呋蟲胺對(duì)斑馬魚胚胎-幼魚生長發(fā)育及細(xì)胞凋亡的影響

孫琦，范詠梅，賴柯華，黃偉康

海南大學(xué)環(huán)境與植物保護(hù)學(xué)院，?？?70228

呋蟲胺對(duì)斑馬魚胚胎-幼魚生長發(fā)育及細(xì)胞凋亡的影響

孫琦，范詠梅*，賴柯華，黃偉康

海南大學(xué)環(huán)境與植物保護(hù)學(xué)院，?？?70228

第三代新煙堿類農(nóng)藥呋蟲胺作為超高效、廣譜性殺蟲劑在水稻、蔬菜和水果上廣泛應(yīng)用，因其水溶性高，對(duì)水生生物的毒性不容忽視。本研究以斑馬魚胚胎為對(duì)象，參考OECD標(biāo)準(zhǔn)，在胚胎受精后30 min內(nèi)，采用靜態(tài)法染毒，觀察其24 h、48 h、72 h、96 h的生長發(fā)育情況，根據(jù)死亡數(shù)計(jì)算呋蟲胺對(duì)斑馬魚96 h-LC50，采用吖啶橙染色(acridine orange fluorescent,AO-F)和原位末端標(biāo)記法(TUNEL)2種方法，檢測其對(duì)斑馬魚96 hpf(hour post-fertilization,hpf)幼魚的細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果表明：呋蟲胺對(duì)斑馬魚胚胎的96 h-LC50為10.36 g·L-1(95%置信區(qū)間為7.76～12.93 g·L-1)，屬于微毒；較高濃度的呋蟲胺能使斑馬魚的擺尾數(shù)、內(nèi)心率、孵化率降低，對(duì)生長發(fā)育有延遲的作用，可導(dǎo)致部分斑馬魚色素褪去，出現(xiàn)心包囊腫、卵黃囊腫和尾部畸形的現(xiàn)象。且隨著濃度的升高，在斑馬魚頭部、腹部、尾部均有明顯的細(xì)胞凋亡情況加重，其中以心臟和內(nèi)耳尤為明顯，呈規(guī)律的劑量-效應(yīng)關(guān)系。

呋蟲胺；斑馬魚；細(xì)胞凋亡；吖啶橙染色；TUNEL染色

孫琦,范詠梅,賴柯華,等.呋蟲胺對(duì)斑馬魚胚胎-幼魚生長發(fā)育及細(xì)胞凋亡的影響[J].生態(tài)毒理學(xué)報(bào)，2016,11(3):356-364

Sun Q,Fan Y M,Lai K H,et al.Effects of dinotefuran on the embryonic and larvae development and apoptosis in zebrafish(Danio rerio)[J].Asian Journal of Ecotoxicology,2016,11(3):356-364(in Chinese)

農(nóng)藥施用后會(huì)通過雨水沖刷、漂移等方式進(jìn)入水體，危害水生生物的安全[1]。呋蟲胺(dinotefuran)，由日本三井(Mitsui)化學(xué)公司研發(fā)，也被稱為“呋喃煙堿”，是煙堿類殺蟲劑中唯一不含氯原子和芳環(huán)的化合物，具有3-四氫呋喃甲基的特征結(jié)構(gòu)(圖1)，具有超高效、殺蟲譜廣、毒性低等特點(diǎn)，同時(shí)有內(nèi)吸、胃毒、觸殺等多種作用方式，被廣泛應(yīng)用于水稻、果樹、蔬菜等眾多作物防治半翅目及其他害蟲[2]。由于呋蟲胺在水中的溶解度大(40 g·L-1、20℃)、土壤吸附性較弱[3]，因而更易流失進(jìn)入水體，對(duì)水生生物造成危害。國外研究主要集中在其環(huán)境行為方面，例如在空氣中噴散呋蟲胺，于稻田水中的降解半衰期為5.6 d，土壤中的半衰期為12 d[4]；呋蟲胺在水和土壤中的光降解行為研究結(jié)果表明，在實(shí)驗(yàn)室條件下呋蟲胺在水中太陽光照射時(shí)其光降解速率kDNT為0.20 h-1，半衰期為3.6 h[5]。國內(nèi)學(xué)者通過模擬實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)呋蟲胺在水中的光解速率隨著初始濃度的升高而減慢，隨pH的增加而逐漸加快，其在pH為5、7、8和9的條件下的光解半衰期分別為12.42 h、12.06 h、10.84 h和8.45 h[6]。

