甲氧基聚乙二醇-b-聚L-半胱氨酸兩親性嵌段共聚物的合成與表征

陳 洋， 肖 艷（華東理工大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，上海200237）

甲氧基聚乙二醇-b-聚L-半胱氨酸兩親性嵌段共聚物的合成與表征

陳 洋， 肖 艷
（華東理工大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，上海200237）

首先以聚乙二醇單甲醚（mPEG-OH）為單體，采用經(jīng)典的蓋布瑞爾伯胺合成法合成了端氨基聚乙二醇單甲醚（mPEG-NH2）；然后以mPEG-NH2為引發(fā)劑，S-芐基L-半胱氨酸N-羧酸內(nèi)酸酐（BCys-NCA）為原料，通過N-羧酸內(nèi)酸酐（NCA）開環(huán)聚合反應(yīng)和液氨/鈉處理脫除側(cè)鏈上的保護(hù)基團(tuán)，合成了兩親性嵌段共聚物甲氧基聚乙二醇-b-聚L-半胱氨酸（mPEG-b-PCys）。采用傅里葉變換紅外光譜、核磁共振氫譜對聚合物的結(jié)構(gòu)和組成進(jìn)行了表征。結(jié)果表明：成功制備了側(cè)鏈具有還原性巰基的兩親性嵌段共聚物mPEG-b-PCys，并且其聚合度可控性良好。

聚乙二醇單甲醚；巰基；兩親性；嵌段共聚物

生物醫(yī)用高分子材料作為高分子材料領(lǐng)域中的一大重要分支，因其在生物體診斷、治療，以及替換、修復(fù)或再生損傷組織和器官等方面的重要作用，得到了國內(nèi)外眾多研究機(jī)構(gòu)的廣泛關(guān)注［1］。與傳統(tǒng)生物醫(yī)用高分子材料相比，聚肽材料因其良好的生物相容性、生物可降解性以及獨特的二級構(gòu)象，在組織工程、細(xì)胞信號調(diào)節(jié)、生物診斷與治療、藥物運輸、藥物緩釋以及生物化學(xué)反應(yīng)催化等領(lǐng)域有著越來越廣泛的應(yīng)用［2-5］。但是大多數(shù)的聚肽材料由于嚴(yán)重的分子內(nèi)及分子間氫鍵作用，導(dǎo)致其在水中的溶解性差［6］。而聚乙二醇作為一種常用的生物醫(yī)用高分子材料，具有優(yōu)良的水溶性以及生物相容性，它無毒、無刺激性，與很多有機(jī)溶劑可以很好地相溶，因此被越來越多地用于改善疏水性聚合物的水溶性，制備具有自組裝行為的兩親性嵌段共聚物。

近年來，將聚乙二醇引入到聚肽材料中，制備聚肽基兩親性嵌段共聚物已經(jīng)成為研究的熱點：林嘉平等［7］使用端氨基聚乙二醇單甲醚（mPEG-NH2）為引發(fā)劑，引發(fā)芐基L-谷氨酸N-羧酸內(nèi)酸酐（BLG-NCA）開環(huán)聚合，制備出含有親水性聚乙二醇嵌段和疏水性聚肽嵌段的刷型聚合物，并進(jìn)一步研究了該聚合物水溶液的自組裝行為；陳學(xué)思等［8］使用mPEG-NH2為引發(fā)劑，引發(fā)L-苯丙氨酸N-羧酸內(nèi)酸酐和L-胱氨酸N-羧酸內(nèi)酸酐開環(huán)聚合，成功制備出聚乙二醇-b-聚氨基酸共聚物。隨后他們將聚合物溶解在磷酸鹽緩沖溶液（PBS）中制成聚合物納米膠束，并將阿霉素（DOX）載入到膠束內(nèi)核中。由于胱氨酸的存在將二硫鍵（S-S）引入到了納米膠束的內(nèi)核中，因此該膠束在還原劑谷胱甘肽的作用下，內(nèi)核中的二硫鍵會斷裂，進(jìn)而使膠束解體，釋放出其中所包載的DOX，實現(xiàn)了藥物在還原劑刺激條件下的控制釋放。Carmen Scholz等［9］采用mPEG-NH2為引發(fā)劑，引發(fā)帶有保護(hù)性基團(tuán)的L-谷氨酸N-羧酸內(nèi)酸酐和L-半胱氨酸N-羧酸內(nèi)酸酐單體開環(huán)聚合，然后經(jīng)過脫保護(hù)反應(yīng)制備出聚乙二醇-b-聚L-谷氨酸-b-聚L-半胱氨酸（PEG-b-PGlu-b-PCys）三嵌段共聚物。因為聚L-半胱氨酸嵌段中的巰基容易與金反應(yīng)形成Au-S鍵，因此該聚合物在金表面修飾領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景。

