添加糖化酶和酵母菌對24.0℃條件下啟動豆粕固體發(fā)酵的影響

陳雷，李杰*，張劉運，王立群，齊虹，李馬成，徐長躍

（1.東北農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院，黑龍江哈爾濱150030；2.黑龍江省華森畜牧科技有限公司，黑龍江哈爾濱150030）

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添加糖化酶和酵母菌對24.0℃條件下啟動豆粕固體發(fā)酵的影響

陳雷1，李杰1*，張劉運2，王立群2，齊虹2，李馬成1，徐長躍1

（1.東北農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院，黑龍江哈爾濱150030；2.黑龍江省華森畜牧科技有限公司，黑龍江哈爾濱150030）

本試驗選用枯草芽孢桿菌發(fā)酵豆粕，研究24.0℃條件下添加糖化酶和酵母菌對啟動豆粕固體發(fā)酵的影響。試驗分為A（對照）、B、C、D組，A組啟動發(fā)酵溫度為32.0℃，B、C、D組啟動發(fā)酵溫度分別為23.7、24.4、24.0℃，其中B組不添加升溫物質(zhì)，C組添加2‰糖化酶，D組添加2‰糖化酶+1‰酵母菌。測定發(fā)酵過程中溫度、pH值的變化，以及發(fā)酵后豆粕的營養(yǎng)成分和抗營養(yǎng)因子變化。結(jié)果表明：D組發(fā)酵過程中升溫速度比B、C組快，但低于對照組；D組發(fā)酵后粗蛋白質(zhì)含量較對照組提高1.14%（P＞0.05）；小肽含量降低1.72%（P＞0.05），抗營養(yǎng)因子中脲酶和胰蛋白酶抑制因子含量分別降低48.67%（P＜0.05）和27.71%（P＞0.05）。試驗表明，在24.0℃條件下啟動豆粕固體發(fā)酵，通過添加2‰糖化酶＋1‰酵母菌，可以使發(fā)酵溫度得到較快提升，能夠節(jié)約一定的能源。

發(fā)酵豆粕；溫度；營養(yǎng)成分；抗營養(yǎng)因子

發(fā)酵豆粕是一種優(yōu)質(zhì)的植物性蛋白飼料，與未發(fā)酵的豆粕相比，具有抗營養(yǎng)因子明顯降低、常規(guī)營養(yǎng)成分得到改善、富含多種活性因子、適口性好、抗菌能力強等營養(yǎng)特性。戚薇和唐翔宇（2008）采用固體發(fā)酵法發(fā)酵豆粕，菌種為納豆芽孢桿菌和凝結(jié)芽孢桿菌，兩種菌的比例為1∶1，發(fā)酵后豆粕的蛋白水解度為20.14%，胰蛋白酶抑制因子比發(fā)酵前降低了95%，發(fā)酵后豆粕中含有蛋白酶、乳酸、小肽等活性因子。發(fā)酵豆粕在畜禽生產(chǎn)中應(yīng)用廣泛，可以提高畜禽生產(chǎn)性能，改善腸道功能，降低仔豬腹瀉率等。馮杰等（2007）研究發(fā)現(xiàn)，在仔豬日糧中添加發(fā)酵豆粕，飼料增重比、腹瀉指數(shù)、血清尿素氮分別降低8.39%（P＜0.05）、39.96%（P＜0.01）、39.47%（P＜0.01）。

菌種生長繁殖的適宜溫度在35℃左右，所以豆粕發(fā)酵的啟動溫度應(yīng)該在30℃以上，在北方地區(qū)由于氣候寒冷，想要達到與南方相同的發(fā)酵啟動溫度，就需要消耗更多的能源。本試驗根據(jù)北方地區(qū)寒冷的氣候特點，用枯草芽孢桿菌啟動豆粕固體發(fā)酵，通過在豆粕培養(yǎng)基中添加糖化酶和酵母菌，研究其對24.0℃條件下啟動豆粕固體發(fā)酵的影響。

1　材料與方法

1.1試驗材料菌種：枯草芽孢桿菌、釀酒酵母菌。豆粕、米糠、糖蜜、菌體蛋白等由黑龍江華森畜牧科技有限公司提供。

液體種子培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，酵母膏5 g，氯化鈉5 g，葡萄糖5 g，水1000 mL，121℃滅菌15 min。

