桑天牛成蟲血淋巴凝結(jié)抑制劑的篩選

金　鳳，嵇保中，唐進根

（1.南京林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，江蘇　南京210037；2.金陵科技學(xué)院　園藝學(xué)院，江蘇　南京210038）

桑天牛成蟲血淋巴凝結(jié)抑制劑的篩選

金鳳1，2，嵇保中1，唐進根1

（1.南京林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，江蘇南京210037；2.金陵科技學(xué)院園藝學(xué)院，江蘇南京210038）

選用檸檬酸鈉等8種藥劑進行了對桑天牛Apriona germari成蟲血淋巴凝結(jié)的抑制試驗。冷藏血淋巴溶解時按V（血淋巴）∶V（抑制劑）∶V（苯基硫脲）=1∶1∶1和1∶2∶2的用量加入抑制劑，4℃下靜置2 min和6 h，各藥劑抑制血淋巴凝結(jié)結(jié)果為：按V（血淋巴）∶V（抑制劑）∶V（苯基硫脲）=1∶2∶2的用量加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10 g·kg-1檸檬酸鈉，凝結(jié)抑制效果最好，檸檬酸-磷酸二氫鈉溶液、草酸鉀、秋水仙堿、任氏液、磷酸緩沖液也有一定的抑制作用，而噻孢霉素和硫酸新霉素的抑制作用很小。按1∶2∶2的用量加入10 g·kg-1檸檬酸鈉，可更有效抑制冷藏血淋巴解凍時的凝結(jié)。新鮮血淋巴采集時按V（血淋巴）∶V（抑制劑）∶V（苯基硫脲）=1∶2∶2的用量加入抑制劑，6 h后觀察表明：10 g·kg-1檸檬酸鈉的凝結(jié)抑制效果最好；任氏液、磷酸緩沖液、檸檬酸-磷酸氫鈉緩沖液處理的血淋巴，有少量沉淀；其余4種藥劑處理的血淋巴均有大量沉淀和凝塊產(chǎn)生。用檸檬酸鈉處理桑天牛成蟲血淋巴，可有效抑制其血淋巴的凝結(jié)。表7參14

森林保護學(xué)；桑天牛；血淋巴；抑制劑；凝結(jié)

血淋巴是昆蟲循環(huán)和免疫系統(tǒng)的重要組成。血淋巴的大量采集和冷凍保存是昆蟲生理生化研究的常用方法，以解決某一蟲態(tài)活動時間較短，而分析測試又需經(jīng)常進行的矛盾。昆蟲種類繁多。種類不同往往其血淋巴的功能也有所差異。在一些昆蟲血淋巴內(nèi)存在凝集素或包囊血細(xì)胞（或凝結(jié)血細(xì)胞），可引起血淋巴凝結(jié)［1-3］。血淋巴凝結(jié)是昆蟲細(xì)胞免疫的組成部分，但此作用卻妨礙了對血淋巴生理、生化特性及其他功能的研究。使用凝結(jié)抑制劑是解決該類問題的主要方法。目前，有關(guān)人類、獸類和鼠類抗凝血劑的研究報道較多，但針對昆蟲血淋巴凝結(jié)抑制劑的研究少見報道［4-7］。向離體血淋巴中添加檸檬酸、檸檬酸鈉、草酸鉀或使用大量任氏液、PBS液對離體血淋巴進行稀釋，在不同昆蟲血淋巴中起到抗凝結(jié)作用［8-11］。采集桑天牛Apriona germari成蟲血淋巴離體觀察，發(fā)現(xiàn)血淋巴凝結(jié)而形成大的結(jié)塊。因此，根據(jù)前人的研究資料［12］，選取8種藥劑進行了不同條件下桑天牛成蟲血淋巴抗凝結(jié)試驗，為桑天牛血淋巴生理生化功能的深入研究奠定基礎(chǔ)。

