不同雜交家系鐵皮石斛花多糖、浸出物及氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)分析

呂素華，徐　萌，張新鳳，劉京晶，斯金平

（浙江農(nóng)林大學(xué) 亞熱帶森林培育國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，浙江 臨安 311300）

不同雜交家系鐵皮石斛花多糖、浸出物及氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)分析

呂素華，徐萌，張新鳳，劉京晶，斯金平

（浙江農(nóng)林大學(xué) 亞熱帶森林培育國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，浙江 臨安 311300）

鐵皮石斛Dendrobium officinale花是鐵皮石斛藥材的非藥用部位，為測(cè)定其多糖、浸出物、氨基酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，探討3種成分之間的內(nèi)在關(guān)系，全面了解鐵皮石斛花中的物質(zhì)分布規(guī)律，利用藥典方法測(cè)定鐵皮石斛花的多糖、浸出物質(zhì)量分?jǐn)?shù)，并采用17種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品，通過酸水解法提取、異硫氰酸苯酯（PITC）柱前衍生處理樣品，結(jié)合反相高效液相色譜法（RP-HPLC）測(cè)定10個(gè)不同雜交家系鐵皮石斛花中的氨基酸組成與質(zhì)量分?jǐn)?shù)。結(jié)果表明：鐵皮石斛花中多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)平均為71.00 mg·g-1，浸出物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為300.00 mg·g-1；從鐵皮石斛花中檢測(cè)到16種氨基酸，總氨基酸平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7.88%；3種成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異顯著（P＜0.05）。利用SPSS 17.0分析3種成分之間的相關(guān)性，多糖和浸出物在合成積累上呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，與氨基酸之間相關(guān)性不明顯（P＞0.05）。鐵皮石斛花中含有較豐富的多糖、浸出物及氨基酸等營(yíng)養(yǎng)及功效成分，具有一定的保健開發(fā)價(jià)值。圖1表3參11

中草藥學(xué)；鐵皮石斛花；氨基酸；多糖；浸出物；相關(guān)性

鐵皮石斛Dendrobium officinale主要以莖入藥，其質(zhì)量主要以多糖、浸出物含量作為評(píng)價(jià)依據(jù)［1］。鐵皮石斛花雖是非藥用部位，但在栽培生產(chǎn)中產(chǎn)量較大，民間多用來制作花茶，已有報(bào)道其含有黃酮類［2］、多糖［3］、氨基酸［4］等成分。本課題組在鐵皮石斛雜交選育中發(fā)現(xiàn)：不同來源的鐵皮石斛親本雜交出來的子代鮮花在外觀、氣味、顏色等方面表現(xiàn)差異較大，但關(guān)于鐵皮石斛雜交家系鮮花在多糖、醇溶性成分、氨基酸等成分上的分布規(guī)律及質(zhì)量分?jǐn)?shù)還未見報(bào)道。本試驗(yàn)采集不同雜交家系鐵皮石斛鮮花，參照藥典方法測(cè)定多糖及浸出物質(zhì)量分?jǐn)?shù)，并以17種氨基酸為標(biāo)準(zhǔn)，采用異硫氰酸苯酯（PITC）進(jìn)行柱前衍生［5-6］，結(jié)合反相高效液相色譜法（RP-HPLC）［7］分析鐵皮石斛花中氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)，探討多糖、浸出物和氨基酸等成分之間的相關(guān)性，比較樣本之間的品質(zhì)差異，揭示鐵皮石斛花中主要營(yíng)養(yǎng)及功效成分的分布及比例，對(duì)鐵皮石斛花的品質(zhì)研究及資源開發(fā)利用具有重要的理論意義。

1　材料與方法

1.1儀器與試劑

AB104-N電子分析天平（中國梅特勒托利多儀器上海有限公司）；DK-S24型電熱恒溫水浴鍋（中國上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；D-37520型高速離心機(jī)（德國 Heraeus公司）；GENESYS 10S UV-Vis紫外分光光度儀；DHG-9070HA精密性強(qiáng)制對(duì)流干燥箱（中國杭州藍(lán)天化驗(yàn)儀器廠）； Agilent 1200高效液相色譜系統(tǒng)（美國Agilent公司，含四元梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、二極管陣列檢測(cè)器）。