豆粕培養(yǎng)基：豆粕870 kg，米糠60 kg，菌體蛋白80 kg，尿素15 kg，糖蜜40 L，水400 L。

1.2試驗方法固體發(fā)酵選擇枯草芽孢桿菌為發(fā)酵菌種，糖化酶和酵母菌作為升溫物質(zhì)。試驗共分為4組（A、B、C、D），每組分別添加2‰的芽孢桿菌，A組選擇32.0℃作為發(fā)酵啟動溫度，即對照組，B、C、D組發(fā)酵啟動溫度分別為23.7、24.4、24.0℃，對照組的啟動溫度為較高溫度水混合豆粕培養(yǎng)基后的溫度，試驗組的啟動溫度為較低溫度水混合豆粕培養(yǎng)基后的溫度，其中B組不添加升溫物質(zhì)，C組在豆粕培養(yǎng)基中添加2‰糖化酶，D組在添加糖化酶基礎(chǔ)上額外添加1‰的酵母菌。每組進行3個重復(fù)，每個重復(fù)發(fā)酵1 t豆粕。

本試驗先將豆粕、米糠、菌體蛋白、尿素等培養(yǎng)基鋪于地面，培養(yǎng)好的菌種加到水中活化0.5 h，待菌種活化后，將糖蜜、糖化酶加到水中溶解，最后和豆粕培養(yǎng)基混勻。每噸豆粕培養(yǎng)基混勻后分別為長3 m、上寬1 m、下寬1.5 m、高0.8 m的梯形體。每隔4 h測定一次發(fā)酵過程中溫度變化，每隔8 h取一次樣，測定發(fā)酵過程中pH值的變化。分別于豆粕培養(yǎng)基的正中間取樣，以及距離中間各0.75 m共三個點取三次樣，然后混勻。由于枯草芽孢桿菌屬于好氧菌種，待發(fā)酵溫度上升到50℃以上，對豆粕培養(yǎng)基翻一次料，給芽孢桿菌補充氧氣，當發(fā)酵溫度再次上升到50℃以上，發(fā)酵結(jié)束。發(fā)酵結(jié)束后，測定濕樣的菌數(shù)和pH值，然后將濕樣放入烘箱中65℃烘干，粉碎過60目篩，分別測得各組豆粕發(fā)酵后的營養(yǎng)成分和抗營養(yǎng)因子的變化。

1.3測定指標及方法粗蛋白質(zhì)測定方法為采用國家標準GB/T 6432-1994的凱氏定氮法。小肽測定方法為國家飼料大豆肽粉標準QB/T 2653-2004。粗灰分測定方法為采用國家標準GB/T 6438-1992的灼燒法。粗纖維測定方法為采用國家標準GB/T 6434-1994的酸堿法。氨基酸測定方法采用國家標準GB/T 18246-2000。有益菌活菌數(shù)采用涂平板法。溫度采用電子溫度計測定。pH值用pH計測定。胰蛋白酶抑制因子采用BAPNA法測定。脲酶活性采用滴定法測定。

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進行單因素方差分析，測定結(jié)果以“平均值±標準差”表示。

2　結(jié)果

2.1豆粕發(fā)酵過程中溫度的變化由圖1可知，對照組啟動溫度較高為32.0℃，試驗組啟動溫度較低，分別為23.7、24.4、24.0℃。發(fā)酵開始后由于室溫低于20℃，所以發(fā)酵溫度有小幅的降低，發(fā)酵8 h以后，溫度開始逐漸升高，對照組由于啟動溫度較高，24 h后溫度達到51.4℃，比試驗組提前16 h進行翻料，翻料之后發(fā)酵溫度降低到45.2℃，40 h后溫度上升到53.0℃，之后溫度保持穩(wěn)定；C、D組發(fā)酵24 h后溫度到達30℃以上，到達30℃以后，D組比B、C組升溫較快，發(fā)酵40 h后D組溫度達到51.2℃，64 h之后發(fā)酵溫度上升到56.0℃，發(fā)酵時間多于對照組24 h。

圖1　豆粕發(fā)酵過程中的溫度變化

2.2豆粕發(fā)酵過程中pH值的變化由圖2可知，對照組和試驗組起始pH值分別為6.34、6.20、6.46、6.72。在發(fā)酵的開始階段，pH值上升，到16 h之后D組pH值上升到最高，為8.40，B、C組和對照組pH值在32 h后上升到最大，分別為8.06、7.42、7.68。隨著發(fā)酵的進行，各組pH值開始下降，其中對照組pH值下降的最快，發(fā)酵結(jié)束之后pH值分別為5.86、5.78、5.56、5.70，各組之間差異不大。

圖2　豆粕發(fā)酵過程中pH值的變化

2.3豆粕發(fā)酵后營養(yǎng)成分的變化由表1可知，豆粕發(fā)酵后粗蛋白質(zhì)、小肽含量均極顯著高于發(fā)酵前含量（P＜0.01）。D組粗蛋白質(zhì)含量與對照組相比，提高1.14%（P＞0.05）；各試驗組小肽含量分別較對照組降低6.24%、2.90%、1.72%，其中D組小肽含量高于B組4.82%（P＜0.05）；發(fā)酵后各組菌數(shù)、粗灰分、粗纖維、水分含量差異均不顯著（P＞0.05）。

