蝦夷扇貝毒素（yessotoxin）誘導(dǎo)的櫛孔扇貝（Chlamys farreri）體內(nèi)P糖蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)活性及其分布研究

趙翠瓊，高春蕾，姜美潔，賈智慧，王宗興，王宗靈,#

1.國(guó)家海洋局第一海洋研究所，青島266061

2.青島海洋科學(xué)與技術(shù)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)功能實(shí)驗(yàn)室，青島266061

3.國(guó)家海洋局東海預(yù)報(bào)中心，上海200081

蝦夷扇貝毒素（yessotoxin）誘導(dǎo)的櫛孔扇貝（Chlamys farreri）體內(nèi)P糖蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)活性及其分布研究

趙翠瓊1,2,3，高春蕾1,2,*，姜美潔1,2，賈智慧1,2，王宗興1,2，王宗靈1,2,#

1.國(guó)家海洋局第一海洋研究所，青島266061

2.青島海洋科學(xué)與技術(shù)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)功能實(shí)驗(yàn)室，青島266061

3.國(guó)家海洋局東海預(yù)報(bào)中心，上海200081

大量研究表明P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)介導(dǎo)的多型異源物質(zhì)抗性機(jī)制(multi-xentiobiotic resistance,MXR)在貝類耐受或抵抗污染水域中有毒有害物質(zhì)的毒害中具有重要作用，但是該機(jī)制在貝類抵抗或耐受食源性毒素方面作用的研究卻很少。本研究以櫛孔扇貝(Chlamys farreri)為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，向其投喂產(chǎn)蝦夷扇貝毒素(yessotoxins,YTXs)的網(wǎng)狀原角藻(Protoceratium reticulatum)，通過(guò)檢測(cè)櫛孔扇貝鰓和消化腺組織中YTX毒素含量隨時(shí)間的變化情況，結(jié)合2種組織中P-gp介導(dǎo)的MXR活性變化及P-gp在組織中的表達(dá)和分布，探討P-gp在扇貝耐受YTX毒素中可能的作用。研究結(jié)果表明，隨著毒藻暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，櫛孔扇貝鰓和消化腺中YTX含量逐漸增加，且具有明顯的時(shí)間依賴關(guān)系。YTX的大量累積雖未導(dǎo)致扇貝死亡，但是仍然對(duì)扇貝組織產(chǎn)生不同程度的毒性。蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色發(fā)現(xiàn)，染毒12 h后，櫛孔扇貝鰓組織前端出現(xiàn)明顯黑化，消化腺組織導(dǎo)管上皮細(xì)胞部分脫落入管腔中，腺管內(nèi)細(xì)胞界限模糊，部分腺管崩解。羅丹明B(rhodamine B,RhoB)外排實(shí)驗(yàn)表明YTX毒素暴露能顯著增強(qiáng)櫛孔扇貝鰓和消化腺組織中P-gp的轉(zhuǎn)運(yùn)活性，暴露12 h后鰓和消化腺RhoB的排出速率就已分別達(dá)到對(duì)照組的3.8倍和1.4倍，隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，P-gp活性略有增強(qiáng)，72 h后開(kāi)始下降；P-gp的功能性抑制劑維拉帕米(verapamil,VRP)在實(shí)驗(yàn)設(shè)定的濃度下沒(méi)有抑制反而增強(qiáng)了RhoB的外排；免疫定位顯示，毒素暴露后櫛孔扇貝鰓絲前端纖毛柱狀細(xì)胞及消化腺導(dǎo)管上皮柱狀細(xì)胞和腺管消化細(xì)胞P-gp免疫陽(yáng)性信號(hào)增強(qiáng)，說(shuō)明YTX毒素暴露提高了P-gp的表達(dá)量。綜上推斷，YTX毒素可能是P-gp的底物，它能夠誘導(dǎo)P-gp轉(zhuǎn)運(yùn)活性增強(qiáng)，并增加P-gp的表達(dá)量來(lái)參與扇貝對(duì)YTX毒素的耐受或抗性；設(shè)定濃度的VRP不能抑制P-gp的活性，這可能是由于種屬差異造成的，關(guān)于VRP對(duì)櫛孔扇貝P-gp的作用還有待進(jìn)一步的研究。

蝦夷扇貝毒素；櫛孔扇貝；網(wǎng)狀原角藻；鰓；消化腺；P糖蛋白；羅丹明B；維拉帕米

趙翠瓊,高春蕾,姜美潔,等.蝦夷扇貝毒素(yessotoxin)誘導(dǎo)的櫛孔扇貝(Chlamys farreri)體內(nèi)P糖蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)活性及其分布研究[J].生態(tài)毒理學(xué)報(bào)，2016,11(3):281-293

Zhao C Q,Gao C L,Jiang M J,et al.Transport activity and distribution of P-glycoprotein induced by yessotoxin in scallopChlamys farreri[J].Asian Journal of Ecotoxicology,2016,11(3):281-293(in Chinese)

多型異源物質(zhì)抗性機(jī)制(multi-xenobiotic resistance,MXR)被認(rèn)為是水生生物抵抗環(huán)境中有害物質(zhì)的第一道防線[1]，P糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)是介導(dǎo)MXR的眾多蛋白中的一種，也是目前研究最多最深入的一種蛋白[2]。P-gp通過(guò)水解ATP將外源物質(zhì)(如毒素、藥物、重金屬等)泵出細(xì)胞外，降低有害物質(zhì)在體內(nèi)的累積和對(duì)機(jī)體造成的傷害[2-4]，從而提高水生生物對(duì)有害物質(zhì)的抗性或耐受性。所以，P-gp也被認(rèn)為是ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族中與毒理相關(guān)性最高的一種蛋白[5]。目前，P-gp介導(dǎo)的MXR已經(jīng)在貽貝、扇貝、牡蠣、蛤等雙殼貝類體內(nèi)得到證實(shí)。