1　材料和方法

1.1供試材料和藥劑

1.1.1供試材料蟲源：7月和8月采集桑天牛成蟲，在實驗室內(nèi)室溫下籠中人工飼養(yǎng)，用水插構(gòu)樹Broussonetia papyrifera枝條供其補充營養(yǎng)。冷藏血淋巴：采用后翅翅基血竇采血法［13］，將血淋巴采入預(yù)冷過的1 mL壓蓋離心管中，立即置于-25℃冰箱中冷凍保存，備用。

1.1.2供試藥品檸檬酸鈉、檸檬酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、草酸鉀、苯基硫脲、氯化鈉、氯化鈣、氯化鉀、氯化鎂、碳酸氫鈉、葡萄糖等藥劑均為市購分析純。噻孢霉素（cefotaxime）：上海純優(yōu)生物科技有限公司；硫酸新霉素（neomycin sulfate）：蘇州鑫發(fā)生物科技有限公司；秋水仙堿：西安同生生物科技有限公司。

1.2試驗方法

1.2.1抑制劑配制共配制8種供試抑制劑，分別為10 g·kg-1檸檬酸鈉，10-4mol·L-1噻孢子霉素，10-4mol·L-1硫酸新霉素，0.2 mol·L-1檸檬酸-磷酸二氫鈉緩沖液（pH 7.0），10-4mol·L-1秋水仙堿，2 g·kg-1草酸鉀和任氏液（Ringer-Tyrode氏鹽溶液：氯化鈉0.700 g，氯化鈣0.020 g，磷酸氫二鈉0.020 g，氯化鉀0.020 g；氯化鎂0.020 g，碳酸氫鈉0.012 g，葡萄糖0.800 g，蒸餾水100 mL），0.2 mol·L-1磷酸緩沖液（PBS，pH 7.0），10-3mol·L-1苯基硫脲。對照為蒸餾水。

1.2.2冷藏血淋巴的溶解從冰箱中取冷凍血淋巴，立即按V（血淋巴）∶V［抑制劑（或蒸餾水）］∶V（苯基硫脲）=1∶1∶1和1∶2∶2的比例，加入各藥液，緩慢振蕩使血淋巴溶解并與藥液混勻，4℃下靜置2 min，觀察管中是否有凝結(jié)、黑化現(xiàn)象出現(xiàn)，搖勻后取樣涂片于顯微鏡下觀察是否有完整血細(xì)胞、血細(xì)胞碎片、顆粒狀沉淀、血凝塊存在等，每種混合液均查涂片3張。4℃下靜置6 h后，再次觀察，所查內(nèi)容同前。重復(fù)1次。

1.2.3新鮮血淋巴凝結(jié)抑制試驗在上述試驗基礎(chǔ)上，按V（血淋巴）∶V［抑制劑（或蒸餾水）］∶V（苯基硫脲）=1∶2∶2的用量，用20 μL定量毛細(xì)吸管分別吸取各抑制劑20 μL放入1 mL壓蓋離心管中，各加入基硫脲苯20 μL·管-1后，放入4℃冰箱中預(yù)冷。取桑天牛成蟲，用昆蟲針刺破后翅翅基血竇，用定量毛細(xì)吸管吸取10 μL血淋巴分放于各管中，搖勻，4℃下靜置2 min后，觀察，鏡檢，其觀察內(nèi)容和鏡檢方法及內(nèi)容與1.2.2所述相同。于4℃冰箱中放置6 h后，再次觀察。重復(fù)1次。

1.3判定標(biāo)準(zhǔn)

通過肉眼檢查和顯微鏡鏡檢觀察血淋巴凝結(jié)結(jié)果，判定標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1　桑天牛血淋巴凝結(jié)程度的判斷標(biāo)準(zhǔn)Table 1　Hemolymph coagulation degree judgement standard

2　結(jié)果與分析

2.1冷藏血淋巴的凝結(jié)抑制試驗

冷凍血淋巴溶解時按V（血淋巴）∶V［抑制劑（或蒸餾水）］∶V（苯基硫脲）=1∶1∶1和1∶2∶2的用量加入抑制劑后，充分混勻，4℃冰箱中靜置2 min和6 h后，分別觀察，2次重復(fù)的綜合結(jié)果記錄于表1～5中。