圖1 呋蟲胺的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

呋蟲胺主要作用于昆蟲的煙堿乙酰膽堿受體(nAChRs)，是昆蟲的乙酰膽堿激動(dòng)劑，可防治半翅目、鱗翅目、甲蟲目、雙翅目、直翅目、膜翅目等各種害蟲[7]，亦有褐飛虱，白背飛虱和灰飛虱對(duì)其抗藥性監(jiān)測的報(bào)道[8]。目前主要的劑型有水分散粒劑、2%顆粒劑、0.5%粉劑、1%顆粒劑、20%可溶性粒劑等5種[9]。呋蟲胺對(duì)非靶標(biāo)類生物的毒性研究也有報(bào)道，如對(duì)鳥類毒性低，對(duì)鵪鶉急性經(jīng)口LD50>1 000 mg·kg-1[7]。對(duì)意大利蜂急性毒性的LC50為0.260 a.i. mg·L-1[10]；對(duì)小峰熊蜂工蜂24 h的LC50值為0.75 mg·L-1，經(jīng)過48 h連續(xù)胃毒作用的LC50值為0.54 mg·L-1，對(duì)小峰熊蜂雄性蜂24 h的LC50值為2.16 mg·L-1[11]。對(duì)家蠶急性食下毒性為高毒，其對(duì)3齡家蠶的急性食下毒性的LC50為1.2625 mg·L-1[12]。其對(duì)哺乳動(dòng)物相對(duì)安全，雄性大鼠急性經(jīng)口LD50為2 450 mg·kg-1，雌性大鼠2 275 mg·kg-1，雄性小鼠2 840mg·kg-1，雌性小鼠2 000 mg·kg-1。對(duì)大鼠急性經(jīng)皮LD50>2 000 mg·kg-1(雌、雄)[7]，無致畸、致癌和致突變性[13]。呋蟲胺原藥及其2種劑型對(duì)3種甲殼綱生物的毒性與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)結(jié)果表明，呋蟲胺對(duì)劍水蚤的急性風(fēng)險(xiǎn)較高[1]。還有研究表明，呋蟲胺對(duì)水蚤(daphnia)的48 h-EC50>1 000 mg·L-1，對(duì)水藻(alga)的72 h-EC50>100 mg·L-1，對(duì)鯉魚(carp)的96 h-LD50>100 mg·L-1[7]。因此，研究呋蟲胺對(duì)非靶標(biāo)的水生生物毒性顯得極為重要，而呋蟲胺對(duì)斑馬魚的毒性研究國內(nèi)外僅見其急性毒性的報(bào)道[10]，尚無其對(duì)斑馬魚胚胎毒性的相關(guān)研究報(bào)道。

細(xì)胞凋亡(apoptosis)是由基因控制的細(xì)胞自主的有序性死亡，又稱為程序性細(xì)胞死亡(programmed cell death,PCD)[14]。細(xì)胞凋亡的研究方法主要有吖啶橙染色、TUNEL染色及DNA階梯等，其中通過吖啶橙染色熒光顯微鏡下觀察凋亡細(xì)胞的方法簡便易操作，使用較普遍。熒光顯微鏡下，活細(xì)胞核染色質(zhì)呈現(xiàn)均勻分布的黃綠色熒光，胞質(zhì)呈橘紅色熒光，而凋亡細(xì)胞核染色質(zhì)的黃綠色熒光濃聚在核膜內(nèi)側(cè)，凋亡細(xì)胞核的特征性形態(tài)可被清晰地辨認(rèn)[15]。TUNEL是分子生物學(xué)和形態(tài)學(xué)相結(jié)合的一種方法，能準(zhǔn)確反映細(xì)胞凋亡的典型生物化學(xué)和形態(tài)學(xué)特征。大量的DNA雙鏈斷裂被認(rèn)為是凋亡中最顯著的特征，因此TUNEL也被認(rèn)為是檢測細(xì)胞凋亡的金標(biāo)準(zhǔn)[16]。TUNEL具有靈敏度高、反應(yīng)快、能檢測出極少量的細(xì)胞凋亡，被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞凋亡和神經(jīng)元退化的檢測[17]。DNA階梯的檢測簡便易行,費(fèi)用低廉,應(yīng)用較普遍。但是,細(xì)胞凋亡時(shí)核內(nèi)DNA斷裂發(fā)生較晚,而且細(xì)胞受到其他損傷(如機(jī)械損傷、化學(xué)物質(zhì)刺激、紫外線照射等)時(shí)也會(huì)發(fā)生DNA斷裂。因此DNA階梯法鑒定細(xì)胞凋亡,早期可能不易捕獲證據(jù),而晚期則證據(jù)說服力不足，且其只能定性不能定量[16]。本文作者所在項(xiàng)目組也曾利用DNA階梯方法檢測細(xì)胞凋亡[18]。綜合比較以上3種研究方法，基于定量和準(zhǔn)確性的考慮，本文選擇了將簡便易操作的吖啶橙染色和靈敏度高、反應(yīng)快的TUNEL染色兩種方法結(jié)合，在考察呋蟲胺原藥對(duì)斑馬魚胚胎發(fā)育毒性的基礎(chǔ)上，進(jìn)行初孵幼魚的吖啶橙染色、TUNEL染色，研究其誘導(dǎo)斑馬魚初孵幼魚產(chǎn)生細(xì)胞凋亡的情況，為進(jìn)一步進(jìn)行毒理學(xué)機(jī)理研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法（Materials and methods）