貝類中P-gp介導(dǎo)的MXR的研究主要集中在貝類對(duì)重金屬和有機(jī)污染物耐受性方面。Kurelec[2]于1992年首次證實(shí)了致癌物質(zhì)苯并[α]芘(benzopyrene,B[α]P)和乙酰氨基芴(2-acetylaminofluorene,2-AAF)誘導(dǎo)紫貽貝(Mytilus galloprovincialis)和河蚌(Anodonta cygnea)鰓組織產(chǎn)生的MXR是由P-gp介導(dǎo)的，其轉(zhuǎn)運(yùn)活性受到多藥耐藥機(jī)制(multi-drug resistance,MDR)的抑制劑維拉帕米(verapamil,VRP)的抑制。不同濃度的B[α]P染毒實(shí)驗(yàn)表明B[α]P能誘導(dǎo)櫛孔扇貝(Chlamys farreri)鰓和消化腺組織P-gp的大量表達(dá)，并呈明顯的劑量依賴性和時(shí)間依賴性[6-7]。1996年，Waldmann等[8]報(bào)道了長(zhǎng)春新堿(3H-vincristine,3H-VCR)和2-AAF均能誘導(dǎo)河蜆(Corbicula fluminea)的鰓組織大量合成P-gp，VRP和星孢菌素(staurosporine,STP)則能抑制P-gp轉(zhuǎn)運(yùn)活性。李志茹[9]關(guān)于鎘(Cd)在文蛤(Meretrix lusoria)、毛蚶(M.meretrix)、紫貽貝(M.edulis)和太平洋牡蠣(Crassostrea gigas)等不同雙殼貝類體內(nèi)富集和脫除實(shí)驗(yàn)表明，暴露于Cd中的貝類，尤其是毛蚶，其P-gp的表達(dá)活性顯著增強(qiáng)，且對(duì)Cd的富集和脫除過(guò)程中均有重要作用。

除上述有機(jī)污染物和重金屬外，P-gp在貝類對(duì)藻毒素的抗性中也發(fā)揮了重要作用。以產(chǎn)石房蛤毒素(saxitoxin,STX)的鏈狀亞歷山大藻(Alexandrium catanella)為餌料投喂加州貽貝(M.californicus)，其鰓組織MXR排出羅丹明B(rhodamine B,RhoB)的量大于未投喂毒藻時(shí)[10]。腹瀉性貝毒(diarrhetic shellfish poisoning,DSP)中的大田軟海綿酸(okaoaic acid, OA)作用于近江牡蠣(C.ariakensis)后，其鰓組織中P-gp活性顯著升高，且mRNA的表達(dá)顯著上調(diào)[11]。Svensson等[12]在紫貽貝暴露于OA的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，貽貝溶酶體的膜上也存在MXR。

我國(guó)是一個(gè)貝類養(yǎng)殖大國(guó)，也是有毒有害赤潮頻發(fā)的國(guó)家。除了發(fā)生頻率高、影響較為嚴(yán)重的麻痹性貝毒(paralytic shellfish poisoning,PSP)和DSP外，近幾年從我國(guó)沿海貝類中不斷有新的生物毒素被檢出，蝦夷扇貝毒素(yessotoxins,YTXs)就是其中的一類[13]。

YTXs為脂溶性多環(huán)聚醚類化合物，主要由網(wǎng)狀原角藻(Protoceratium reticulatum)[14]、多邊舌甲藻(Lingulodinium polyedrum)[15]和具刺膝溝藻(Gonyaulax spinifera)[16]等海洋甲藻產(chǎn)生，貝類通過(guò)濾食這些有毒藻極易在體內(nèi)累積和轉(zhuǎn)化YTXs。2010年，高春蕾等[17]首次從中國(guó)沿海貝類海灣扇貝(Argopecten irradians)和蝦夷扇貝(Patinopecten yessoensis)中檢出YTXs，之后不斷有從貝類中檢出YTXs毒素的報(bào)道，而且貝類中YTXs的含量呈逐步增加的趨勢(shì)，如陳建華等[18]從2011年采自北黃海海域的蝦夷扇貝樣品中檢測(cè)到的YTX毒素含量竟高達(dá)6.68 ×103μg·kg-1。盡管貝類中累積了如此大量的YTX毒素，但是鮮有報(bào)道貝類因此死亡的事件，因此推測(cè)P-gp可能在貝類耐受YTXs中發(fā)揮了重要作用。

本研究以我國(guó)近海重要的經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖貝類-櫛孔扇貝為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，通過(guò)投喂產(chǎn)YTX毒素的毒藻暴露實(shí)驗(yàn)，研究YTX毒素暴露前后櫛孔扇貝體內(nèi)P-gp活性的變化、P-gp在扇貝組織中的分布與定位等，闡明YTX毒素累積與P-gp活性及其表達(dá)的相關(guān)性，為雙殼貝類毒素抗性或耐受機(jī)制研究提供數(shù)據(jù)。

1 材料與方法（Materials and methods）

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

主要試劑：甲醇、乙醇、二甲苯、氯化鈉(NaCl)、氯化鉀(KCl)及其他試劑均為分析純，購(gòu)自上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。SABC免疫組化試劑盒，購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