在所試藥劑中，10 g·kg-1檸檬酸鈉對冷藏血淋巴解凍時凝結(jié)抑制效果最好，在2種用量下均可使冷凍血淋巴完全解凍而不形成較大凝塊，僅在其管底有極少量沉淀。鏡檢發(fā)現(xiàn)細(xì)胞碎片若干，有極少量顆粒狀沉淀，是所試藥劑中顆粒狀沉淀最少的。在1∶1∶1的處理中，初查時發(fā)現(xiàn)有棱柱狀晶體存在，6 h后再查時，有血凝塊出現(xiàn)，而在1∶2∶2的處理中未見上述情況出現(xiàn)。這表明：按1∶2∶2的用量加入10 g·kg-1檸檬酸鈉，可有效抑制冷藏血淋巴解凍時的凝結(jié)。

表2　靜置2 min后冷藏血淋巴中各抑制劑的凝結(jié)抑制結(jié)果［V（血淋巴）∶V（抑制劑］∶V（苯基硫脲）=1∶1∶1］Table 2　Inhibitory effect of clotting inhibitor to cold hemolymph treated 2 min［V（hemolymph）：V（inhibitor）：V（phenyl thiourea）=1：1：1］

塞孢霉素、硫酸新霉素2種用量的處理中，均于管底和管壁形成附著性膠狀凝結(jié)，其上部液體初查時較清，6 h后再查時，混濁，鏡檢除發(fā)現(xiàn)有大量顆粒狀沉淀外，還有由血細(xì)胞組成的大型塊狀凝結(jié)物，與對照組凝結(jié)現(xiàn)象相似，表明這2種藥劑對桑天牛成蟲血淋巴凝結(jié)的抑制作用極小。

靜置2 min后，檸檬酸-磷酸二氫鈉溶液、草酸鉀、秋水仙堿、任氏液、磷酸緩沖液等處理的血淋巴中，均未出現(xiàn)與對照相似的附著性膠狀凝結(jié)，但均有沉淀出現(xiàn)。檸檬酸-磷酸二氫鈉、草酸鉀處理的血淋巴明顯混濁，其他均較清。鏡下觀察，此2種藥劑處理的血淋巴中均充滿顆粒狀沉淀，同時存在著數(shù)量不等的血細(xì)胞碎片及凝塊。靜置6 h后，上述5種藥劑的1∶1∶1處理中，除磷酸緩沖液處理外，均出現(xiàn)血淋巴凝塊。在檸檬酸-磷酸氫鈉溶液、草酸鉀的處理中還發(fā)現(xiàn)了結(jié)晶體，而1∶2∶2用量的處理中，均未見凝塊出現(xiàn)。這些情況表明：此5種藥劑均對桑天牛血淋巴有一定的抗凝作用，在1∶2∶2的用量下可有效抑制大凝塊的形成。

表3　靜置6 h后冷藏血淋巴中各抑制劑的凝結(jié)抑制結(jié)果［V（血淋巴）∶V（抑制劑∶V（苯基硫脲）=1∶1∶1］Table 3　Inhibitory effect of clotting inhibitor to cold hemolymph treated 6 h［V（hemolymph）：V（inhibitor）：V（phenyl thiourea）=1：1：1］

表4　靜置2 min后冷藏血淋巴中各抑制劑的凝結(jié)抑制結(jié)果［V（血淋巴）∶V（抑制劑∶V（苯基硫脲）=1∶2∶2］Table 4　Inhibitory effect of clotting inhibitor to cold hemolymph treated 2 min［V（hemolymph）：V（inhibitor）：V（phenyl thiourea）=1：2：2］

在V（血淋巴）∶V（抑制劑）∶V（苯基硫脲）=1∶2∶2的試驗中，檸檬酸鈉（10 g·kg-1），任氏液、磷酸緩沖液、硫酸新霉素、塞孢霉素等的處理血淋巴中，均查到有完整的血細(xì)胞貼附于玻片上，有的呈卵圓形、有的呈梭形，而對照及其他處理中均未見。這說明用這幾種藥劑溶解血淋巴，其中有部分較穩(wěn)定的血細(xì)胞可完整保存。