表1　豆粕發(fā)酵后營養(yǎng)成分的變化

2.4豆粕發(fā)酵后氨基酸含量的變化由表2可知，發(fā)酵后大部分氨基酸含量均有所提高，其中提高較多的有谷氨酸、蛋氨酸和丙氨酸，而胱氨酸、精氨酸等有小幅降低。發(fā)酵后各組氨基酸總量分別提高了5.41%、8.06%、0.72%、4.58%。試驗組和對照組相比，C組氨基酸總量分別低于其他三組4.44%、6.79%、3.69%，B組氨基酸總量最高，高于對照組2.52%，D組低于對照組0.78%。

表2　豆粕發(fā)酵后氨基酸含量的變化

2.5豆粕發(fā)酵后抗營養(yǎng)因子的變化由表3可知，發(fā)酵后豆粕中的脲酶和胰蛋白酶抑制因子的含量均極顯著低于發(fā)酵前（P＜0.01）。發(fā)酵后各組相比，D組中脲酶含量降低最多，分別低于其他三組48.67%、40.82%、53.23%；發(fā)酵后各組中胰蛋白酶抑制因子比發(fā)酵前分別降低了32.46%、56.24%、47.95%、51.17%，D組和對照組相比，降低27.71%（P＞0.05）。

表3　豆粕發(fā)酵后抗營養(yǎng)因子的變化

3　討論

3.1發(fā)酵過程中溫度、pH值的變化本試驗結(jié)果表明，對照組的發(fā)酵溫度上升速度快于各試驗組，這主要由于對照組啟動發(fā)酵的溫度為32.0℃，適于菌種生長和繁殖，各試驗組之間在發(fā)酵開始階段升溫變化不大，當發(fā)酵溫度上升到30℃以后，C組比B組升溫快，這主要是由于30℃之后，糖化酶將豆粕中的碳水化合物分解為葡萄糖等單糖，釋放能量，從而使發(fā)酵溫度升高。王衛(wèi)國等（1996）研究表明，糖化酶的最適溫度為32℃，加酶量為0.2%，主要發(fā)酵周期能夠縮短2～3 d。本試驗D組升溫比B、C組快，這主要是由于酵母菌在呼吸過程中產(chǎn)熱。張紅和褚西寧（1996）認為，由于酵母菌進行呼吸作用，消耗了部分有機物而產(chǎn)生熱量，從而使溫度升高。發(fā)酵結(jié)束后，D組發(fā)酵溫度上升到56.0℃，試驗組的發(fā)酵時間多于對照組24 h。豆粕發(fā)酵開始階段各組pH值都有所上升，有可能是因為菌體在繁殖代謝過程中產(chǎn)生了一些使pH值升高的物質(zhì)，隨著發(fā)酵的進行pH值開始降低，這是因為芽孢桿菌在繁殖過程中產(chǎn)生有機酸類物質(zhì)，使發(fā)酵豆粕的pH值降低。發(fā)酵結(jié)束后，各組pH值差異不大。

3.2發(fā)酵過程中營養(yǎng)成分的變化發(fā)酵豆粕與普通豆粕相比，營養(yǎng)成分得到改善，并且富含多種活性因子。蔡國林等（2008）發(fā)現(xiàn)，用酵母菌和乳酸菌發(fā)酵豆粕，發(fā)酵后粗蛋白質(zhì)的含量為49.7%，比發(fā)酵前提高了3.5%。吳勝華等（2009）用酵母菌發(fā)酵豆粕，小肽含量由1.6%上升到8.7%。Hong等（2004）研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵后豆粕中的大分子蛋白有一部分降解為小于20 kDa的小分子肽類。本試驗結(jié)果表明，豆粕發(fā)酵后各組粗蛋白質(zhì)含量均顯著高于發(fā)酵前（P＜0.01），這主要是由于微生物在繁殖代謝過程中利用了豆粕中的碳水化合物，出現(xiàn)了蛋白質(zhì)的“濃縮效應(yīng)”（湯紅武等，2003）。試驗組和對照組相比，粗蛋白質(zhì)含量差異不顯著（P＞0.05）；發(fā)酵后各組小肽含量均顯著高于發(fā)酵前（P＜0.01），主要是由于在發(fā)酵過程中菌體產(chǎn)生蛋白酶，將豆粕中的一部分大分子蛋白分解為小分子肽類，從而提高了發(fā)酵豆粕中小肽含量，發(fā)酵后各組間相比，試驗D組小肽含量低于對照組1.72%（P＞0.05）；發(fā)酵后各組粗纖維、菌數(shù)、粗灰分和水分含量相比，并沒有顯著差異（P＞0.05）。