主要儀器：S10型手提式高速分散器(新芝,寧波)，5804R離心機(jī)(Eppendorf,Germany)，NDK200-2氮吹儀(百典，上海)，1200高效液相色譜儀(Agilent,USA)，API4000三重四極桿質(zhì)譜檢測(cè)器(Applied Biosystems GmbH,Germany)，LS-55熒光分光光度計(jì)(PerkinElmer, USA)，TE2000-U倒置顯微鏡(Nikon,Japan)。

1.2 藻種及培養(yǎng)條件

本實(shí)驗(yàn)所用網(wǎng)狀原角藻由國(guó)家海洋環(huán)境監(jiān)測(cè)中心提供，分離自北黃海海域。

藻種培養(yǎng)所用海水取自青島石老人海水浴場(chǎng)，鹽度為31，pH值為7.9±0.1，砂濾后經(jīng)過(guò)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，轉(zhuǎn)移至三角瓶中高溫高壓(120℃，0.12 MPa)滅菌冷卻至室溫，參照Guillard和Hargraves的方法[19]按比例加入無(wú)Si的L1培養(yǎng)基(L1-Si)，于溫度為15℃且光照強(qiáng)度為5 000 lux的恒溫恒濕氣候室中培養(yǎng)，光暗比為12 h:12 h。取平臺(tái)期的網(wǎng)狀原角藻藻細(xì)胞用于貝類投喂實(shí)驗(yàn)。

1.3 櫛孔扇貝的毒藻投喂

實(shí)驗(yàn)用櫛孔扇貝，采自青島太平角養(yǎng)殖場(chǎng)。選擇30只健康且大小基本一致((28±1.5)g)的個(gè)體，洗凈體表污泥，黑暗條件下于塑料培養(yǎng)箱中以3 L砂濾海水：1只扇貝的養(yǎng)殖密度進(jìn)行暫養(yǎng)馴化10 d，培養(yǎng)溫度為15℃。暫養(yǎng)期間進(jìn)行不間斷通氣，每24 h更換海水且每12 h投喂螺旋藻粉1次，使其保持良好的生理狀態(tài)。

實(shí)驗(yàn)前12 h停止喂食螺旋藻，準(zhǔn)備毒藻投喂。毒藻投喂周期為3 d，期間櫛孔扇貝的養(yǎng)殖密度、溫度、光暗條件等均與馴化期相同。根據(jù)櫛孔扇貝清濾率以及網(wǎng)狀原角藻的細(xì)胞密度，每12 h投喂密度為8.80×106cells·L-1的網(wǎng)狀原角藻藻液1次，投喂后水體中有毒藻細(xì)胞密度大約為9.78×104cells·L-1。每24 h更換海水，清除培養(yǎng)箱中的殘留物，觀察櫛孔扇貝生理狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，保持培養(yǎng)箱中櫛孔扇貝養(yǎng)殖密度以及網(wǎng)狀原角藻細(xì)胞密度穩(wěn)定，即每次取出扇貝樣品后相應(yīng)地減少培養(yǎng)箱中海水體積以及毒藻藻液投喂體積。

1.4 藻毒素及扇貝組織中YTXs含量的測(cè)定

1.4.1 藻毒素的提取

取平臺(tái)期的網(wǎng)狀原角藻藻液20 mL，低真空條件下25 mm GF/F玻璃纖維膜上過(guò)濾。將帶有藻細(xì)胞的濾膜用4 mL 80%甲醇冰浴中手提式高速分散器破碎，6 500 r·min-1離心10 min，收集上清；重復(fù)提取1次，合并2次的上清液，80%甲醇定容至10 mL。氮吹儀吹干粗提液(40℃，N2流)，1 mL 80%甲醇重懸，用0.22 μm一次性針頭濾器過(guò)濾，混勻，備用。

1.4.2 扇貝組織中毒素的提取

毒藻投喂期間，取不同投喂時(shí)間(0 h、12 h、24 h、48 h和72 h)的櫛孔扇貝各3只，冰上迅速開(kāi)殼，分別取出完整的鰓和消化腺組織按1 g貝組織：4 mL 80%甲醇的比例，冰浴條件下于玻璃組織研磨器中研磨成組織勻漿，并轉(zhuǎn)移到50 mL離心管中；用渦旋混勻器震蕩混勻后，4℃條件下6 000 r·min-1離心15 min，取上清。重復(fù)提取1次，合并2次的上清液，并用80%甲醇定容至10 mL，經(jīng)0.22 μm一次性針頭濾器過(guò)濾，混勻，備用。

1.4.3 YTXs及其他脂溶性毒素的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)

采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行YTX及其他脂溶性毒素的檢測(cè)。

液相色譜-質(zhì)譜系統(tǒng)：Agilent1200液相系統(tǒng)(包括G1311A四元泵、G1313A自動(dòng)進(jìn)樣器，G1316A柱溫箱)；API4000三重四極桿質(zhì)譜檢測(cè)器，離子源為ESI電噴霧離子源；液相色譜柱為Phenomenex RP C18柱(150 mm×3.0 mm，5 μm)。液相色譜條件：流動(dòng)相A為水(含0.1%甲酸，5 mmol·L-1甲酸銨)，流動(dòng)相B為95%乙腈水溶液(含0.1%甲酸，5 mmol·L-1甲酸銨)；流速為0.3 mL·min-1，進(jìn)樣體積10 μL，柱溫30℃，梯度洗脫程序如表1所示。質(zhì)譜檢測(cè)條件：采用ESI±切換多參數(shù)掃描方式(MRM)，各項(xiàng)參數(shù)見(jiàn)表2和表3。