安捷倫氨基酸分析柱，17種氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：天冬氨酸（Asp），谷氨酸（Glu），絲氨酸（Ser），甘氨酸（Gly），組氨酸（His），精氨酸（Arg），蘇氨酸（Thr），丙氨酸（Ala），脯氨酸（Pro），酪氨酸（Tyr），纈氨酸（Val），蛋氨酸（Met），胱氨酸（Cys），異亮氨酸（Ile），亮氨酸（Leu），苯丙氨酸（Phe），賴氨酸（Lys），購自中國天津博納艾杰爾公司。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品（購自中國藥品生物制品鑒定所，110833-200904）；重蒸酚（中國北京索萊寶科技有限公司）；其他試劑均為分析醇，水為自制蒸餾水。

1.2供試樣品

供試樣品10個(gè)雜交家系鐵皮石斛親本來自于中國主要分布區(qū)內(nèi)［8-9］，所有雜交子代鮮花均于2014 年5月12號(hào)采自浙江省義烏丹溪藥博園，雜交家系有1×6，80×27，6A×2B，78×69，9×66，森山1號(hào)，83×34，80×56，17×30，68×72。采集的鐵皮石斛花樣品均于65℃烘箱中烘干，粉碎，過60目篩，干燥器中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3方法

1.3.1多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定方法參照《中華人民共和國藥典：2010年版一部》，精密稱量不同家系鐵皮石斛花粉末各0.30 g，加入200.00 mL蒸餾水2.00 h回流提取，過濾定容至250.00 mL。移液管精密量取5.00 mL于50.00 mL離心管中，加25.00 mL無水乙醇，4℃冰箱靜置1.00 h后，4 000 r·min-1離心20.00 min，棄上清液加入體積分?jǐn)?shù)為80.00%乙醇20.00 mL離心20.00 min，重復(fù)2次，棄上清液，沉淀加水助溶，定容至50.00 mL。加1.00 mL樣品溶液于試管中，冰水中加體積分?jǐn)?shù)5.00%苯酚1.00 mL，混勻后加入5.00 mL濃硫酸，充分混勻，冰水中靜置5.00 min，沸水浴20.00 min，取出在冰水中放涼，于488.00 nm處測(cè)定吸光度，試驗(yàn)平行3次。以葡萄糖標(biāo)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為y=8.717 1x+ 0.014 7，R2=0.999，其中y為吸收度，x為質(zhì)量濃度。

1.3.2浸出物質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定方法參照《中華人民共和國藥典：2010年版一部》附錄ⅤA項(xiàng)下熱浸法測(cè)定，以體積分?jǐn)?shù)為95.00%無水乙醇做溶劑。精密稱定供試樣品2.00 g，置于100.00 mL具塞圓底燒瓶中，精密加乙醇50.00 mL，密塞稱定質(zhì)量靜置1.00 h，85℃水浴回流微沸1.00 h，放冷取下密塞并補(bǔ)足差質(zhì)量，搖勻過濾，移液管精密量取25.00 mL，置于干燥至恒量的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，105℃烘箱干燥3.00 h，干燥器冷卻30.00 min，迅速精密稱定質(zhì)量，以干燥品計(jì)算供試品中醇溶性浸出物的質(zhì)量（%），試驗(yàn)平行3次。