1.1 供試材料

1.1.1 藥品及主要試劑

呋蟲胺原藥購于上海將來實(shí)業(yè)股份有限公司，有效成分含量為96%，儲(chǔ)存于4℃。其他主要試劑如下：磷酸鹽緩沖液(PBS)購自上海立菲生物技術(shù)有限公司，吖啶橙、3%甲基纖維素、Tween-20、4%多聚甲醛均購自北京索萊寶科技有限公司，Protease K購自北京全式生物技術(shù)有限公司，魚安定購自東京化成工業(yè)株式會(huì)社，一步法TUNEL試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所。

1.1.2 儀器設(shè)備

斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)購自北京愛生科技發(fā)展有限公司，BX51熒光顯微鏡和SZX16體視顯微鏡均購自O(shè)lympus公司，PHSJ-4 A實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)購自上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司，萬分之一天平購自梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.1.3 供試斑馬魚

斑馬魚飼養(yǎng)：野生AB型斑馬魚(Danio rerio)，由國家斑馬魚資源中心引進(jìn)，斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)飼養(yǎng)，每日監(jiān)控過濾水pH為7.5±0.3，溶氧量≥80%，溫度為(26±1)℃，以保證其在最適生長環(huán)境下生長。成魚用新鮮孵化的豐年蟲喂養(yǎng)，每日2次，每次足量。斑馬魚胚胎獲?。簩⒊墒旌蟮拇菩埕~分開飼養(yǎng)。試驗(yàn)的前一天晚上將雌雄成魚按照1：2的比例放于產(chǎn)卵盒中，溫度為(27±1)℃。用隔離板將雌雄魚隔開，光照與黑暗的時(shí)間比為14 h∶10 h，次日清晨打開隔離板，在光照的刺激下，雄魚開始追逐雌魚，雌魚開始產(chǎn)卵，30 min后收集受精卵，去除飼料和糞便，用孵化液清洗2遍后，放入有孵化液的培養(yǎng)皿中，挑選受精的胚胎待用。孵化液的溫度為(26±1)℃，pH為7.2±0.1，含氧量≥80%。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 呋蟲胺對(duì)斑馬魚胚胎急性毒性試驗(yàn)

參照OECD準(zhǔn)則[19]進(jìn)行。試驗(yàn)用受精卵在30 min內(nèi)染毒，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，5個(gè)試驗(yàn)濃度分別為6 g·L-1、8.97 g·L-1、13.41 g·L-1、20.05 g·L-1和30 g·L-1，另有空白對(duì)照CK，因呋蟲胺在水中的溶解度高，故無溶劑對(duì)照。配好后吸取到24孔培養(yǎng)板中，每孔2 mL。用雙目顯微鏡觀察并挑取合格的受精卵，置于培養(yǎng)板中，每孔一粒。每個(gè)處理重復(fù)3次，于光、暗比為14 h∶10 h的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每24小時(shí)觀察其死亡數(shù)和孵化數(shù)等指標(biāo)，連續(xù)觀察4 d。依據(jù)OECD標(biāo)準(zhǔn)，配制4 mg·L-1的3,4-二氯苯胺溶液作為陽性對(duì)照。