3.3發(fā)酵過程中氨基酸含量的變化由于微生物在發(fā)酵過程中會產(chǎn)生降解大分子蛋白的酶類，不僅蛋白質(zhì)含量提高，也增加了氨基酸含量。楊旭等（2008）發(fā)現(xiàn)豆粕發(fā)酵后，賴氨酸、蘇氨酸、蛋氨酸含量分別增加了16.28%、17.01%、56.41%，17種氨基酸總量比發(fā)酵前增加了6.58%。馬文強等（2008）研究發(fā)現(xiàn)，用枯草芽孢桿菌發(fā)酵豆粕后大部分氨基酸含量有所增加，氨基酸總量增加了11.49%。Refstie等（2001）發(fā)現(xiàn)，用乳酸菌發(fā)酵豆粕，發(fā)酵后蛋氨酸、蘇氨酸和纈氨酸含量有所提高，亮氨酸、苯丙氨酸等含量有所下降。本試驗結(jié)果表明，發(fā)酵后大部分氨基酸含量有所提高，氨基酸總量比發(fā)酵前分別提高了5.41%、8.06%、0.72%、4.58%；發(fā)酵后各組相比，C組氨基酸總量提高較少，D組低于對照組0.78%，但差異不大。

3.4發(fā)酵過程中抗營養(yǎng)因子的變化大量研究表明，豆粕經(jīng)過微生物發(fā)酵后，其中的抗營養(yǎng)因子如胰蛋白酶抑制因子、大豆抗原蛋白、植酸等含量大大降低或完全消除?？範I養(yǎng)因子通過微生物降解的途徑主要有兩種：（1）微生物在生長繁殖過程中，消耗利用了一些非蛋白類抗營養(yǎng)因子，如植酸、低聚糖等；（2）微生物自身分泌的蛋白酶可分解豆粕中的蛋白類抗營養(yǎng)因子，如大豆抗原蛋白、胰蛋白酶抑制因子、脲酶等。張麗靖等（2008）研究發(fā)現(xiàn)，在適宜的條件下發(fā)酵豆粕，脲酶活性比發(fā)酵前降低了93%。鄭裴等（2009）用乳酸菌發(fā)酵豆粕，測得抗營養(yǎng)因子中脲酶活性由發(fā)酵前的0.373 U/g降到發(fā)酵后的0.166 U/g，胰蛋白酶抑制因子含量由40.42 mg/g降到18.01 mg/g。本試驗結(jié)果表明，發(fā)酵后豆粕中的脲酶和胰蛋白酶抑制因子含量均顯著低于發(fā)酵前（P＜0.01）；發(fā)酵后各組相比，D組脲酶含量低于對照組48.67%（P＜0.05），低于C組53.23%（P＜0.05）；發(fā)酵后各組胰蛋白酶抑制因子含量相比，差異不顯著（P＞0.05）。

4　結(jié)論

本試驗結(jié)果表明，在24.0℃條件下通過添加2‰糖化酶和1‰酵母菌，能使豆粕發(fā)酵溫度較快提升，雖然發(fā)酵時間多于對照組，但能夠節(jié)約一定的能源。

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This experiment was conducted to study the effects of adding glucoamylase and yeast on starting the soybean meal solid fermentation by bacillus subtilis in the condition of 24.0℃.The temperature for starting the fermentation of group A（the control）was 32.0℃，the temperatures of groups B，C，D were 23.7，24.4，24.0℃，group B wasn’t added heating substance，group C was added 2‰glucoamylase，group D was added 2‰glucoamylase＋1‰yeast.The changes of temperature and pH during the fermentation process，nutrient contents and anti-nutritional factors after fermentation were measured.The results showed as follows：The heating rise of group D during the fermentation was faster than group B，C，but lower than the control group；after fermentation，compared with the control group，the crude protein content of group D was increased by 1.14%（P＞0.05），the small peptide content was reduced by 1.72%（P＞0.05）；the urease and trypsin inhibitor content were reduced by 48.67%（P＜0.05）and 27.71%（P＞0.05）.The results indicated that：To start the soybean meal solid fermentation in the condition of 24.0℃，the fermentation temperature had been rapidly increased by adding 2‰glucoamylase＋1‰yeast，it could save some energy.

fermented soybean meal；temperature；nutrient contents；anti-nutritional factors

S816.7

A

1004-3314（2016）05-0021-04

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20160505

提高北方寒區(qū)優(yōu)質(zhì)蛋白飼料（發(fā)酵豆粕）產(chǎn)能關(guān)鍵技術(shù)和產(chǎn)品開發(fā)（2013G0173）