BABA, BTH對番茄白粉病的抗性研究

李會佳，朱露露，李　帥，楊歡歡，張冬野，汪　強，吳明臣，李景富

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院 ，黑龍江 哈爾濱 150030)

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BABA, BTH對番茄白粉病的抗性研究

李會佳，朱露露，李帥，楊歡歡，張冬野，汪強，吳明臣，李景富*

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院 ，黑龍江 哈爾濱 150030)

分別以500 mg·L-1BABA和50 mg·L-1BTH兩種誘導(dǎo)劑處理番茄幼苗，后期進行白粉病菌的接種，接種時間分別為誘導(dǎo)劑處理后1，2，3，5，8和15 d。通過病情指數(shù)、相對防效、H2O2和NO含量以及抗白粉病相關(guān)基因表達水平的測定，比較分析兩種誘導(dǎo)劑的作用時間、最優(yōu)處理模式以及抗病的相關(guān)機制。結(jié)果表明：BABA處理后防治效果最佳的間隔時間為第2天，且有效持續(xù)時間為10 d左右，BTH處理后1，3和5 d均為最佳期間且有效持續(xù)時間可達15 d，相對BABA持續(xù)期較長；BABA和BTH誘導(dǎo)后H2O2和NO含量均有顯著增加；兩種誘導(dǎo)劑處理后抗白粉病相關(guān)基因CHI3，GLUCA，GLUCB和PR1A表達趨勢相近，但不同抗病相關(guān)基因在不同處理時間以及不同材料中均存在差異；噴施BABA和BTH后均有助于番茄抵抗白粉病菌的侵染，提高番茄的抗病能力。

BABA；BTH；信使分子；基因表達；番茄；番茄白粉病

番茄白粉病(tomato powdery mildew)是由白粉菌(powdery mildew fungus)引起的傳播性真菌性病害，發(fā)病較常見，對番茄生產(chǎn)造成一定的危害[1]。植物誘導(dǎo)抗病性(induced resistance，IR)又稱植物誘導(dǎo)系統(tǒng)抗病性(induction of systemic resistance，ISR)，是指由生物或非生物因子激活的，依賴于寄主植物的物理或化學(xué)屏障的活化抗性過程[2]。β-氨基丁酸(DL-β-amino-n-butyric acid，BABA)是分泌于番茄根部的一種非蛋白類氨基酸，BABA可誘導(dǎo)馬鈴薯、番茄、葡萄等獲得系統(tǒng)抗性(systemic acquired resistance，SAR)[3]。苯并噻二唑(benzothiadiazole，BTH)與水楊酸結(jié)構(gòu)相似，目前用于植物抗病誘導(dǎo)。BTH可誘導(dǎo)煙草、黃瓜、小麥和向日葵等多種作物產(chǎn)生SAR[4-5]。葛秀春等[6]用BTH處理誘導(dǎo)水稻后，顯著減輕了水稻幼苗稻瘟病的病情，用BTH浸種可誘發(fā)水稻3—4葉期對豬瘟病的抗性。利用誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性是一種省時高效環(huán)保的做法，具有系統(tǒng)性、廣譜性、持續(xù)性、滯后性和安全性的特點。因此，使用誘導(dǎo)劑來提高植物對病害的抗病性，逐漸得到廣泛的使用，有一定研究和應(yīng)用價值。

1　材料與方法

1.1試驗材料

供試材料為：09888(易感白粉病)和09111(抗病)。實驗用番茄白粉病病原菌從東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝站采集分離得到。

1.2試驗方法

β-氨基丁酸(BABA)，苯并噻二唑(BTH)分別用雙蒸水配制，BABA的濃度為500 mg·L-1，BTH的濃度為50 mg·L-1[7]；待番茄幼苗長至6葉期進行噴霧處理，以葉面凝聚水珠而不滴落為宜。噴施清水作為對照。20株番茄為一個處理，設(shè)3次重復(fù)。在第1，2，3，5，8，15天后全株接種白粉菌，孢子懸浮液為5×104mL-1。番茄白粉病的分級標(biāo)準(zhǔn)采用陳林年等[8]的6級分級標(biāo)準(zhǔn)。

1.3項目測定

1.3.1病情指數(shù)、相對防效及數(shù)據(jù)處理

病情指數(shù)=100×∑(各級病葉數(shù)×各級代表值)/(調(diào)查總?cè)~數(shù)×最高級代表值)