本文采用端氨基聚乙二醇單甲醚（mPEG-NH2）為引發(fā)劑，引發(fā)S-芐基L-半胱氨酸N-羧酸內(nèi)酸酐（BCys-NCA）開環(huán)聚合制備出兩親性嵌段共聚物甲氧基聚乙二醇-b-聚S-芐基L-半胱氨酸（mPEG-b-PBCys）。然后經(jīng)過脫保護(hù)反應(yīng)，脫除側(cè)鏈上的保護(hù)基團(tuán)（芐基），制備側(cè)鏈含有活潑性巰基的兩親性嵌段共聚物甲氧基聚乙二醇-b-聚L-半胱氨酸（mPEG-b-PCys）。因為側(cè)鏈巰基活性比較高，容易進(jìn)行多種巰基化學(xué)反應(yīng)，因此本文為后續(xù)的功能化修飾研究奠定了良好的理論基礎(chǔ)。

1　實驗部分

1.1原料及試劑

聚乙二醇單甲醚（mPEG-OH，Mw=2.0×103）、對甲苯磺酰氯、鄰苯二甲酰亞胺鉀：化學(xué)純，Sigma-Aldrich試劑公司；二氯甲烷、三乙胺、碳酸鈉：分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；甲苯、丙酮、無水乙醚、重水、氘代二甲基亞砜：分析純，上海泰坦科技股份有限公司；BCys-NCA：化學(xué)純，上海晶純生化科技股份有限公司；鈉：分析純，內(nèi)蒙古蘭太實業(yè)股份有限公司。

1.2原料的預(yù)處理

（1）mPEG-OH的干燥：將mPEG-OH（30 g）溶解在30 m L甲苯中，120℃的油浴條件下使用油水分離器和球形冷凝管蒸餾除水，重復(fù)3次。然后置于80℃的油浴條件下抽真空干燥12 h，室溫下自然冷卻后保存待用。

（2）對甲苯磺酰氯的純化：首先將對甲苯磺酰氯溶于一定比例的干燥過的甲苯-正己烷混合溶液中，然后將溶液置于60℃的油浴條件下加熱使其充分溶解，最后將其置于-20℃的冰箱中冷卻結(jié)晶，抽濾、真空干燥得到白色針狀固體產(chǎn)物。

（3）N，N-二甲基甲酰胺（DMF）、二氯甲烷（CH2Cl2）：使用氫化鈣干燥48 h，蒸餾并密封保存。

1.3實驗過程

1.3.1mPEG-NH2的制備 準(zhǔn)確稱量20 g（11.8 mmol）mPEG-OH和4.5 g（23.6 mmol）對甲苯磺酰氯加入到80 m L無水二氯甲烷中，然后加入28 m L三乙胺作為縛酸劑，室溫下攪拌反應(yīng)12 h。然后用事先配好的鹽酸溶液（1 mol/L）對反應(yīng)液進(jìn)行洗滌，直至溶液為中性。最后用無水碳酸鈉干燥12 h，減壓蒸餾除去大約2/3的溶劑。抽濾，除去溶液中的固體顆粒后，將濾液用過量的無水乙醚沉降，抽濾得到中間產(chǎn)物甲氧基聚乙二醇-對甲苯磺酸酯（mPEG-OTs）。

稱取10 g（5.9 mmol）上述反應(yīng)產(chǎn)物、1.85 g（11.8 mmol）鄰苯二甲酰亞胺鉀溶解于70 m L DMF中，120℃下攪拌反應(yīng)6 h后，減壓蒸餾除去DMF。然后再加入120 m L無水乙醇、10 m L 80%的水合肼回流反應(yīng)12 h。反應(yīng)液在大量無水乙醚中沉降、抽濾得到白色固體。將此白色固體溶解于CH2Cl2中，濾出不溶物，濾液用大量無水乙醚沉降，抽濾、真空干燥得到mPEG-NH2。