表1 液相色譜梯度洗脫程序Table 1 HPLC gradient elution procedures

表2 MRM參數(shù)（正離子模式）Table 2 The parameters of MRM(positive ion mode)

表3 MRM參數(shù)（負(fù)離子模式）Table 3 The parameters of MRM(negative ion mode)

1.5 P糖蛋白的活性測(cè)定

在毒藻投喂期間，取不同投喂時(shí)間(0 h、12 h、24 h、48 h和72 h)的櫛孔扇貝各3只，冰上迅速開(kāi)殼，分別取出鰓和消化腺組織，并快速于分析天平上分別稱取約100 mg的2個(gè)平行樣，用于P-gp活性的測(cè)定，剩余組織用于后期石蠟組織切片的制備。

P-gp活性的測(cè)定參照Ivanina等[20]的方法，采用RhoB作為P-gp底物。RhoB在鰓和消化腺等組織中短暫積累后，通過(guò)測(cè)定RhoB排出速率來(lái)考察不同組織P-gp活性，用單位pmol RhoB·min-1·g-1來(lái)表示。在RhoB外排過(guò)程中，采用66.7 μmol·L-1VRP作為抑制劑，觀察其對(duì)RhoB排出速率的影響。

1.6 P糖蛋白在扇貝組織中的免疫定位

1.6.1 石蠟組織切片的制備

將1.4中解剖的部分鰓和消化腺組織，于Davidson’s AFA固定液中固定，按照常規(guī)石蠟組織切片制備方法制作石蠟切片，室溫存放。

1.6.2 P糖蛋白免疫定位染色

取組織切片，于二甲苯中脫蠟后經(jīng)系列濃度梯度的乙醇溶液復(fù)水，再以pH 7.2的0.01 mol·L-1PBS溶液洗凈。為減少蛋白的非特異性結(jié)合，室溫條件下以PBS 1∶10稀釋的正常山羊血清封閉液孵育30 min，封閉切片。以PBS稀釋過(guò)的鼠抗P-gp (C219)(Calbiochem,Merck Millipore,Germany)作為一抗孵育切片，4℃過(guò)夜后于PBS中浸洗3次，每次5 min。以生物素化山羊抗鼠IgG(博士德，武漢)作為二抗，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行稀釋，室溫條件下孵育30 min。二抗孵育結(jié)束后，用PBS浸洗切片3次，每次5 min。滴加PBS稀釋的鏈霉親和素-生物素化DyLight 488熒光染料(DyLight 488-SABC)室溫孵育30 min后，用PBS沖洗切片5 min停止著色反應(yīng)。之后，將切片置于PBS中浸洗4次，每次5 min。經(jīng)過(guò)處理的組織切片，使用水溶性封片劑進(jìn)行封片，并在熒光顯微鏡下觀察組織顯色情況，拍照記錄。

1.6.3蘇木精伊紅染色

蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色過(guò)程中，采用傳統(tǒng)方法將組織切片脫蠟復(fù)水后進(jìn)行HE染色。蘇木精染液染色15 min后，以緩流水沖洗5 min；5%的冰醋酸分化18 s，再通過(guò)溫水(45℃)沖洗2 min反藍(lán)；伊紅染液染色1 min后，以ddH2O沖洗2 min，觀察染色結(jié)果，并拍照記錄。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與處理

采用軟件SPSS17.0進(jìn)行單因素方差分析，α= 0.05，數(shù)據(jù)以M±S.D.表示。

2 結(jié)果（Results）

2.1 櫛孔扇貝組織中YTX濃度變化

LC-MS/MS檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，網(wǎng)狀原角藻(北黃海株)主要產(chǎn)YTX(97%)以及極少量的Homo-YTX等毒素，所以本研究在對(duì)櫛孔扇貝進(jìn)行毒藻投喂過(guò)程中，主要檢測(cè)扇貝體內(nèi)YTX濃度的變化及YTX對(duì)P-gp的誘導(dǎo)情況。

圖1反映了不同染毒時(shí)間段櫛孔扇貝鰓和消化腺組織中YTX含量的變化情況。從圖中可以看出，72 h內(nèi)，隨著染毒時(shí)間的增加，櫛孔扇貝鰓和消化腺組織中YTX含量均呈逐漸增加的趨勢(shì)。

投喂毒藻前，櫛孔扇貝鰓和消化腺組織中YTX的本底濃度分別為0.26 μg·kg-1組織和0.24 μg·kg-1組織。染毒12 h后，櫛孔扇貝鰓和消化腺中YTX濃度分別升高至52.31 μg·kg-1組織和9.68 μg·kg-1組織，為本底濃度的200倍和40倍；染毒72 h后，分別升高至275.20 μg·kg-1組織和134.50 μg·kg-1組織。

圖1 櫛孔扇貝腮組織和消化腺中YTX毒素濃度隨暴露時(shí)間的變化

2.2 YTX對(duì)櫛孔扇貝組織的毒性作用

HE染色發(fā)現(xiàn)，櫛孔扇貝在YTX染毒12 h后，鰓絲前側(cè)纖毛柱狀細(xì)胞區(qū)域出現(xiàn)了黑化現(xiàn)象(melanization)，與未染毒情況下的鰓組織對(duì)比明顯(圖2)；染毒12 h的消化腺組織出現(xiàn)一定程度的損傷，導(dǎo)管中上皮柱狀細(xì)胞部分脫落入管腔中，腺管內(nèi)細(xì)胞界限模糊，部分腺管崩解，組織中留下腺管解體后的空隙(圖3b)。