相對防效/%=[(對照病指-處理病指)/對照病指]×100

試驗數(shù)據(jù)采用SAS軟件進行方差分析。

1.3.2信使分子的測定

H2O2含量的測定采用Sergiev等[9]的方法；NO含量的測定參照Misko等[10]的方法。

1.3.3抗病相關(guān)基因的qRT-PCR分析

于噴施誘導(dǎo)劑后2，12和24 h剪取幼苗真葉，每次均選取相同部位葉片后立即放入冰盒，于-80 ℃冰箱中保存待用，進行抗病相關(guān)基因的檢測。采用Trizol法對番茄幼嫩葉片的RNA進行提取。利用北京全式金生物技術(shù)有限公司的TransScript ?First-Strand cDNA Synthesis SuperMix，進行cDNA第一鏈的合成。以Actin為內(nèi)參基因，根據(jù)序列分析結(jié)果，目的基因和內(nèi)參基因利用Primer 5.0進行引物設(shè)計。所用引物見表1，由華大基因合成。

表1qRT-PCR引物

Table 1Primers used for qRT-PCR analysis

引物序列(5’→3’)登錄號Actin-f5'-ATGGTGGGTATGGGT-CAAAAAG-3'U60480Actin-r5'-GAGGGGCTTCAGTTAGGAG-GA-3'CHI3-f5'-TGCAGGAACATTCACTGGAG-3'Z15141CHI3-r5'-TAACGTTGTGGCATGATGGT-3'GLUCA-f5'-GGTCTCAACCGCGACATATT-3'M80604GLUCA-r5'-CACAAGGGCATCGAAAAGAT-3'GLUCB-f5'-TCTTGCCCCATTTCAAGTTC-3'M80608GLUCB-r5'-TGCACGTGTATCCCTCAAAA-3'PR1A-f5'-CCAAGACTATCTTGCGGTTC-3'AJ011520PR1A-r5'-GAACCTAAGCCACGATACCA-3'

qRT-PCR分析，采用北京全式金生物技術(shù)有限公司的TransStart? Top Green qPCR SuperMix試劑盒進行，所用熒光染料為SYBR Green Ⅰ，每個樣品設(shè)重復(fù)4次，每個反應(yīng)結(jié)束后，做熔解曲線的分析。反應(yīng)條件為：95 ℃變性3 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s， 72 ℃延伸30 s，循環(huán)數(shù)35個。

每組PCR重復(fù)3次取平均值，對所用引物進行熔解曲線分析后，Actin，CHI3，GLUCA，GLUCB和PR1A，5個基因的熔解曲線均呈現(xiàn)出單一峰，滿足qRT-PCR試驗要求。數(shù)據(jù)采用2T-△△C法進行分析。

2　結(jié)果與分析

2.1最佳誘導(dǎo)間隔期與持效期

于番茄幼苗六葉期噴500 mg·L-1BABA和50 mg·L-1BTH，處理后的1，2，3，5，8，15 d整株接種白粉菌，并進行病情調(diào)查，計算相對防效，結(jié)果見圖1-A。從圖1-A可見：BABA處間隔1 d后接種的相對防效為58%。第2天接種白粉菌的防治效果最佳，相對防效達70%。第3天后由于間隔時間變長，相對防效降低，到第15天時，相對防效僅為12%，說明BABA誘導(dǎo)番茄抗白粉病的有效持續(xù)時間為10 d左右。

從圖1-B可見：BTH處理后間隔1 d后接種的防治效果低于BABA同期水平，相對防效為43%，第3天后接種的相對防效達69%，且第5天后接種的相對防效仍為64%，說明3～5 d為最佳時期。至第8天，防治效果逐漸降低，在第15天，相對防效為20%，說明BTH誘導(dǎo)番茄抗白粉病的有效持續(xù)時間可達15 d，相對BABA持續(xù)期較長。BTH相對于BABA來說，以最佳間隔時間長、持續(xù)周期長的特點，更便于生產(chǎn)應(yīng)用。