1.2.2 吖啶橙染色

配制濃度為2 mg·L-1的吖啶橙工作液，將發(fā)育至96 hpf的胚胎整體放入其中，避光染色30 min，用PBS(pH 7.2)清洗3遍，放入培養(yǎng)板中備用。將需要觀察的幼魚用0.08%的Tricaine麻醉。用吸管將麻醉后的幼魚置于滴有3%甲基纖維素溶液的玻片上。將熒光顯微鏡的激發(fā)光波長調(diào)節(jié)為450 nm，觀察幼魚的細(xì)胞凋亡程度，每條魚不同角度拍照5張。

1.2.3 TUNEL染色

選用一步法TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(紅色熒光)，C1089，主要的染色步驟如下：將幼魚用4%多聚甲醛(4%PFA)固定，室溫保存4 h，用甲醇和1× PBST(V∶V)進(jìn)行梯度脫水，梯度依次為0∶1、1∶3、1∶1、3∶1、1∶0，每次5 min，脫水后放置于-20℃。第2天進(jìn)行梯度復(fù)水，將脫水體積比的梯度倒置，但不用純甲醇清洗，用V(甲醇):V(無菌水)=3:1的比例清洗，之后按甲醇:1×PBST(V∶V)=1:1、1:3、0:1的體積比清洗，每次5 min。每個(gè)幼魚樣品中加入500 μg的20 μg·L-1的Protease K，保證樣品被浸沒，37℃下反應(yīng)60 min后用1×PBST清洗3～5次，每次5 min，后用4%PFA處理20 min，使Protease K失活，并用1×PBST清洗5次，每次5 min。取TUNEL試劑盒中TdT酶2 μL，熒光標(biāo)記液48 μL，充分混勻用作酶反應(yīng)液。最后于37℃避光孵育60 min，熒光顯微鏡拍攝，每條魚不同角度拍照5張。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析方法

使用SPSS 21.0對(duì)96 hpf死亡率數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，得到96-LC50及95%置信區(qū)間；統(tǒng)計(jì)24 hpf斑馬魚胚胎1 min中內(nèi)的擺尾數(shù)，48 hpf和72 hpf的內(nèi)心率和96 hpf的孵化率。

2 結(jié)果與分析（Results and analysis）

2.1 呋蟲胺對(duì)斑馬魚胚胎的急性毒性

2.1.1 參比物質(zhì)控試驗(yàn)

配制4 g·L-1的3,4-二氯苯胺溶液作為陽性對(duì)照，染毒96 h后，胚胎死亡率為100%，符合OECD標(biāo)準(zhǔn)大于30%的要求，說明胚胎的敏感性良好。

2.1.2 呋蟲胺對(duì)斑馬魚急性毒性結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，96 h的LC50值為10.36 g·L-1(95%置信區(qū)間為7.76～12.93 g·L-1)，線性回歸方程為y=-1.13+0.11x(表1)。

2.1.3 呋蟲胺對(duì)斑馬魚胚胎的亞致死效應(yīng)

表1 呋蟲胺對(duì)斑馬魚胚胎的急性毒性Table 1 Acute toxicity of dinotefuran toDanio rerioembryo

圖2 不同濃度呋蟲胺對(duì)10 hpf斑馬魚胚胎發(fā)育的影響

圖3 不同濃度呋蟲胺對(duì)24 hpf斑馬魚胚胎發(fā)育的影響

圖4 24 hpf正常斑馬魚胚胎（A）與20.05 g·L-1呋蟲胺濃度組胚胎（B）尾部對(duì)比圖

分別記錄了胚胎在10 h、24 h、48 h、72 h和96 h的生長發(fā)育情況。在10 h時(shí)，胚胎發(fā)育均進(jìn)入原腸期，其中空白對(duì)照發(fā)育正常，處于尾芽期，6 g·L-1的處理組處于90%-外包期，8.97 g·L-1處理組處于胚盾期，13.41 g·L-1和20.05 g·L-1處理組均處于胚環(huán)期，30 g·L-1的處理組胚胎已經(jīng)全部死亡(圖2)。結(jié)果表明，呋蟲胺對(duì)斑馬魚胚胎發(fā)育有明顯的延遲作用，延遲作用與濃度呈正比。