圖2 YTX對(duì)櫛孔扇貝鰓組織毒性作用（H.E.，200×）

圖3 YTX對(duì)櫛孔扇貝消化腺組織毒性作用（H.E.，200×）

2.3 櫛孔扇貝組織中P糖蛋白活性的變化

毒藻投喂前，櫛孔扇貝鰓和消化腺組織對(duì)RhoB的排出速率分別為282.52 pmol RhoB·min-1·g-1和29.71 pmol RhoB·min-1·g-1；毒藻投喂12 h后，鰓中的RhoB排出速率達(dá)到毒藻投喂前的3.8倍，具有顯著差異，消化腺的RhoB排出速率也明顯升高但與0 h相比差異不顯著(圖4)。隨著毒藻暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，12 h至48 h之間鰓組織中RhoB的排出速率略有升高，但與12 h差異不大，72 h后排出速率略有下降；消化腺組織中的結(jié)果恰恰相反，12 h后消化腺組織中RhoB排出速率隨著毒素暴露時(shí)間的延長(zhǎng)持續(xù)下降，72 h后與毒素暴露前水平相當(dāng)。

當(dāng)向體外海水-RhoB-扇貝組織系統(tǒng)中加入終濃度為66.7 μmol·L-1的P-gp功能抑制劑-VRP后，鰓和消化腺對(duì)RhoB的排出速率均明顯增大。以毒素暴露12 h為例，在加入VRP后15 min內(nèi)，鰓對(duì)RhoB的排出速率由不加VRP(-VRP)的1 065.47 pmol RhoB·min-1·g-1增大為1 664.08 pmol RhoB· min-1·g-1，增加幅度達(dá)1.7倍，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析兩者之間差異顯著；消化腺對(duì)RhoB的排出速率也由43.94 pmol RhoB·min-1·g-1升高為80.63 pmol RhoB·min-1·g-1，增加幅度達(dá)1.8倍，差異顯著(圖5)。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，+VRP處理組和-VRP組的RhoB排除速率均呈下降趨勢(shì)。如圖6所示，櫛孔扇貝鰓組織對(duì)RhoB的排除速率在1 h內(nèi)降低了50%以上。

圖4 YTX毒素暴露時(shí)長(zhǎng)對(duì)櫛孔扇貝鰓和消化腺組織中RhoB排出速率的影響

圖5 維拉帕米（VRP）對(duì)櫛孔扇貝鰓和消化腺組織RhoB排出速率的影響

圖6 YTX暴露12 h的離體櫛孔扇貝鰓組織排出RhoB的速率隨時(shí)間的變化

2.4 P糖蛋白在櫛孔扇貝中的定位

毒藻投喂前，櫛孔扇貝鰓絲的前端可見(jiàn)輕微熒光顯色(圖7 a)，染毒24 h后鰓絲前端的纖毛柱狀細(xì)胞區(qū)域熒光強(qiáng)度增強(qiáng)(圖7 b)。消化腺組織中，毒藻投喂前導(dǎo)管的上皮纖毛柱狀細(xì)胞已有明顯的熒光顯色，腺管中無(wú)熒光顯色(圖8 a)；染毒24 h后，導(dǎo)管上皮纖毛柱狀細(xì)胞的熒光亮度略大于毒藻投喂前(圖8 b)，且腺管消化細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)熒光顯色，但亮度低于導(dǎo)管纖毛柱狀細(xì)胞(圖8 b)?？梢?jiàn)，YTX毒素暴露可使櫛孔扇貝鰓和消化腺中P-gp表達(dá)量增加，鰓組織中P-gp主要分布在鰓絲前端纖毛柱狀細(xì)胞內(nèi)，消化腺則以大的導(dǎo)管和腺管中分布較多。

圖7 櫛孔扇貝鰓組織P-gp免疫定位情況（100×）

圖8 櫛孔扇貝消化腺組織中P-gp免疫定位情況（100×）

3 討論（Discussion）

3.1 YTX對(duì)櫛孔扇貝組織的毒性效應(yīng)

毒素累積過(guò)程中，櫛孔扇貝鰓和消化腺組織中YTX濃度隨著時(shí)間的延長(zhǎng)均呈逐漸增加的趨勢(shì)(圖1)。在毒素累積72 h后，鰓組織中YTX濃度最高，為本底濃度的1 058倍。但在毒藻投喂期間，櫛孔扇貝生長(zhǎng)狀況良好，無(wú)一例死亡。可以看出，櫛孔扇貝為累積YTX速度較快的物種，且其對(duì)YTX的適應(yīng)能力較強(qiáng)。

盡管YTX的大量累積并未引起櫛孔扇貝個(gè)體死亡，但是毒素的累積對(duì)其產(chǎn)生了一定的毒性效應(yīng)。在毒藻暴露12 h后，櫛孔扇貝前側(cè)纖毛柱狀細(xì)胞區(qū)帶就出現(xiàn)了明顯的黑化現(xiàn)象(圖2b)。該部位由前側(cè)纖毛柱狀細(xì)胞組成，其胞體內(nèi)分布有大量線粒體，胞體頂端布滿密集的纖毛，相鄰鰓絲前側(cè)纖毛相互交錯(cuò)在一起，其擺動(dòng)能使水流從鰓絲外側(cè)流向內(nèi)側(cè)[21]，即該部位是濾食性的扇貝與水環(huán)境或有毒物質(zhì)密切接觸的區(qū)域。鰓的黑化現(xiàn)象在扇貝(Argopecten ventricosus)[22]和小獅爪海扇蛤(Nodipecten subnodosus)[23-24]的鰓絲前側(cè)纖毛區(qū)域均已得到證實(shí)，被認(rèn)為是毒素造成的毒理學(xué)變化。