1.3.3氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定方法①標(biāo)準(zhǔn)溶液及試劑配制。標(biāo)準(zhǔn)溶液：氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液除胱氨酸濃度為1.25 mmol·L-1，其余16種氨基酸濃度均為2.50 mmol·L-1，置于冰箱中備用，使用前室溫放置30.00 min。異硫氰酸苯酯乙腈溶液：準(zhǔn)確移取25.00 μL一流氰酸苯酯溶液與2.00 mL乙腈混勻。三乙胺乙腈溶液：準(zhǔn)確移取1.40 mL三乙胺，乙腈定容至10.00 mL容量瓶中。正亮氨酸內(nèi)標(biāo)溶液：精確稱取正亮氨酸10.00 mg，加0.10 mol·L-1鹽酸溶液10.00 mL溶解，混勻。流動(dòng)相A（乙酸鈉緩沖鹽溶液）：精密稱取15.20 g無水乙酸鈉，去離子水1 850.00 mL，溶解后冰醋酸調(diào)pH 6.50，然后加乙腈140.00 mL，混勻，0.45 μm濾膜過濾，超聲30.00 min備用；流動(dòng)相B：體積分?jǐn)?shù)為80.00%乙腈水溶液。②色譜條件。Venusil AA氨基酸分析柱（4.60 mm×250 mm，5.00 μm），流動(dòng)相：A，B柱溫40.00℃，進(jìn)樣量10.00 μL，波長(zhǎng)254 nm，流速1.00 mL·min-1。流動(dòng)相梯度（B）：0～2.00 min，0.00%～0.00%；2.00～15.00 min，0.00%～10.00%；15.00～25.00 min，10.00%～30.00%；25.00～33.00 min，30.00%～45.00%；33.00～33.10 min，45.00%～100.00%；33.10～38.00 min，100.00%～100.00%；38.00～38.10 min，100.00%～0.00%；38.10～45.00 min，0.00%～0.00%。③樣品水解液制備。參照GB/T 5009.124-2003《食品中氨基酸的測(cè)定》。精密稱取鐵皮石斛花樣品各0.20 g，精確到0.000 1 g，置于20.00 mL水解管中，加10.00 mL含體積分?jǐn)?shù)為0.10%苯酚的6.00 mol·L-1鹽酸，振搖使樣品均勻分散于溶液中，-20.00℃冰箱冷凍3.00～5.00 min，N2封管。（105.00±1.00）℃烘箱中水解24.00 h，取出冷卻至室溫。水解液1.00 mL，濃縮至干后加1.00 mL濃度為0.10 mol·L-1鹽酸助溶，0.45 μm微孔濾膜過濾后儲(chǔ)于冰箱，衍生備用。④鐵皮石斛花水解液HPLC柱前衍生。1.50 mL離心管中分別準(zhǔn)確吸取氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液及樣品200.00 μL，加入正亮氨酸內(nèi)標(biāo)溶液20.00 μL，三乙胺乙腈溶液100.00 μL，異硫氰酸苯酯乙腈溶液100.00 μL，混勻，室溫靜置1.00 h。加入正己烷400.00 μL，振搖后放置10.00 min，取下層溶液，0.45 μm微孔濾膜過濾，待測(cè)。樣品溶液中各種氨基酸質(zhì)量濃度（mg·L-1）=f1/f2×c。其中：f1為樣品溶液中各氨基酸峰面積/內(nèi)標(biāo)峰面積；f2為混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液中各氨基酸峰面積/內(nèi)標(biāo)峰面積。c為氨基酸對(duì)照品質(zhì)量濃度（mg·L-1）。⑤氨基酸數(shù)據(jù)分析。利用方差分析比較不同家系鐵皮石斛花各氨基酸含量的差異，使用SIMCA-P統(tǒng)計(jì)軟件（Version 11.0，Umea，瑞典）進(jìn)行偏最小二乘法判別分析（PLS-DA）。該分析方法可提供變量重要性投影參數(shù)（VIP）定量估計(jì)每個(gè)單元的區(qū)分能力，VIP值可根據(jù)自己區(qū)分不同類別的能力對(duì)描述對(duì)象進(jìn)行分類［10］。以不同氨基酸含量為變量進(jìn)行偏最小二乘法判別分析（PLS-DA），分析不同家系之間氨基酸含量的差異。

2　結(jié)果與分析

2.1鐵皮石斛花多糖、浸出物質(zhì)量分?jǐn)?shù)

利用苯酚-硫酸法和熱浸法分別對(duì)不同品系鐵皮石斛花中多糖和浸出物質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如表1所示?！吨腥A人民共和國藥典：2010年版一部》中規(guī)定鐵皮石斛莖多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)不得低于250.00 mg· g-1，醇溶性浸出物不得低于65.00 g·kg-1（6.50%）。本試驗(yàn)測(cè)定鐵皮石斛花中多糖約為71.00 mg·g-1，比莖中要低；花中浸出物平均約為300.00 mg·g-1，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于藥典標(biāo)準(zhǔn)，說明其含有豐富的次生代謝物質(zhì)。由表1可以看出：不同家系間鐵皮石斛花多糖、浸出物差異顯著，其中68×72，6A×2B，78×69和森山1號(hào)4個(gè)家系鐵皮石斛花多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著高于其他家系，1×6，80×27，9×66和83×34浸出物質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著高于其他家系。

表1　不同雜交家系鐵皮石斛花中多糖及浸出物質(zhì)量分?jǐn)?shù)Table 1　Polysaccharide and extracts contents of 10 Dendrobium officinale hybrids flowers

2.2鐵皮石斛花氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)

通過酸水解、柱前衍生HPLC對(duì)鐵皮石斛花中的氨基酸進(jìn)行分析，得鐵皮石斛花液相色譜圖（圖1）。通過氨基酸指紋圖譜對(duì)比發(fā)現(xiàn)，10個(gè)家系花的氨基酸組成基本一致。與標(biāo)品相比，除了胱氨酸外共檢測(cè)到了16種氨基酸。鐵皮石斛花中含有包括蘇氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和賴氨酸等在內(nèi)的7種必需氨基酸，另外9種基本氨基酸有天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、甘氨酸、組氨酸、精氨酸、丙氨酸、脯氨酸和酪氨酸。