圖5 不同濃度呋蟲胺對(duì)24 hpf斑馬魚胚胎1 min內(nèi)擺尾數(shù)的影響

在發(fā)育至24 h時(shí)，濃度為13.41 g·L-1和20.05 g ·L-1的處理組出現(xiàn)發(fā)育延遲的現(xiàn)象(圖3D、3E)，表現(xiàn)為尾部未伸展，且20.05 g·L-1濃度組中出現(xiàn)了尾部畸形的情況(圖4)。觀察24 hpf的1 min內(nèi)擺尾數(shù)如圖5，結(jié)果表明，隨著濃度的升高，擺尾數(shù)越來越少。

圖6 不同濃度呋蟲胺對(duì)48 hpf斑馬魚胚胎發(fā)育的影響

圖7 48 hpf正常斑馬魚幼魚與20.05 g·L-1呋蟲胺濃度組中幼魚色素和尾部對(duì)比圖

48 hpf時(shí)，畸形情況表現(xiàn)較顯著(圖6)?？瞻讓?duì)照和低濃度6 g·L-1處理胚胎均生長正常，隨著濃度的繼續(xù)升高，每個(gè)濃度組都出現(xiàn)了不同程度的卵黃囊腫現(xiàn)象，8.97 g·L-1的處理組中個(gè)別胚胎出現(xiàn)心包囊腫，13.41 g·L-1和20.05 g·L-1的胚胎還出現(xiàn)了色素減少的現(xiàn)象，20.05 g·L-1的胚胎和幼魚出現(xiàn)了心包囊腫和尾部彎曲的現(xiàn)象(圖7)。結(jié)果表明，在處理的濃度范圍內(nèi)，隨著濃度的升高，呋蟲胺對(duì)斑馬魚胚胎生長發(fā)育的影響也越來越嚴(yán)重，主要表現(xiàn)為形態(tài)畸形和色素減少。

72 hpf時(shí)，空白組和6 g·L-1的處理組均生長正常，絕大多數(shù)6 g·L-1處理組生長正常，13.41 g·L-1出現(xiàn)心包囊腫和卵黃囊腫現(xiàn)象(圖8)，20.05 g·L-1處理組同樣出現(xiàn)心包囊腫和卵黃囊腫，同時(shí)還伴有血凝結(jié)。當(dāng)胚胎發(fā)育到72 h時(shí)，空白組和低濃度處理組已經(jīng)有部分胚胎孵化(初孵幼魚)，其中，8.97 g·L-1處理組出現(xiàn)卵黃囊腫現(xiàn)象，13.41 g·L-1處理組伴有尾部畸形(圖9)，其余濃度除最高濃度(20.05 g·L-1)未孵化外，初孵幼魚均生長正常，說明呋蟲胺對(duì)斑馬魚胚胎的生長發(fā)育有延遲的作用。此外，呋蟲胺對(duì)斑馬魚胚胎的內(nèi)心率也有一定影響，對(duì)48 hpf和72 hpf胚胎的內(nèi)心率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果表明，6 g·L-1呋蟲胺能加快斑馬魚胚胎的內(nèi)心率，且暴露在此濃度呋蟲胺下的斑馬魚跟空白對(duì)照相比也更加活躍，之后隨著濃度的升高，呋蟲胺對(duì)斑馬魚內(nèi)心率表現(xiàn)為抑制作用(圖10)。

圖8 不同濃度呋蟲胺對(duì)72 hpf斑馬魚胚胎發(fā)育的影響

圖9 不同濃度呋蟲胺對(duì)72 hpf斑馬魚初孵幼魚的影響

圖10 不同濃度呋蟲胺對(duì)48 hpf和72 hpf斑馬魚胚胎內(nèi)心率的影響

圖11 呋蟲胺對(duì)96 hpf斑馬魚胚胎及幼魚的影響

圖12 不同濃度呋蟲胺對(duì)96 hpf斑馬魚胚胎孵化率的影響

96 hpf時(shí)，8.97 g·L-1、13.41 g·L-1的處理組均伴有畸形情況出現(xiàn)，包括卵黃囊腫、心包囊腫、尾部畸形，20.05 g·L-1處理組沒有孵化，空白組和6 g·L-1處理組的幼魚生長正常(圖11)。隨著濃度的升高，斑馬魚胚胎的孵化率逐漸降低(圖12)，72 hpf時(shí)呋蟲胺延遲斑馬魚胚胎發(fā)育的作用已經(jīng)初步顯現(xiàn)。

2.2 吖啶橙染色

采用吖啶橙(AO)對(duì)斑馬魚96 hpf的初孵幼魚或胚胎進(jìn)行整體活體染色，在450 nm的熒光下，發(fā)出綠色的熒光，而凋亡的細(xì)胞的熒光更加明亮，結(jié)果表明其對(duì)DNA造成了損傷(圖13)。