櫛孔扇貝消化腺為復(fù)管狀腺，由許多具分枝的腺管組成，眾多腺管匯集于導(dǎo)管，再經(jīng)導(dǎo)管開(kāi)口于胃部。腺管內(nèi)消化細(xì)胞具有胞內(nèi)消化食物的功能，導(dǎo)管的黏膜上皮含有纖毛柱狀細(xì)胞，具有運(yùn)送食物的功能[25]。

同樣，暴露于YTX中一段時(shí)間后，櫛孔扇貝消化腺組織也受到一定程度的損傷，其導(dǎo)管上皮細(xì)胞有脫落現(xiàn)象，腺管細(xì)胞界限變得不明顯且部分腺管出現(xiàn)崩解(圖3b，圖8b)。消化腺組織的上述變化，也出現(xiàn)在貝類其他有毒化合物的暴露實(shí)驗(yàn)中。權(quán)赫梅等[26]關(guān)于Cd2+對(duì)紫貽貝影響的研究表明，消化腺在Cd2+作用下出現(xiàn)導(dǎo)管中吞噬細(xì)胞增多、上皮細(xì)胞膜系統(tǒng)損傷嚴(yán)重的現(xiàn)象。苗晶晶等[27]用B[α]P處理櫛孔扇貝時(shí)發(fā)現(xiàn)，隨時(shí)間的延長(zhǎng)，其消化腺腺管內(nèi)細(xì)胞界限模糊，細(xì)胞膜和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷加重導(dǎo)致細(xì)胞解體，并加速了腺管的崩解，最終使得導(dǎo)管內(nèi)吞噬細(xì)胞大量聚集。此外，Buratti等[28]研究地中海貽貝體內(nèi)藻毒素累積和生理參數(shù)變化時(shí)也發(fā)現(xiàn)，YTX與貽貝血細(xì)胞體積變小、形狀改變以及破碎有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)研究表明，YTX對(duì)櫛孔扇貝消化腺組織的毒性效應(yīng)與前人報(bào)道的重金屬和有機(jī)污染物對(duì)貝類消化腺組織的毒性效應(yīng)類似，也與扇貝組織解毒代謝過(guò)程相符合。

3.2 櫛孔扇貝P糖蛋白介導(dǎo)的MXR轉(zhuǎn)運(yùn)活性與YTX暴露的關(guān)系

在P-gp轉(zhuǎn)運(yùn)活性測(cè)定試驗(yàn)中，染毒12 h后扇貝鰓和消化腺組織的RhoB排出速率與毒素投喂前相比均呈升高趨勢(shì)，這表明，櫛孔扇貝在攝食網(wǎng)狀原角藻后，鰓和消化腺細(xì)胞由胞質(zhì)向細(xì)胞膜外方向的轉(zhuǎn)運(yùn)活性增強(qiáng)。

鰓不僅是櫛孔扇貝呼吸器官，更是重要的濾食器官，是直接與毒藻及溶解在水體中的毒素接觸的器官，是貝體抵御外源毒性化合物的重要生理屏障。大量的研究指出，雙殼貝類鰓組織細(xì)胞具有MXR轉(zhuǎn)運(yùn)活性，抗原抗體反應(yīng)也證實(shí)了轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在鰓組織中表達(dá)[2,4,29-31]。但是櫛孔扇貝的鰓絲對(duì)藻細(xì)胞主要起到過(guò)濾和分選作用，并不能對(duì)其進(jìn)行消化吸收。鰓中檢測(cè)到的高含量的YTX主要來(lái)自于過(guò)濾濃縮的藻，能夠作用于鰓組織的則是溶解在水體中的YTX，所以較低濃度的YTX即能夠明顯提高鰓組織MXR的轉(zhuǎn)運(yùn)活性。櫛孔扇貝的消化腺是毒藻消化和吸收主要場(chǎng)所，藻細(xì)胞中的YTX主要在此累積。在毒藻暴露的早期，YTX累積量較低，消化腺細(xì)胞的MXR轉(zhuǎn)運(yùn)活性明顯升高；隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，YTX累積增多，MXR轉(zhuǎn)運(yùn)活性開(kāi)始下降，到毒藻暴露結(jié)束時(shí)消化腺細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)活性基本與未經(jīng)毒藻暴露時(shí)相當(dāng)。推測(cè)高濃度的YTX可能對(duì)消化腺的MXR活性有抑制作用。Iordanov等[32]通過(guò)研究與藥物接觸后核糖體的翻譯活性首次證實(shí)了YTX為核糖核酸的毒性物質(zhì)，且對(duì)28s rRNA的特殊位點(diǎn)有破壞作用，受到刺激時(shí)細(xì)胞會(huì)對(duì)其產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)。Korsenes等[33]也報(bào)道了YTX對(duì)暴露其中的大鼠成肌細(xì)胞L6和小鼠腦瘤細(xì)胞BC3H1，具有降解rRNA從而抑制蛋白質(zhì)的翻譯合成、促進(jìn)細(xì)胞凋亡的毒理作用，且該現(xiàn)象具有時(shí)間依賴性和組織特異性。結(jié)合本研究，推測(cè)可能消化腺中累積的高含量的YTX毒素，使得參與MXR轉(zhuǎn)運(yùn)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的合成受到抑制，導(dǎo)致RhoB的排出速率下降。