圖1　氨基酸標(biāo)樣和鐵皮石斛花樣品色譜圖Figure 1　HPLC chromatography of 17 amino acids standard and Dendrobium officinale flowers

由表2可知：鐵皮石斛花中總氨基酸平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為78.52 mg·g-1，其中必需氨基酸平均為30.25 mg·g-1，基本氨基酸平均為48.26 mg·g-1。在所有分析的家系中，83×34的總氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，達(dá)到98.02 mg·g-1；1×6，78×69，80×56，68×72等4個(gè)家系的總氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于80.00 mg·g-1。1×6，9×66，78×66等3個(gè)家系中必需氨基酸占總氨基酸的比例顯著高于其他家系（P＜0.05）；83× 34，68×72中基本氨基酸占總氨基酸的比例顯著高于其他家系（P＜0.05）。

在10個(gè)鐵皮石斛家系花檢測(cè)到的7種必需氨基酸平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.57～8.81 mg·g-1，7種必需氨基酸差異顯著（P＜0.05），其中異亮氨酸和亮氨酸是鐵皮石斛花中的主要必需氨基酸，顯著高于其他5種氨基酸（P＜0.05），平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為8.81 mg· g-1和6.42 mg·g-1，約占必需氨基酸總質(zhì)量分?jǐn)?shù)的50.00%以上；蛋氨酸平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)最少，僅有1.28 mg·g-1，僅占必需氨基酸的4.24%。

9種基本氨基酸在1.82～12.64 mg·g-1范圍內(nèi)。9種基本氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異顯著（P＜0.05），其中天冬氨酸顯著高于其他8種（P＜0.05），平均為12.64 mg·g-1，占基本氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的26.02%；其次是谷氨酸（9.94 mg·g-1），占20.47%；組氨酸在基本氨基酸中最低（1.82 mg·g-1），僅占基本氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的3.75%。

通過表2中不同氨基酸方差分析可知：不同家系氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異顯著（P＜0.05），且天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、甘氨酸、組氨酸、精氨酸、蘇氨酸、丙氨酸和脯氨酸對(duì)不同家系氨基酸組成貢獻(xiàn)值最大。

2.3鐵皮石斛花多糖、浸出物、氨基酸相關(guān)性分析

對(duì)鐵皮石斛花的多糖、浸出物和氨基酸進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果見表3。鐵皮石斛花中多糖和浸出物之間存在極顯著負(fù)相關(guān)，說明在鐵皮石斛花中多糖與浸出物的積累中，隨著其中一類成分的增加，另一類成分就會(huì)呈下降的趨勢(shì)。在植物開花期間，多糖作為營(yíng)養(yǎng)成分會(huì)有消耗，因而表現(xiàn)出浸出物的積累增長(zhǎng)。多糖、浸出物與氨基酸之間相關(guān)性不明顯，說明多糖、浸出物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)氨基酸的營(yíng)養(yǎng)積累影響較小。此外，必需氨基酸和基本氨基酸、總氨基酸存在極顯著正相關(guān)，基本氨基酸和總氨基酸之間存在極顯著正相關(guān)，浸出物與基本氨基酸、必需氨基酸、總氨基酸相關(guān)性不明顯。

3　討論

通過對(duì)10個(gè)鐵皮石斛花樣本的分析發(fā)現(xiàn)，鐵皮石斛花中多糖達(dá)71.00 mg·g-1，浸出物約為300.00 mg·g-1，多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)明顯低于莖條。不同家系鐵皮石斛花多糖、浸出物質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異顯著（P＜0.05），說明不同家系親本來源不同會(huì)影響鐵皮石斛花多糖、浸出物的合成積累。鐵皮石斛花的浸出物質(zhì)量分?jǐn)?shù)明顯高于莖條，周桂芬等［2］曾報(bào)道鐵皮石斛花中含有豐富的黃酮類化合物，說明黃酮類物質(zhì)是浸出物的主要組成類型之一。

表2　不同雜交家系鐵皮石斛花的氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)Table 2　Amino acids contents of 10 hybrids Dendrobium officinale flowers