2.2信號分子的變化

2.2.1H2O2含量的變化

由圖2-A可見，BABA接種組的H2O2含量于第7天達到最高0.38 mmol·g-1，比對照未接種組高出216.67%，對照接種組達到0.24 mmol·g-1，顯著低于BABA接種組處理。而BABA接種組與對照接種組的H2O2在第8天均有所降低，這可能與前期H2O2的積累量不高，在抑制病原菌侵染的抗病過程中有所消耗所致。在誘導(dǎo)處理后11～13 d，H2O2的逐漸回歸原始對照水平，這說明H2O2作為系統(tǒng)抗病過程中的信號物質(zhì)，因早期激發(fā)抗病反應(yīng)，而被相應(yīng)的酶轉(zhuǎn)化為對植物無害的H2O和O2。由圖2-B結(jié)果顯示，BTH接種組的H2O2含量于第7天達到峰值，為0.37 mmol·g-1，比對照未接種高出208.33%，對照接種組達到0.24 mmol·g-1，明顯低于BTH接種組處理。而BTH接種組與對照接種組的H2O2含量在第9天開始降低，這可能與前期H2O2含量的積累量不高，在抑制病原菌侵染的抗病過程中有所消耗導(dǎo)致。

圖1　不同接種間隔期對BABA和BTH誘導(dǎo)番茄白粉病的影響Fig.1　Relative control effect of BABA and BTH on tomato powdery mildew at different inoculation intervals

2.2.2NO含量的變化

圖3-A可知，BABA接種組的NO含量于第7天達到峰值，為42 μmol·g-1，比對照未接種組高出388.37%，對照接種組達到21 μmol·g-1，明顯低于BABA接種組。而BABA接種組與對照接種組的NO在第8天開始降低，接種組整體NO水平高于對照組水平。由圖3-B結(jié)果可以看出，BTH誘導(dǎo)的接種組的NO含量于第7天達到最高，為44 μmol·g-1，比對照未接種組高出411.62%，明顯高于對照接種組的21 μmol·g-1處理。而BTH接種組與對照接種組的NO含量在第8天開始降低，接種組整體NO水平高于對照組水平。

圖2　BABA和BTH處理對番茄葉片H2O2含量的變化Fig.2　Effect of BABA and BTH on H2O2 content in tomato leaves at different inoculation intervals

圖3　BABA和BTH處理對番茄葉片NO含量的變化Fig.3　Effect of BABA and BTH on NO content in tomato leaves at different inoculation intervals

2.3番茄抗性相關(guān)基因的qRT-PCR表達分析

以500 mg·L-1的BABA和50 mg·L-1的BTH對感病材料(09888)和抗病材料(09111)做噴霧處理，以噴施蒸餾水為對照(CK)，對番茄中4種抗病相關(guān)基因(CHI3，GLUCA，GLUCB和PR1A)進行實時熒光定量PCR分析。結(jié)果表明，兩種材料在經(jīng)過噴施誘導(dǎo)劑后，抗病相關(guān)基因的表達量都要顯著高于CK組，呈逐漸上升趨勢，且均在24 h時表達量達到最大，感病材料中抗病基因的表達量略高于抗病材料。在抗病材料中，BTH處理在24 h的CHI3基因相對表達量為10.4，而在感病材料中為11.5，如圖4-A；GLUCA基因在感抗病材料中差別不大，但在感病材料中的表達量略高于抗病材料，GLUCB基因經(jīng)誘導(dǎo)后表達量的差異較為明顯，在感病材料中的表達量明顯高于抗病材料，如圖4-B和4-C。PR1A基因的相對表達量結(jié)果如圖4-D，結(jié)果同樣表明在感病材料中的表達量高于在抗病材料中的表達量?？傮w趨勢來看，BTH處理的結(jié)果相對于BABA要更好些。四種抗病基因在誘導(dǎo)后，感病材料的表達量要高于抗病材料，表明誘導(dǎo)劑對感病材料起到的誘導(dǎo)作用相對明顯；兩種材料的抗病基因表達量均高于對照組，說明誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)了抗病相關(guān)蛋白的表達，增強抗病性。

圖4　BABA和BTH處理對番茄抗病相關(guān)基因相對表達量的影響Fig.4　Effect of BABA and BTH on expression of disease resistance related genes in tomato