空白對(duì)照組沒有出現(xiàn)細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，6 g·L-1和8.97 g·L-1的處理組出現(xiàn)少部分的細(xì)胞凋亡，相當(dāng)數(shù)量的細(xì)胞凋亡出現(xiàn)在13.41 g·L-1和20.05 g·L-1的處理組中，尤其是在心臟和內(nèi)耳的部分。

2.3 TUNEL染色

對(duì)96 hpf的斑馬魚幼魚進(jìn)行TUNEL染色，結(jié)果表明，空白對(duì)照組沒有出現(xiàn)細(xì)胞凋亡的現(xiàn)象，6 g· L-1和8.97 g·L-1的處理組出現(xiàn)了少部分的細(xì)胞凋亡，頭部、腹部、尾部均出現(xiàn)，尤其是在心臟和內(nèi)耳的部分，但是相當(dāng)多數(shù)量的細(xì)胞凋亡出現(xiàn)在13.41 g· L-1和20.05 g·L-1的處理組中(圖14)。結(jié)果與吖啶橙染色結(jié)果相似。

3 討論（Discussion）

圖13 吖啶橙染色法檢測呋蟲胺誘導(dǎo)斑馬魚胚胎細(xì)胞凋亡

圖14 TUNEL染色法檢測呋蟲胺誘導(dǎo)斑馬魚胚胎細(xì)胞凋亡

已有研究表明，呋蟲胺對(duì)普通鯉魚LD50>100 mg·L-1，對(duì)水蚤EC50(48 h)>1 000 mg·L-1，均為低毒[7]，但是對(duì)其他水生生物則表現(xiàn)出不同毒性，如糠蝦LC50(96 h)為0.79 mg·L-1(高毒)，龍蝦LC50(48 h)為4.84 mg·L-1(中毒)，東方牡蠣LC50(96 h)為141 mg ·L-1(低毒)，浮萍EC50>110 mg·L-1(低毒)[20]，這可能因?yàn)椴煌飳?duì)農(nóng)藥的生物可利用性以及吸收機(jī)制等不同，受到的毒害作用有所不同，而呋蟲胺主要作用于乙酰膽堿受體且易溶于水，而乙酰膽堿在糠蝦的生長繁殖過程中起著極為重要的作用，因此表現(xiàn)為高毒[21]。

近期吳若函等[8]考察了幾種新煙堿類殺蟲劑對(duì)斑馬魚的急性毒性，結(jié)果表明20%呋蟲胺懸浮劑對(duì)斑馬魚幼魚96 h-LC50為59.7 mg·L-1，為低毒；本研究結(jié)果中呋蟲胺原藥對(duì)斑馬魚胚胎急性毒性96-LC50為10.36 g·L-1，為微毒，在呋蟲胺原藥的水溶解度的范圍內(nèi)，呋蟲胺可使斑馬魚胚胎的擺尾數(shù)、內(nèi)心率、孵化率降低，可導(dǎo)致斑馬魚出現(xiàn)心包囊腫、卵黃囊腫、色素褪去、發(fā)育延遲等現(xiàn)象；這說明制劑的毒性比原藥的毒性要高，因此，雖然按規(guī)定的劑量在田間使用此農(nóng)藥，不會(huì)對(duì)魚類造成危害性的影響，但是由于其溶解性好，大量、反復(fù)使用時(shí)，該藥劑對(duì)斑馬魚還是有毒性風(fēng)險(xiǎn)的。

同為新煙堿類殺蟲劑的吡蟲啉和噻蟲嗪也可影響斑馬魚的細(xì)胞凋亡。陳愛梅等[22]認(rèn)為，兩者均對(duì)斑馬魚肝臟細(xì)胞的DNA造成了損傷，損傷程度隨染毒濃度和染毒時(shí)間增高，且吡蟲啉對(duì)斑馬魚的基因毒性大于噻蟲嗪。同為手性農(nóng)藥的茚蟲威對(duì)斑馬魚急性毒性屬于中等毒性[23]。本研究用2種染色方法對(duì)96 h的斑馬魚的凋亡信號(hào)進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示凋亡細(xì)胞均集中在心臟和內(nèi)耳部分，具有組織特異性，且濃度越高，細(xì)胞凋亡越嚴(yán)重，可以為進(jìn)一步揭示呋蟲胺對(duì)斑馬魚的毒作用靶器官和毒效應(yīng)機(jī)制提供線索。