2.2新鮮血淋巴凝結(jié)抑制試驗

選用8種抑制劑按V（血淋巴）∶V（抑制劑）∶V（苯基硫脲）=1∶2∶2的用量，處理新采的血淋巴，4℃分別靜置2 min后和6 h后綜合觀察結(jié)果為（表6和表7）：蒸餾水稀釋的血淋巴，2 min后觀察即出現(xiàn)大量沉淀、混濁；6 h后，沉淀更多，有凝塊形成。所試抑制劑中2 min后觀察：10 g·kg-1檸檬酸鈉處理的血淋巴無沉淀產(chǎn)生，有大量卵圓形和不規(guī)則狀的血細(xì)胞存在；任氏液、磷酸緩沖液處理的血淋巴液清澈均勻，有極少量沉淀，完整血細(xì)胞數(shù)量也較多，同時有由血細(xì)胞形成的凝結(jié)物，其血細(xì)胞形狀清晰可辨。檸檬酸-磷酸二氫鈉緩沖液處理的血淋巴，液體較清，有少量沉淀，發(fā)現(xiàn)少量完整血細(xì)胞和少量顆粒狀沉淀；其余4種抑制劑處理的血淋巴均有大量沉淀產(chǎn)生，除塞孢霉素的血淋巴液較清外，其他均混濁；除草酸鉀處理外，均有少數(shù)完整細(xì)胞存在，且這4種處理的血淋巴中均有大量顆粒狀沉淀，有少量凝結(jié)物出現(xiàn)，或為顆粒組成的團塊狀，或為膜狀凝結(jié)。因此，10 g·kg-1檸檬酸鈉是8種抑制劑中凝結(jié)抑制效果最好的，6 h后的觀察，更加說明了這一點：10 g·kg-1檸檬酸鈉處理的血淋巴中僅出現(xiàn)極少量沉淀，可見大量卵圓形血細(xì)胞和少量細(xì)胞碎片；其他處理均有大量沉淀產(chǎn)生，鏡檢中可見大量凝結(jié)物形成。以上說明，10 g·kg-1檸檬酸鈉按V（血淋巴）∶V（抑制劑）∶V（苯基硫脲）=1∶2∶2的用量處理桑天牛成蟲新鮮血淋巴，可有效抑制血淋巴的凝結(jié)。

表5　靜置6 h后冷藏血淋巴中各抑制劑的凝結(jié)抑制結(jié)果［V（血淋巴∶V（抑制劑）∶V（苯基硫脲）=1∶2∶2）］Table 5　Inhibitory effect of clotting inhibitor to cold hemolymph treated 6 h［V（hemolymph）：V（inhibitor）：V（phenyl thiourea）=1：2：2］

表6　靜置2 min后新鮮血淋巴中各抑制劑的凝結(jié)抑制結(jié)果［V（血淋巴）∶V（抑制劑）∶V（苯基硫脲）=1∶2∶2］Table 6　Inhibitory effect of clotting inhibitor to fresh hemolymph treated 2 min［V（hemolymph）：V（inhibitor）：V（phenyl thiourea）=1：2：2］

表7　處理6 h后新鮮血淋巴中各抑制劑的凝結(jié)抑制結(jié)果［V（血淋巴）∶V（抑制劑）∶V（苯基硫脲）=1∶2∶2］Table 7　Inhibitory effect of clotting inhibitor to fresh hemolymph treated 6 h［V（hemolymph）：V（inhibitor）：V（phenyl thiourea）=1：2：2］

3　討論

昆蟲離體血淋巴的凝結(jié)抑制方法主要有化學(xué)方法和物理方法兩大類?；瘜W(xué)方法即是通過向血淋巴中加入化學(xué)試劑或用有機酸蒸氣對成蟲進行薰蒸來阻止離體血淋巴的凝結(jié)。物理方法包括對昆蟲蟲體進行加熱、冰凍和用射線處理等［8-11］。昆蟲生化研究，采用常規(guī)的采血、低溫冷藏方法基本上能滿足實驗要求。而對昆蟲血細(xì)胞和血淋巴蛋白質(zhì)組分的分離，有必要防止血淋巴的凝集作用。物理方法以及對昆蟲成蟲的化學(xué)薰蒸會導(dǎo)致成蟲蟲體有較大損害或死亡，不利于實驗過程中對昆蟲的連續(xù)采血，因此，選擇加入化學(xué)試劑來達到抑制血淋巴凝結(jié)的目的。

