味物質(zhì)累積量最大，說(shuō)明微生物代謝能力在此時(shí)較強(qiáng)。

2.3.2起始pH值對(duì)香味物質(zhì)含量的影響

在37 ℃下，測(cè)定菌株發(fā)酵產(chǎn)香的最適初始pH。由圖4可看出，當(dāng)起始pH值為7.0時(shí)，特征香味物質(zhì)的積累量達(dá)到最大。

2.3.3微生物接種量對(duì)香味成分的影響

由圖5可以看出，隨著微生物接種量的增加，發(fā)酵液香味物質(zhì)含量也隨之增大。當(dāng)接種量從8%提高到12%時(shí)，香味物質(zhì)成分的含量顯著增加，但增幅不及之前?？紤]到工業(yè)生產(chǎn)中的成本問(wèn)題，因此選擇8%作為最適微生物接種量。

2.3.4料液比對(duì)香味成分的影響

控制料液比分別為1∶20，1∶12，1∶10和1∶8，向發(fā)酵液中添加煙末，在初始pH值7.0，微生物接種量8%，發(fā)酵溫度37 ℃條件下，發(fā)酵72 h，研究不同料液比對(duì)香味成分含量的影響，結(jié)果如圖6所示。隨著料液比的增大，菌株產(chǎn)香效果先穩(wěn)步增加；但當(dāng)料液比增大到1∶8時(shí)，特征香味物質(zhì)含量顯著下降。這可能是由于較高的料液比下，不利于微生物與溶氧的充分接觸，降低了其代謝強(qiáng)度。綜合考慮，選擇1∶10為微生物發(fā)酵的最適料液比。

圖2　4-乙烯基愈創(chuàng)木酚與標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)的對(duì)比Fig.2　Comparison between 4-vinylgualacol and the standard library of spectra

不同處理間無(wú)相同小寫字母的表示差異顯著(P<0.05)，下同。圖3　發(fā)酵溫度對(duì)香味成分含量的影響Fig.3　Effect of fermentation temperature on content of aroma components

圖4　起始pH值對(duì)香味成分含量的影響Fig.4　Effect of pH on content of aroma components

2.3.5發(fā)酵時(shí)間對(duì)香味成分的影響

按1∶10的料液比向發(fā)酵液中添加煙末，在初始pH值7.0，微生物接種量8%，發(fā)酵溫度37 ℃條件下，分別發(fā)酵24，48，72，96 h，研究不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)香味成分的影響情況。由圖7可知，隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，特征香味物質(zhì)含量增加；但當(dāng)發(fā)酵時(shí)間從72 h延長(zhǎng)至96 h，香味物質(zhì)含量增幅較??；且較長(zhǎng)的發(fā)酵時(shí)間可能會(huì)造成發(fā)酵液中煙堿累積量增加，故選擇72 h為最適發(fā)酵時(shí)間。

圖5　微生物接種量對(duì)香味成分含量的影響Fig.5　Effect of inoculums size on content of aroma components

圖6　料液比對(duì)香味成分含量的影響Fig.6　Effect of solid-liquid ratio on content of aroma components

圖7　發(fā)酵時(shí)間對(duì)香味成分的影響Fig.7　Effect of fermentation time on content of aromacomponents

2.4產(chǎn)香發(fā)酵條件優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取發(fā)酵溫度、起始pH值、接種量、發(fā)酵時(shí)間和料液比5個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，具體水平設(shè)置見(jiàn)表2。

正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，極差由大到小依次是A>D>B>C>E，表明各因素對(duì)香味物質(zhì)含量的影響依次為溫度>發(fā)酵時(shí)間>起始pH>接種量>料液比，最佳組合為A3B3C4D3E1，即料液比1∶20，接種量12%，發(fā)酵溫度37 ℃，發(fā)酵時(shí)間72 h，起始pH值7.0。在此條件下，特征香味物質(zhì)的含量最高，通過(guò)內(nèi)標(biāo)物質(zhì)計(jì)算其準(zhǔn)確含量，可達(dá)0.725 mg·mL-1。對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果做方差分析，結(jié)果顯示，各因素中只有溫度對(duì)特征香味物質(zhì)含量的影響達(dá)到顯著水平。

表2正交試驗(yàn)因素水平表

Table 2Factors and levels in orthogonal array design

水平A:溫度/℃B:起始pHC:接種量/%D:發(fā)酵時(shí)間/hE:料液比水平1285.01241∶20水平2326.04481∶12水平3377.08721∶10水平4439.012961∶8

表3正交試驗(yàn)結(jié)果

Table 3Results of orthogonal array design

試驗(yàn)號(hào)ABCDE含量/(mg·mL-1)1111110.5202122220.5273133330.5524144440.3515212340.5376221430.3647234120.3478243210.3139313420.41110334310.72511331240.38112342130.53813414230.17114423140.10115432410.14116441320.112K10.4870.4090.3440.3760.424K20.3900.3550.3990.3480.349K30.5130.4290.3440.4810.406K40.1310.3290.4360.3170.343R0.3820.1000.0920.1640.081