（References）：

[1] 張文萍,王全勝,徐吉洋,等.呋蟲胺原藥及兩種劑型對(duì)三種甲殼綱生物的毒性與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)[J].農(nóng)藥環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào),2015,34(8):1478-1485

Zhang W P,Wang Q S,Xu J Y,et al.Toxicity and risk of different formulations of dinotefuran to three crustaceans [J].Journal of Agro-Environmental Science,2015,34(8): 1478-1485(in Chinese)

[2] 張亦冰.新內(nèi)吸殺蟲劑:呋蟲胺[J].世界農(nóng)藥,2003,25 (5):46-47

[3] Kurwadkar S T,Dewinne D,Wheat R,et al.Time dependent sorption behavior of dinotefuran,imidacloprid and thiamethoxam[J].Journal of Environmental Science and Health,Part B,2013,48(4):237-242

[4] Sayako Y,Masataka I,Shunsuke N,et al.Runoff and degradation of aerially applied dinotefuran in paddy fields and river[J].Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology,2015,94(4):796-800

[5] Sudarshan K,Amanda E,Dustand D W,et al.Modeling photodegradation kinetics of three systemic neonicotinoids -dinotefuran,imidacloprid and thiamethoxam in aqueous and soil environment[J].Environmental Toxicology and Chemistry,2016,9999(12):1-9

[6] 鄭立慶,趙源,張磊磊,等.呋蟲胺在水中的光化學(xué)降解[J].河南師范大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2015,43(1):93-99

Zheng L Q,Zhao Y,Zhang L L,et al.Phtochemistry degradation of dinotefuran in water[J].Journal of Henan Normal University:Natural Science Edition,2015,43(1): 93-99(in Chinese)

[7] Takeo W,Naoko Y,Eiichi Y,et al.Development of a novel insecticide,dinotefuran[J].Journal of Pesticide Science,2005,30(2):122-123

[8] Xi C M,Wei Z,Li X W,et al.Resistance monitoring and cross-resistance patterns of three rice planthoppers,Nilaparvata lugens,Sogatella furciferaandLaodelphax striatellusto dinotefuran in China[J].Pesticide Biochemistry and Physiology,2016

[9] 楊光.巴斯夫推出殺蟲劑Alpine(呋蟲胺)新劑型[J].農(nóng)藥研究與應(yīng)用,2012(4):35

[10] 吳若函,丁悅,嚴(yán)海娟,等.新煙堿類殺蟲劑對(duì)幾種環(huán)境生物的安全性評(píng)價(jià)[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2016,44(1): 295-297

[11] 劉佳霖,伍翔,廖秀,等.4種殺蟲劑對(duì)小峰熊蜂工蜂和雄性蜂的急性經(jīng)口毒性測定[J].農(nóng)藥,2012,51(6):436-438

Liu J L,Wu X,Liao X,et al.Evaluation the oral toxicity of four pesticides toBombus hypocritaworkers and drones[J].Agrochemicals,2012,51(6):436-438(in Chinese)

[12] 陳偉國,孫海燕,楊一平,等.第三代煙堿類殺蟲劑呋蟲胺對(duì)家蠶的毒性與安全性評(píng)價(jià)[J].廣西蠶業(yè),2015, 52(1):19-22

[13] 樸秀英,嵇莉莉,林榮華,等.新煙堿類殺蟲劑登記與管理現(xiàn)狀分析[J].中國植保導(dǎo)刊,2015(3):70-74

[14] 矯毓娟,劉江紅.細(xì)胞凋亡的檢測方法[J].中國神經(jīng)免疫學(xué)和神經(jīng)病學(xué)雜志,2004,11(1):53-56

[15] 王嘉寧,郭寧.細(xì)胞凋亡的檢測技術(shù)與方法[J].中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志,2005,19(6):466-470

Wang J N,Guo N.Techniques and methods of identifyingapoptosis[J].Chinese Journal of Pharmacology and Toxicology,2005,19(6):466-470(in Chinese)

[16] Darzynkiewicz Z,Galkowski D,Zhao H.Analysis of apoptosis TUNEL by cytometry using TUNEL assay[J]. Methods,2008,44(3):250-254

[17] Luo C L,Chen X P,Ni H,et al.Comparison of labeling methods and time course of traumatic brain injury-induced cell death in mice[J].Neural Regeneration Research,2010,5(9):706-709