1.3.2mPEG-b-PBCys的制備 稱取7.11 g（30 mmol）BCys-NCA、4 g（2 mmol）mPEG-NH2，加入到150 m L DMF中，在氮氣保護(hù)條件下，冰水浴中反應(yīng)72 h。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液用過量的無水乙醚沉降，離心、真空干燥得到白色固體產(chǎn)物即為嵌段共聚物mPEG-b-PBCys。

1.3.3mPEG-b-PCys的制備 稱取5 g mPEG-b-PBCys加入到100 m L液氨中，切取少許鈉絲分批加入到反應(yīng)體系中（每一小塊Na加入后，反應(yīng)體系會呈深藍(lán)色，然后顏色逐漸退去，待深藍(lán)色消失后再補(bǔ)加金屬Na），干冰-丙酮浴條件下攪拌反應(yīng)8 h。反應(yīng)結(jié)束后揮發(fā)掉剩余的液氨，加入150 m L去離子水?dāng)嚢?0 min，抽濾得到澄清濾液。向濾液中滴加鹽酸至p H=5，然后將產(chǎn)物置于透析袋（截留分子量為1 000）中透析72 h。透析完成后將產(chǎn)物置于冷凍干燥機(jī)中干燥72 h，即可得到產(chǎn)物mPEG-b-PCys。

1.4測試與表征

核磁共振氫譜（1H-NMR）采用德國布魯克公司生產(chǎn)的Bruker 400 MHz核磁共振波譜儀測定，以重水（D2O）、氘代二甲基亞砜（DMSO）作為溶劑，四甲基硅烷（TMS）作為內(nèi)標(biāo)。通過質(zhì)子氫在譜圖上的各出峰位置、峰的相對面積積分比，確定聚合物的分子結(jié)構(gòu)，通過參比基準(zhǔn)物對比計算出聚合物的聚合度、數(shù)均分子量；傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）使用美國尼高力儀器公司Nicolet 5700型傅里葉紅外光譜儀測定，采用固體溴化鉀（KBr）壓片法制樣。

2　結(jié)果與討論

2.1合成路線

考慮到均聚L-半胱氨酸（PCys）的溶解性非常差，本文旨在將親水性的mPEG-OH引入到聚合物主鏈中，制備兩親性嵌段共聚物mPEG-b-PBCys。然后通過脫保護(hù)操作，將巰基上的保護(hù)基（芐基）脫除，以暴露出具有高度反應(yīng)活性的巰基基團(tuán)，為后續(xù)的修飾反應(yīng)提供反應(yīng)位點。具體的合成路線如圖1所示。

圖1　mPEG-NH2和mPEG-b-PCys的合成路線Fig.1 Synthetic routes for mPEG-NH2and mPEG-b-PCys copolymers

2.2 mPEG-NH2的結(jié)構(gòu)表征

圖2（A）為mPEG-OTs的核磁共振氫譜，聚合物中所有氫的特征峰已經(jīng)在核磁共振氫譜中標(biāo)出。d峰（苯環(huán)，7.23～7.76）和e峰（甲基，2.34）的出現(xiàn)說明末端羥基已經(jīng)成功轉(zhuǎn)變成了對甲苯磺酸酯基。圖2（B）為mPEG-NH2的核磁共振氫譜，與圖2（A）相比，聚合物在7.23～7.76（d峰）和2.34（e峰）處的吸收峰已經(jīng)全部消失，表明末端的對甲苯磺酰基已經(jīng)成功脫除，在1.83處出現(xiàn)了一個新的吸收峰，經(jīng)重水交換反應(yīng)驗證為末端氨基上活潑氫的吸收峰。因此，可以確定本文成功制備出了mPEG-NH2。

圖2　mPEG-OTs（A）和mPEG-NH2（B）的核磁共振氫譜Fig.21H-NMR spectra of mPEG-OTs（A）and mPEG-NH2（B）

2.3mPEG-b-PBCys的結(jié)構(gòu)表征

圖3為mPEG-b-PBCys的核磁共振氫譜。從圖中可以看出產(chǎn)物中各個吸收峰都能找到相應(yīng)的歸屬。其中3.23處為mPEG嵌段中末端甲基的吸收峰（a峰），7.23～7.76處為PBCys嵌段中苯環(huán)的吸收峰（g峰），3.67處為與苯環(huán)相連的亞甲基的吸收峰（f峰）。根據(jù)a峰和g峰的面積比可以算出產(chǎn)物的實際聚合度為21，設(shè)計聚合度為20，實際聚合度與設(shè)計聚合度有一定的差別，推測原因是mPEG-NH2的活性較低，有少量引發(fā)劑未能成功引發(fā)聚合反應(yīng)，所以造成實際聚合度略高于理論聚合度。