3　結(jié)論與討論

植物經(jīng)過抗性誘導(dǎo)后，需要經(jīng)過一段時間才能表現(xiàn)出抗性作用，即誘導(dǎo)劑的滯后性。Liljeroth等[11]發(fā)現(xiàn)BABA處理感染晚疫病菌的馬鈴薯后，與未處理BABA的樣品相比，感染病菌的樣品損害程度降低了40%～50%，但是，在BABA處理后這種效應(yīng)只持續(xù)了4～5 d后效應(yīng)逐漸降低。本試驗中，BABA處理的最佳間隔時間為2 d，隨著誘導(dǎo)間隔期的延長，防治效果降低，與Liljeroth等[11]的結(jié)果吻合，BABA誘導(dǎo)番茄抗白粉病的持續(xù)時間可達10 d左右。BTH處理后隨著誘導(dǎo)間隔期的延長，防治效果降低，最佳間隔時間為誘導(dǎo)后第3～5天，持續(xù)抗病時間達15 d。說明不同的誘導(dǎo)因子在誘導(dǎo)抗性的表現(xiàn)中滯后性不同。

植物體內(nèi)的活性氧(reactive oxygen species，ROS)與植物的抗病過程有著密切的聯(lián)系。大量的研究證明，病原菌侵染植物細(xì)胞后，能誘導(dǎo)活性氧的迸發(fā)。Doke等[12]在1983年首先發(fā)現(xiàn)晚疫病菌(Phytophthorainfestans)侵染馬鈴薯后，植保素的形成和H2O2的的產(chǎn)生有對應(yīng)關(guān)系。本試驗證明BABA和BTH分別對番茄幼苗噴霧處理后發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)組的H2O2含量明顯高于清水對照組未接種處理。H2O2含量的明顯積累，說明其作為信使分子正在參與植物抗病的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，在后期H2O2含量又回落，說明H2O2參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)后，多余的被相應(yīng)酶系統(tǒng)清除，轉(zhuǎn)化為水和氧。

Noritake等[13]研究發(fā)現(xiàn)NO通過誘導(dǎo)植物累積植保素來提高植物的抗病能力，試驗中發(fā)現(xiàn)施用殼寡糖后，NO的含量明顯增加。本研究發(fā)現(xiàn)，用誘導(dǎo)劑BABA和BTH在適當(dāng)?shù)臐舛认绿幚矸延酌绾?，NO的含量在一定時間內(nèi)有所增加，說明兩種誘導(dǎo)劑可以通過信號分子NO來實現(xiàn)其對植物的誘抗作用。Loon等[14]在1970年首先發(fā)現(xiàn)病程相關(guān)蛋白(PR蛋白)。Ward等[15]證明至少有9種基因家族在PR蛋白中。本試驗中的幾丁質(zhì)酶基因(CHI3)屬于PR-3家族；GLUCA(β-1，3-葡聚糖酶)、GLUCB屬于PR-2家族；PR1A屬于PR-1家族。在噴施誘導(dǎo)劑BABA和BTH后，4個基因的表達趨勢相近，但在不同處理時間、不同抗病相關(guān)基因以及不同材料中均存在差異。Ferraris等[16]對番茄接種枯萎病菌后，β-1，3-葡聚糖酶的活性在抗病品種中的表現(xiàn)低于感病品種。本試驗研究發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)劑BABA和BTH處理番茄后，抗病相關(guān)基因CHI3，GLUCA，GLUCB和PR1A在感病材料中的表達略高于在抗病材料，與Ferraris等[16]的研究結(jié)果一致，可見，噴施BABA和BTH后有助于番茄抵抗白粉病菌的侵染，提高番茄的抗病能力。

[1]SAENZ G S， TAYLOR J W. Phylogeny of the erysiphales (powdery mildew) inferred from internal transcribed spacer(ITS)ribosomal DNA sequence [J].CanadianJournalofBotany， 1999， 77(1):150-168.

[2]KLOPPER J W， TUNZUN S. Proposed definition related to induced disease resistance[J].BiocontrolScienceandTechnology， 1992， 2(4):349-351.

[3]COHEN Y， RUBIN A， VAKNIN M. Post infection application of DL-3-amino-n-butyric acid (BABA) induces multiple forms of resistance againstBremialactucaein lettuce[J].EuropeanJournalofPlantPathology， 2011， 130(1):13-27.

[4]GORLACH J， VOLRATH S， KNAUF-BEITER G， et al. Benzothiadiazole， a novel class of inducers of systemic acquired resistance， activates gene expression and disease resistance in wheat[J].PlantCell， 1996， 8(4):629-643.

[5]TOSI L， LUIGETTI R， ZAZZERINI A. Benzothiadiazole induces resistance to plasmopara h-elianthi in sunflower plants[J].JournalofPhytopathology， 1999， 147(6):365-370.