另外，水生生物體中與異源物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的蛋白除了P-糖蛋白外，多藥抗藥相關(guān)蛋白1-5(multidrug resistance associated proteins 1-5,MRP1-5)和乳腺癌抗性蛋白(breastcancer resistance protein,BCRP)也都與MXR相關(guān)，這些蛋白都是ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ATP binding cassette transporter)超家族中的成員，均具有轉(zhuǎn)運(yùn)環(huán)境或生物體內(nèi)有毒物質(zhì)的功能[34]。Luedeking等[5]曾報(bào)道，將紫貽貝暴露于2-AAF中，其鰓和消化腺組織內(nèi)的MRPs含量均有顯著增加。Kingtong等[35]以三丁基錫(tributyltin,TBT)作用于印第安巖石牡蠣(Saccostrea forskali)時(shí)，其鰓、外套膜和消化腺中均能觀察到MRPs表達(dá)量增加。

根據(jù)本研究中YTX毒素能夠明顯提高櫛孔扇貝MXR轉(zhuǎn)運(yùn)活性，加之RhoB不僅是P-gp的底物，也是MRPs等蛋白的底物，所以扇貝MXR轉(zhuǎn)運(yùn)活性增強(qiáng)可能不僅僅是P-gp的貢獻(xiàn)，MRPs等轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可能也有貢獻(xiàn)。這一點(diǎn)筆者通過(guò)后期熒光定量PCR的研究也初步得到了驗(yàn)證，YTX毒素暴露后，櫛孔扇貝組織中轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白MRPs的mRNA表達(dá)量上調(diào)(結(jié)果未顯示)。關(guān)于其他相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性及表達(dá)與YTX毒素暴露的關(guān)系還需要更深入的研究。

3.3 P糖蛋白在櫛孔扇貝組織中的定位

P-gp的免疫組化定位顯示，暴露于YTX環(huán)境中24 h后，鰓絲表面頂端細(xì)胞(包括前纖毛柱狀細(xì)胞區(qū)和前側(cè)纖毛柱狀細(xì)胞區(qū))及消化腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞和腺管消化細(xì)胞與對(duì)照相比熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，表明P-gp主要在上述區(qū)域存在，這與目前國(guó)際上許多研究相一致。Kingtong[35]曾以C219作為一抗對(duì)印第安巖石牡蠣的鰓和消化腺組織進(jìn)行P-gp免疫定位研究，發(fā)現(xiàn)位于鰓絲表面的纖毛細(xì)胞具有極明顯的免疫著色，消化腺組織的消化管腔上皮細(xì)胞也有明顯著色。Luckenbach和Epel[36]關(guān)于污染水域加州貽貝鰓組織的P-gp定位研究也表明，貽貝鰓組織中污染物誘導(dǎo)的P-gp的熒光顯色集中于鰓絲直接接觸水流的前部細(xì)胞頂端。Whalen等[37]關(guān)于海參(Tritonia hamnerorum)中P-gp的定位顯示，其中腸上皮纖毛柱狀細(xì)胞的免疫著色明顯，表明P-gp定位于海參中腸上皮纖毛柱狀細(xì)胞。

本研究表明，YTX能夠誘導(dǎo)櫛孔扇貝P-gp表達(dá)量增加，鰓組織中的P-gp主要存在于鰓絲表面長(zhǎng)期直接暴露于環(huán)境中的前端纖毛柱狀細(xì)胞區(qū)域，消化腺組織中P-gp則存在于與食物接觸的導(dǎo)管上皮纖毛柱狀細(xì)胞和腺管消化細(xì)胞中，且腺管內(nèi)P-gp的分布低于導(dǎo)管上皮細(xì)胞。此外，消化腺組織染毒24 h后熒光強(qiáng)度的變化明顯低于鰓組織，與P-gp活性測(cè)定試驗(yàn)結(jié)果以及本研究后續(xù)的P-gp熒光定量PCR的結(jié)果一致(結(jié)果未顯示)。

另外，未染毒時(shí)，扇貝鰓絲前纖毛柱狀細(xì)胞區(qū)域和消化腺導(dǎo)管上皮纖毛柱狀細(xì)胞中已有微弱的熒光顯色(圖7a和圖8a)，表明無(wú)YTX時(shí)扇貝組織中已含有少量的P-gp的表達(dá)。該結(jié)果與圖4中0 h鰓和消化腺組織已具有一定的RhoB排出速率相一致。這可能是由于該批櫛孔扇貝在養(yǎng)殖海域已接觸過(guò)誘導(dǎo)P-gp表達(dá)的有毒有害物質(zhì)。

3.4 維拉帕米與櫛孔扇貝P糖蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)活性

鈣離子通道阻滯劑VRP，是P-gp的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，它能與P-gp競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，抑制與P-gp偶聯(lián)的ATPase活性，從而抑制其轉(zhuǎn)運(yùn)活性。Ivanina等[20]關(guān)于不同濃度(0～1 000 μmol·L-1)VRP對(duì)牡蠣(Crassostrea virginica)鰓組織P-gp轉(zhuǎn)運(yùn)RhoB活性的抑制作用的研究表明，66.7 μmol·L-1的VRP是對(duì)P-gp活性具有最大抑制作用的最低有效濃度。本文RhoB外排實(shí)驗(yàn)中，與-VRP組相比，經(jīng)66.7 μmol· L-1VRP處理的櫛孔扇貝鰓和消化腺組織，其RhoB排出速率沒(méi)有下降，反而升高，該結(jié)果與以往某些研究中VRP能抑制P-gp轉(zhuǎn)運(yùn)活性的結(jié)果矛盾[11,20]。