檸檬酸鈉、檸檬酸、草酸鉀等化學(xué)試劑加入血淋巴，或使用任氏液、磷酸緩沖液等稀釋血淋巴，在不同昆蟲中起到抗凝結(jié)作用［8-9］。如將血淋巴采集加入預(yù)先冰浴的基本組成為0.098 mol·L-1氫氧化鈉，0.18 mol·L-1氯化鈉 ，0.041 mol·L-1檸檬酸的緩沖液中，可有效抑制血淋巴的凝結(jié)［14］。本研究結(jié)果表明：定量的檸檬酸鈉可有效抑制桑天牛血淋巴的凝結(jié)。

不同昆蟲離體血淋巴凝血現(xiàn)象可分成4種類型［9］。類型Ⅰ：一種脆弱透明血細(xì)胞對環(huán)境發(fā)生適應(yīng)性結(jié)構(gòu)變化，在保持細(xì)胞形狀的基礎(chǔ)上，向周圍血淋巴蛋白質(zhì)中劇烈釋放細(xì)胞內(nèi)顆粒狀物質(zhì)。血淋巴蛋白質(zhì)圍繞在這些顆粒物周圍形成云霧狀沉淀，開始凝結(jié)，隨后，顆粒物與凝結(jié)島（即血細(xì)胞）間的血淋巴進一步形成顆粒狀纖維，形成區(qū)域性島狀凝結(jié)。類型Ⅱ：脆弱透明血細(xì)胞接觸到基物時，立即向外伸出直的線狀延伸物，其中運載細(xì)胞質(zhì)顆粒物，并附著于固體顆粒、物理性干擾（如氣泡等）和其他的血細(xì)胞上。這種延伸形成網(wǎng)狀，凝結(jié)以透明彈性膜的方式展開。類型Ⅲ：透明細(xì)胞像類型Ⅰ中一樣形成網(wǎng)狀；血淋巴凝結(jié)：類型Ⅱ和類型Ⅰ中2種凝結(jié)方式均存在。類型Ⅳ：在上述3種類型中脆弱透明血細(xì)胞，不因環(huán)境影響而發(fā)生變化。鏡檢中發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞內(nèi)部及周圍血淋巴蛋白質(zhì)中均無變化。

經(jīng)過觀察，桑天牛成蟲血淋巴的凝血可歸屬于類型Ⅰ，與溝脛天牛亞科Lamiinae和鋸天牛亞科Prioninae多數(shù)昆蟲離體血淋巴凝血現(xiàn)象主要屬于類型Ⅰ的結(jié)果相一致。檸檬酸鈉可能有效抑制血淋巴凝血現(xiàn)象為類型Ⅰ的昆蟲血淋巴的凝結(jié)。

在血淋巴凝結(jié)抑制試驗中，用V（檸檬酸鈉）∶V（草酸鉀）∶V（檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液）=1∶1∶1處理中，均發(fā)現(xiàn)了柱狀晶體的出現(xiàn)。許多報道都已表明，這3種物質(zhì)可移走脊椎動物血液中鈣離子達到抑制凝結(jié)的目的［9］。因此，初步認(rèn)為此3種藥劑是與血淋巴中的鈣離子結(jié)合，通過移走血淋巴中的鈣離子，起到阻止血淋巴凝結(jié)的作用。而這3種藥劑與血淋巴中鈣離子結(jié)合反應(yīng)的速度，可能決定了它們抑制凝結(jié)效果的好壞。反應(yīng)慢的，不能將血淋巴中的鈣離子立即結(jié)合掉，使多數(shù)細(xì)胞釋放出的凝集素得以傳遞、表達，抑制作用失敗。由此推論：桑天牛成蟲血淋巴凝結(jié)過程可能為成蟲血淋巴中的血細(xì)胞，在環(huán)境變化影響下，釋放出大量可激發(fā)血淋巴蛋白質(zhì)凝結(jié)的物質(zhì)，這些物質(zhì)與鈣離子結(jié)合后引起凝血反應(yīng)來起到止血或防御作用。任氏液、磷酸緩沖液的處理，十分接近昆蟲血淋巴中無機離子的組成，又對血淋巴進行了稀釋，延長了鈣離子到達作用部位的時間，在短時間內(nèi)起到一定的抑制作用。其他3種藥劑可能對鈣離子不起什么作用，因此其抑制凝作用極小。