3　討論

煙葉經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)陌l(fā)酵處理后，青雜氣明顯減弱，香氣突出較好，而油潤(rùn)和光澤基本保持，煙葉品質(zhì)有較明顯的改善，其煙葉等級(jí)也有相應(yīng)的提升[17-18]。煙葉在發(fā)酵后，其葉片表面上仍然生存著一些優(yōu)勢(shì)種群的微生物，即使在溫度高達(dá)70 ℃的條件下進(jìn)行發(fā)酵，仍然會(huì)有一些微生物殘存于煙葉表面。本研究從陳化的煙葉表面篩選出一株發(fā)酵產(chǎn)香菌株GXY35，該菌株能夠利用廢棄煙末發(fā)酵生產(chǎn)制備煙草生物香料。通過(guò)常規(guī)形態(tài)學(xué)、生理生化反應(yīng)以及16S rRNA序列分析對(duì)菌株進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明，GXY35分離菌株屬于克雷伯氏桿菌屬(Klebsiellasp.)。在研究料液比、接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間和起始pH各單因素影響的基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)，得出菌株GXY35產(chǎn)香的最佳發(fā)酵條件為：料液比1∶20，接種量12%，發(fā)酵溫度37 ℃，發(fā)酵時(shí)間72 h，起始pH值7.0。通過(guò)GC/MS圖譜分析可知，發(fā)酵液中主要的揮發(fā)性香味成分有：4-乙烯基愈創(chuàng)木酚、異戊酸、棕櫚酸、5-羥甲基糠醛、糠醇、2，3-二氫苯并呋喃、2-乙酰基吡咯等，相對(duì)含量以4-乙烯基愈創(chuàng)木酚的最高。在最佳發(fā)酵條件下，菌株產(chǎn)香的特征香味物質(zhì)4-乙烯基愈創(chuàng)木酚的含量可以達(dá)到0.725 mg·mL-1。目前，國(guó)內(nèi)少有利用廢棄煙末發(fā)酵制取煙用香料的研究報(bào)道，明紅梅等[19]利用芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)香制備香曲，其產(chǎn)香物質(zhì)每100 g樣品中僅含有1.710 mg愈創(chuàng)木酚，與其相比，GXY35菌株具有更高效的產(chǎn)香能力。利用GXY35菌株對(duì)廢棄煙末進(jìn)行發(fā)酵制備生物香料，能夠產(chǎn)生4-乙烯基愈創(chuàng)木酚的特征香味物質(zhì)成分，可以定向增加卷煙的香氣，還可為開(kāi)發(fā)帶有煙草天然香韻的生物香料及在卷煙加工過(guò)程中增加香氣提供科學(xué)依據(jù)，且有望實(shí)現(xiàn)煙渣廢棄物的高附加值、無(wú)害化和資源化利用，降低卷煙生產(chǎn)資源的浪費(fèi)，為煙草加工和煙草農(nóng)業(yè)的綠色清潔生產(chǎn)提供技術(shù)支持。

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(責(zé)任編輯高峻)

Isolation and identification of an aroma-producing strain and optimization of its fermentation condition

YU Xiang1， LI Yuan-shi2， LIU Dong3, WANG Rui-ting2， TIE Jin-xin1, MA Lin1，*

(1.SchoolofFoodandBioengineering，ZhengzhouUniversityofLightIndustry，Zhengzhou450002，China; 2.ProductionandTechnicalCenter，JilinTobaccoIndustryCo.，Ltd.，Yanji133000，China; 3.TechniqueCenter,ChinaTobaccoGuangdongIndustrialCo.,Ltd,Guangzhou510385,China)

An aroma-producing strain GXY35 was isolated from 14 kinds of tobacco leaves， and the aroma components were analyzed by gas chromatography-mass spectrometry (GC/MS). The strain was identified asKlebsiellasp. from physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA. The content of 4-vinylgualacol in fermentation broth was the highest. On the basis of single factor test， the fermentation condition of strain was optimized by orthogonal experiment. The optimal fermentation condition was as follows: the solid-liquid ratio of 1∶20， the inoculums size of 12%， the fermentation temperature of 37 ℃， the fermentation time of 72 h， and the initial pH of 7.0. Under the optimal fermentation condition， the content of the characteristic favoring substance of 4-vinylgualacol was 0.725 mg·mL-1.

bioflavours; characteristic flavoring substances; aroma-producing fermentation; flavor compounds in cigarette

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.04.20

2015-08-07

余翔(1991—)，男，河南信陽(yáng)人，碩士研究生，研究方向?yàn)闊煵萆锛夹g(shù)。E-mail: yuxiang7455718@163.com

，馬林，E-mail: malindf@vip.sina.com

TS49

A

1004-1524(2016)04-0670-06

余翔，李元實(shí)，劉棟，等. 一株增香微生物的分離鑒定及其發(fā)酵產(chǎn)香條件優(yōu)化[J]. 浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2016，28(4)： 670-675.