[6]葛秀春，宋鳳鳴，鄭重，等，BTH誘發(fā)水稻對稻瘟病的系統(tǒng)獲得抗性[J]. 浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報，1999，11(6)：311-314.

[7]朱路路，李帥，李景富，等.幾種化學(xué)誘導(dǎo)劑對番茄白粉病抗性的誘導(dǎo)作用[J].北方園藝，2013(20)：109-111.

[8]陳林年，張玉梅，史登玉.不同藥劑防治加工番茄白粉病試驗研究初報[J].農(nóng)業(yè)科技與信息，2007(2)：30-31.

[9]SERGIEV I， ALEXIEVA V， KARANOVE E. Effect of spermine，atrazine and combination between them on some endogenous protective systems and stress marks in plant[J].ComptesRendusdel’Acade＇mieBulgaredesSciences:SciencesMathe＇matiquesetNaturelles， 1997， 51: 121-124.

[10]MISKO T， SCHILLING R， SALVEMINI D. A fluorometric a assay for the measurement of nitrite in biological samples[J].AnalyticalBiochemistry， 1993， 214(1):11-16.

[11]LILJEROTH E， BENGTSSON T， WIIK L， et al. Induced resistance in potato toPhytphthorainfestans-effect of BABA in greenhouse and field tests with different potato varieties[J].EuropeanJournalofPlantPathology， 2010，127(2):171-183.

[12]DOKE N. Involvement of superoxide anion generation in hyper-sensitive response of potato tuber tissues to infection with an incompatible race ofPhytophthorainfestans[J].PhysiologicalPlantPathology， 1983， 23(3):345-357.

[13]NORITAKE T， LAWAKITA K， DOKE N. Nitric oxide induces phytoalexin accumulation in potato tuber tissues[J].Plant&CellPhysiology， 1996， 37(1):113-116.

[14]van LOON L C， VAN KAMMEN A. Polyacrylamide disc electrophoresis of the soluble proteins fromNicotianatabacumvar. ‘Samsun’ and ‘Samsun NN’. Ⅱ. Changes in protein constitution after infection with tobacco mosaic virus[J].Virology， 1970， 40(2):199-211.

[15]WARD E R， UKNES S J， WILLIAMS S C， et al. Coordinate gene activity in response to agents that induce systemic acquired resistance[J].PlantCell， 1991， 3(10):1085-1094.

[16]FERRARIS L， ABBASTTSTA GENTILE， MATTA A. Activation of glycosidases as a consequence of infection stress inFusariumwilt of tomato[J].JournalofPhytopathology， 1987， 118(4):317-325.

(責(zé)任編輯張韻)

Study on the resistance induced by BABA and BTH against powdery mildew in tomato

LI Hui-jia,ZHU Lu-lu，LI Shuai，YANG Huan-huan，ZHANG Dong-ye，WANG Qiang, WU Ming-chen, LI Jing-fu*

(CollegeofHorticulture，NortheastAgriculturalUniversity，Harbin150030，China)

The tomato seedlings were treated with 500 mg·L-1BABA and 50 mg·L-1BTH respectively， then inoculated with powdery mildew fungus on 1， 2， 3， 5， 8 and 15 d after treatment. The duration of action， optimal processing mode and disease-related mechanisms of two inducers were investigated by measuring disease index， relative control effect, H2O2and NO content and powdery mildew resistance related gene expression levels. The results showed that the best time of BABA was the second day and the effective duration was about 10 days， the best time of BTH was the first， third and fifth day and the effective duration was up to 15 days. The contents of H2O2and NO were significantly increased. The expression patterns ofCHI3，GLUCA，GLUCB，PR1Agenes all showed similar trend， but had differences at different treatment time in different materials. In conclusion， BABA and BTH could be used to improve the disease resistance of tomato to tomato powdery mildew.

BABA；BTH；messenger molecules；gene expresstion; tomato; tomato powdery mildew

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.04.07

2015-09-07

“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國家科技計劃課題(2012BAD02B02-7)

李會佳(1989—)，男，黑龍江佳木斯人，碩士，從事番茄育種研究。E-mail: lhj1949@hotmail.com

，李景富，E-mail: lijf_2005@126.com

S641.2

A

1004-1524(2016)04-0580-06

李會佳，朱露露，李帥，等. BABA, BTH對番茄白粉病的抗性研究[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報，2016，28(4)： 580-585.