試驗過程中，冷藏血淋巴的凝結(jié)反應(yīng)主要是發(fā)生于冷凍前，還是發(fā)生于溶解后，或者在采血和儲藏過程中都有凝結(jié)情況發(fā)生？這有待研究，以便為昆蟲血淋巴的采集、儲存提供依據(jù)。此外，血細(xì)胞釋放物質(zhì)組成及作用機制，血淋巴凝結(jié)物的組成成分以及凝結(jié)反應(yīng)的基本生化過程等，都有待于進一步深入研究探討。

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Hemolymph coagulation inhibitor screening for use on Apriona germari

JIN Feng1，2，JI Baozhong1，TANG Jingen1
（1.College of Forestry，Nanjing Forestry University，Nanjing 210037，Jiangsu，China；2.College of Horticulture，Jinling Institute of Technology，Nanjing 210038，Jiangsu，China）

Adding suitable agglutination inhibitor has helpful for long-term preservation of hemolymph and for physiological and biochemical research of hemolymph.Hemolymph agglutination inhibition tests on adult Apriona germari were conducted using sodium citrate and seven other drugs.During dissolving of cold storage hemolymph，mixtures（by volume）of hemolymph，inhibitor and phenylthiourea were made and then placed at 4 ℃.Inhibition effects of every inhibitor mixture（citric acid-natrium，dihydrogen phosphate buffer，potassium oxalate，colchicine，Ringer solution，and a phosphate-buffered saline（PBS）buffer），were determined after being applied for 2 min and for 6 h.Through the naked eye observation and microscopic examination，the shape and quantity of sediment and the blood cells were intact to evaluate the effect of anticoagulation.Results showed that the inhibition effect of 1%sodium citrate in the mixture of hemolymph，sodium citrate，and phenylthiourea（1∶2∶2 by volume）was best.Using citric acid-natrium，dihydrogen phosphate buffer，potassium oxalate，colchicine，Ringer solution，and a phosphate-buffered saline（PBS）buffer as inhibitors，hemagglutination in these mixtures was also inhibited.Inhibition of Cefotaxime and Sulfate Neomycin were very small. After collection and being placed for 6 h，of all inhibitors the inhibition effect of 1%sodium citrate was best.A small amount of precipitate was found in mixtures of Ringer solution，PBS buffer，citric acid-natrium，and dihydrogen phosphate when used as inhibitors.Much precipitate and hemolymph coagulation were found in the oth-er four inhibitors’mixtures.Therefore，by using sodium citrate as a hemolymph inhibitor for adult Apriona germari，hemagglutination could be effectively inhibited.［Ch，7 tab.14 ref.］

forest protection；Apriona germari；hemolymph；inhibitor；coagulation

S763

A

2095-0756（2016）05-0855-07

10.11833/j.issn.2095-0756.2016.05.018

2015-07-21；

2015-11-30

國家自然科學(xué)基金資助項目（30271086，30471399）；江蘇省教育廳高校自然科學(xué)研究面上項目（12KJD180002）

金鳳，副教授，博士，從事昆蟲生理和植物病蟲草害防治等研究。E-mail：624373065@qq.com。通信作者：嵇保中，教授，博士，從事昆蟲生理生化等研究。E-mail：jbz9885@njfu.edu.cn

浙 江 農(nóng) 林 大 學(xué) 學(xué) 報，2016，33（5）：855-861

Journal of Zhejiang A＆F University