[18] 李江,賴柯華,馮青,等.螺蟲乙酯對(duì)斑馬魚的急性毒性及細(xì)胞凋亡的影響[J].熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué),2015,35(5): 45-49

Li J,Lai K H,Feng Q,et al.Effects of spirotetramat on acute toxicity and apoptosis of zebra fish[J].Chinese Journal of Tropical Agriculture,2015,35(5):45-49(in Chinese)

[19] OECD.OECD guidelines for the testing of chemicals. Draft proposal for a new guideline,fish embryo toxicity (FET)test［S］.Paris:OECD,2013

[20] 柏亞羅,顧林玲,張曉進(jìn),等.專利過期重要農(nóng)藥品種手冊：2012-2016[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2014

[21] 陳愛梅,王金花,夏曉明,等.不同劑型吡蟲啉對(duì)蚯蚓和斑馬魚的急性毒性評(píng)價(jià)[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào), 2013,32(9):1758-1763

[22] 陳愛梅.吡蟲啉和噻蟲嗪對(duì)對(duì)斑馬魚氧化脅迫及DNA損傷[D].泰安:山東農(nóng)業(yè)大學(xué),2013:29-30

Chen A M.Oxidative stress and DNA damage induced by imidacloprid and thiamethoxam exposure in zebrafish (Danio rerio)[D].Tai’an:Shandong Agricultural University,2013:29-30(in Chinese)

[23] 馮青,賴柯華,黃偉康,等.茚蟲威對(duì)斑馬魚的急性毒性及遺傳毒性[J].生態(tài)毒理學(xué)報(bào),2015,10(4):226-234

Feng Q,Lai K H,Huang W K,et al.Acute and genetic toxicity of indoxacarb to zebrafish(Brachydanio rerio)[J]. Asian Journal of Ecotoxicology,2015,10(4):226-234(in Chinese)◆

Effects of Dinotefuran on the Embryonic and Larvae Development and Apoptosis in Zebrafish（Danio rerio）

Sun Qi,Fan Yongmei*,Lai Kehua,Huang Weikang

College of Environment and Plant Protection,Hainan University,Haikou 570228,China

15 May 2016 accepted 29 June 2016

Dinotefuran,as one of the third-generation neonicotinoid insecticide,is highly potent pesticide widely used to control insects on rice,vegetables and fruit field.However,the toxicity of dinotefuran to aquatic organism is still unclear.This study is to explore the effect of dinotefuran on the embryonic and larvae development and apoptosis in zebrafish(Danio rerio).According to OECD guidelines,the 96 h acute toxicity test was conducted using 30 min post-fertilization zebrafish by static system,and the treated zebrafish embryonic and larvae development, were observed in 24 h,48 h,72 h and 96 h respectively.The 96 h-LC50of dinotefuran for adolescent zebrafish was calculated using Karber's method.Then using acridine orange fluorescent(AO-F)and TUNEL staining,the apoptosis of 96 hour post-fertilization(hpf)zebrafish larvae was tested.The results showed that the 96 h-LC50of dinotefuran for zebrafish was 10.36 g·L-1,with the 95%confidence interval of 7.76-12.93 g·L-1,which is the slightlytoxic according to the pesticide acute toxicity classification standard.Dinotefuran with higher concentration can reduce the tail swing frequency,heart rate and hatchability ofD.rerio,delay the growing development,lead to the disappearance of the pigment inD.rerioand cause the pericardiac cyst,vitelline cyst and tail deformity.With the increase of dinotefuran concentration,there were obvious apoptosis observed in the head,abdomen and tail of zebrafish,especially in the heart and inner ear.

dinotefuran;zebrafish;apoptosis;acridine orange fluorescent;TUNEL staining

2016-05-15 錄用日期：2016-06-29

1673-5897（2016）3-356-09

X171.5

A

10.7524/AJE.1673-5897.20160515001

簡介：范詠梅(1968—)，女，教授，碩士生導(dǎo)師，農(nóng)藥與農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全系系主任，主要研究方向農(nóng)藥環(huán)境毒理，園藝作物病蟲害防治與農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。

國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2012BAK01B05)；海南省教育廳項(xiàng)目(HNJG2014-07)

孫琦(1994-)，女，學(xué)士，研究方向?yàn)橹参锉Ｗo(hù)，E-mail:qisun2016@126.com；

*通訊作者（Corresponding author），E-mail:yongmeifan@126.com