以同一海域的紫貽貝作為研究對(duì)象，對(duì)其進(jìn)行PSP毒素快速累積實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，暴露于PSP中的貽貝，其鰓組織中MXR活性明顯提高；相同濃度的VRP處理后貽貝鰓組織排出RhoB的速率明顯下降，即VRP能夠通過(guò)抑制P-gp的活性從而降低貽貝鰓組織MXR活性。

圖9 維拉帕米（VRP）對(duì)紫貽貝鰓組織RhoB排出速率的影響

另外，某些研究顯示，當(dāng)MgATP濃度一定時(shí)，低濃度VRP具有激活與P-gp偶聯(lián)的ATPase活性的作用，使得P-gp供能充足，轉(zhuǎn)運(yùn)活性增強(qiáng)；高濃度VRP則有抑制ATPase活性的能力，使得P-gp轉(zhuǎn)運(yùn)活性降低[38-40]。對(duì)于不同物種，VRP對(duì)其ATPase的激活或抑制作用的閾值有所不同。AI-Shawi等[39]分別對(duì)人和中國(guó)倉(cāng)鼠的10 mmol·L-1MgATP均以130 μmol·L-1VRP處理，發(fā)現(xiàn)VRP能激活人類P-gp-ATPase活性，而抑制倉(cāng)鼠P-gp-ATPase活性。本實(shí)驗(yàn)中相同濃度的VRP對(duì)櫛孔扇貝和紫貽貝的作用不同，可能是種屬差異所引起的，不同濃度VRP對(duì)櫛孔扇貝的P-gp活性的調(diào)節(jié)作用也還有待進(jìn)一步研究。

致謝：感謝國(guó)家海洋環(huán)境監(jiān)測(cè)中心梁玉波研究員提供的網(wǎng)狀原角藻藻株；感謝中國(guó)科學(xué)院海洋研究所李莉老師提供的櫛孔扇貝。

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3.East China Sea Forecast Center,State Oceanic Administration,Shanghai 200081,China

11 December 2015 accepted 26 January 2016

Many studies have shown that multi-xenobiotic resistance(MXR)mediated by P-glycoprotein(P-gp)in shellfish played an important role in resisting or tolerating xenobiotics in polluted water.However,few research has been conducted whether this mechanism also works on the resistance or tolerance of dietary toxins(eg.yessotoxin, YTX)in shellfish.In this study,Chlamys farreriwas exposed to the YTX toxin-producing strain ofProtoceratium reticulatum.YTX concentrations,P-gp transport activity and P-gp expression were measured and analyzed to study the changes over exposure time in gills and digestive gland ofC.farreri.Consequently,it was discussed about the possible role of P-gp in YTX toxin tolerance in shellfish.The results showed that YTX contents in gills and digestive gland increased continuously with exposure time.Evident toxic effects were observed in the scallop tissues despite no death resulted.After 12 h exposure,H.E.dye assay showed the melanization in the laterofrontal cillia of gill filament,exfoliation of epithelial cells in digestive gland and degradation of digestive ducts.Rhodamine-B (RhoB)excretion experiments confirmed that YTX toxin,with a short exposure period,could significantly enhance the transport activity of P-gp in the scallop.After 12 h exposure,the efflux rates of RhoB in gills and digestive gland were 3.8 and 1.4 times of those in unexposed ones;while later,the P-gp activity had limited increase,and began to decrease after 72 h-exposure.Contrary to the previous research,the inhibitor of P-gp-verapamil(VRP),in the given concentration,didn’t inhibit but enhance the efflux of RhoB.Immunohistochemical analysis revealed increased P-gp expression in the laterofrontal ciliated columnar cells of gills,in the ductal epithelial columnar cells and digestive cells of digestive gland after YTX toxin exposure.Above all,this study suggested that YTX,possibly the substrate of P-gp,can induce the transport activity and expression of P-gp inC.farreri,and P-gp played an important role in the YTX toxin tolerance.In addition,further studies were needed considering the discrepant results of VRP inhibiting the P-gp activity,which was probably due to the different testing organisms used in this study.

yessotoxin;Chlamys farreri;Protoceratium reticulatum;gill;digestive gland;P-glycoprotein;rhodamine B;verapamil

2015-12-11 錄用日期：2016-01-26

1673-5897（2016）3-281-13

X171.5

A

10.7524/AJE.1673-5897.20151211001

簡(jiǎn)介：高春蕾(1974-)，女，海洋生物學(xué)專業(yè)，博士，副研究員，主要研究方向?yàn)楹Ｑ蟓h(huán)境生物學(xué)。

王宗靈(1966-)，男，海洋生態(tài)學(xué)專業(yè)，博士，研究員，主要從事海洋浮游生物多樣性與生態(tài)系統(tǒng)功能、赤潮生物學(xué)與生態(tài)學(xué)、生態(tài)系統(tǒng)動(dòng)力學(xué)、生物競(jìng)爭(zhēng)理論等方面的研究工作。

國(guó)家自然科學(xué)基金(No.41206161)；海洋公益性行業(yè)科研專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目(No.2013418010)；海洋局一所基本科研業(yè)務(wù)專項(xiàng)資金項(xiàng)目(No.GY0213G28,No.2012T08)

趙翠瓊(1991-)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)楹Ｑ笊飳W(xué)，E-mail:cqzhao@fio.org.cn；

*通訊作者（Corresponding author），E-mail:gaochunlei@fio.org.cn

#共同通訊作者(Co-corresponding author)，E-mail:wangzl@fio.org.cn