本試驗(yàn)采集了10個(gè)鐵皮石斛家系的樣品，樣本量豐富，并且采用17種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸、柱前衍生HPLC分析的手段進(jìn)行氨基酸分析，較全面反映鐵皮石斛花中氨基酸的分布及質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍。鐵皮石斛花中含有豐富的氨基酸，總氨基酸大約是花干質(zhì)量的7.88%。從鐵皮石斛花酸水解樣品中共測(cè)得16種氨基酸，其中包括7種人體必需氨基酸和9種人體基本氨基酸，分別占花干質(zhì)量的3.00%和4.80%。其中異亮氨酸、亮氨酸在必需氨基酸中所占比例較高，而在基本氨基酸中天冬氨酸分布較多。龔慶芳等［4］報(bào)道，鐵皮石斛花中主要氨基酸為精氨酸、脯氨酸，但在本試驗(yàn)所有檢測(cè)樣本中精氨酸與脯氨酸分別是總氨基酸的5.79%和4.54%，而天冬氨酸是總氨基酸的16.10%，與鐵皮石斛莖條中的氨基酸分布及質(zhì)量分?jǐn)?shù)大致相當(dāng)［11］。另外，在所有樣品中未能檢測(cè)到胱氨酸，同樣在鐵皮石斛莖中也未檢測(cè)到胱氨酸［11］，說明胱氨酸在鐵皮石斛各部位中積累較少。在10個(gè)鐵皮石斛家系花樣品中，各氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)存在著顯著差異（P＜0.05），說明親本的遺傳因素會(huì)影響營(yíng)養(yǎng)成分的積累。

表3　鐵皮石斛花中多糖、浸出物與氨基酸的相關(guān)性Table 3　Correlation among polysaccharide，extracts，amino acids

鐵皮石斛花中多糖與浸出物在合成積累上呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，多糖、浸出物與氨基酸的營(yíng)養(yǎng)積累未表現(xiàn)出明顯的相關(guān)性，必需氨基酸與基本氨基酸呈顯著正相關(guān)，質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異明顯（P＜0.05）。本試驗(yàn)選取10個(gè)家系樣本進(jìn)行多糖、浸出物及氨基酸的分析，證實(shí)了鐵皮石斛花中含有較多的營(yíng)養(yǎng)及功效成分，與鐵皮石斛莖有相似的成分組成，研究結(jié)果可作為鐵皮石斛花的品質(zhì)評(píng)價(jià)的參考。此外，鐵皮石斛花在成分分布及質(zhì)量分?jǐn)?shù)上有獨(dú)特之處，有必要對(duì)它們進(jìn)行深入研究，發(fā)掘其保健功效，對(duì)鐵皮石斛花的開發(fā)利用具有深遠(yuǎn)的意義。

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Polysaccharides，extracts，and amino acids in hybrid Dendrobium officinale flowers

Lü Suhua，XU Meng，ZHANG Xinfeng，LIU Jingjing，SI Jinping
（The Nurturing Station for the State Key Laboratory of Subtropical Silviculture，Zhejiang A&F University，Lin’an 311300，Zhejiang，China）

Dendrobium officinale flowers，which have many non-medicinal folk applications，were studied to determine the distribution and correlation of substances.Using pharmacopeia methods 1）the polysaccharide content，2）the extracts，and 3）the amino acid content were determined by acid hydrolysis and phenyl iso-thiocyanate（PITC）pre-column derivatization combined with a Reversed-phase-high-performance liquid chromatography（RP-HPLC）assay.SPSS 17.0 was used for the analysis.Results showed D.officinale flowers had an average of 71.00 mg·g-1polysaccharides and 300 mg·g-1extracts；16 kinds of amino acids having 7.9%of total amino acids were found.The SPSS 17.0 analysis for the relationship of the three ingredients revealed a negative correlation for the synthetic accumulation between polysaccharide and extracts，but no significant correlation with amino acids.In all，D.officinale flowers had nutritional and functional components including polysaccharides，extracts，and amino acids offering potential health benefits.［Ch，1 fig.3 tab.11 ref.］

Chinese herbology；Dendrobium officinale flowers；amino acids；polysaccharide；extracts；correlation

S567.9

A

2095-0756（2016）05-0749-07

10.11833/j.issn.2095-0756.2016.05.004

2015-09-17；

2015-10-27

浙江省科學(xué)技術(shù)公益技術(shù)應(yīng)用項(xiàng)目（2015C32097）

呂素華，從事藥用植物遺傳改良研究。E-mail：1037420126@qq.com。通信作者：張新鳳，副教授，博士，從事天然產(chǎn)物及藥用植物質(zhì)量評(píng)價(jià)。E-mail：zhangxf73@163.com

浙 江 農(nóng) 林 大 學(xué) 學(xué) 報(bào)，2016，33（5）：749-755

Journal of Zhejiang A＆F University