圖4為mPEG-b-PBCys的紅外光譜，圖中1 630 cm-1和1 517 cm-1處為PBCys嵌段中羰基和仲胺的吸收峰，1 500～2 000 cm-1處鋸齒狀吸收峰為側(cè)鏈芐基吸收峰。綜合核磁和紅外結(jié)果可知，mPEG-b-PBCys被成功合成。

圖3　mPEG-b-PBCys的核磁共振氫譜Fig.31H-NMR spectrum of mPEG-b-PBCys

圖4　mPEG-b-PBCys的紅外光譜Fig.4 FT-IR spectrum of mPEG-b-PBCys

2.4mPEG-b-PCys的結(jié)構(gòu)表征

圖5為mPEG-b-PCys的核磁共振氫譜。從圖中可以看出：與mPEG-b-PBCys的核磁結(jié)果相比較，在7.23～7.76處的苯環(huán)的吸收峰和在3.67處與苯環(huán)相連的亞甲基的吸收峰（f峰）同時消失，其他吸收峰并沒有顯著變化，并且各個吸收峰都能找到相應(yīng)的歸屬。為了進(jìn)一步確定芐基脫除后是否成功暴露出了活潑的巰基，又對產(chǎn)物mPEG-b-PCys進(jìn)行了傅里葉變換紅外光譜表征（圖6），與mPEG-b-PBCys的結(jié)果相比，在1 500～2 000 cm-1處的鋸齒狀的吸收峰全部消失，在2 550 cm-1處出現(xiàn)了巰基的吸收峰。綜合核磁和紅外結(jié)果可知，本文成功制備出了兩親性嵌段共聚物mPEG-b-PCys。

圖5　mPEG-b-PCys的核磁共振氫譜Fig.51H-NMR spectrum of mPEG-b-PCys

圖6　mPEG-b-PCys的紅外光譜Fig.6 FT-IR spectrum of mPEG-b-PCys

3　結(jié) 論

（1）采用經(jīng)典的蓋布瑞爾伯胺合成法（Gabriel method），通過聚乙二醇單甲醚與對甲苯磺酰氯、鄰苯二甲酰亞胺鉀、水合肼反應(yīng)，成功制備了大分子引發(fā)劑端氨基聚乙二醇單甲醚mPGE-NH2。

（2）以mPGE-NH2為引發(fā)劑，引發(fā)BCys-NCA單體開環(huán)聚合，制備出兩親性嵌段共聚物mPEG-b-PBCys。

（3）通過脫保護(hù)反應(yīng)，成功將mPEG-b-PBCys側(cè)鏈上的芐基脫除，制備出兩親性嵌段共聚物mPEG-b-PCys。由于側(cè)鏈上的巰基化學(xué)性質(zhì)非常活潑，因此為后續(xù)反應(yīng)提供了反應(yīng)位點。

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Synthesis and Characterization of Poly（ethylene glycol）-b-Poly（L-cysteine）Block Copolymer

CHEN Yang， XIAO Yan
（School of Materials Science and Engineering，East China University of Science and Technology，Shanghai 200237，China）

Amine-terminated mPEG（mPEG-NH2）was first synthesized by Gabriel method using mPEG-OH as the monomer.Methoxy poly（ethylene glycol）-b-poly（L-cysteine）（mPEG-b-PCys）amphiphilic block copolymers were further synthesized by ring opening copolymerization of S-benzyl L-cysteine N-carboxyanhydride（BCys-NCA）initiated with the amine terminated mPEG and followed by the removal of the protected groups using liquid NH3/Na.The structures of the polymers were characterized by Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy（1H-NMR）and Fourier Transform Infrared spectroscopy （FT-IR）.Results showed that the amphiphilic block copolymers containing active thiol groups were synthesized successfully，and the degree of polymerization was controllable.

poly（ethylene glycol）；thiol group；amphiphilic；block copolymer

TQ317

A

1008-9357（2016）02-0188-005DOI： 10.14133/j.cnki.1008-9357.2016.02.007

2016-05-08

陳 洋（1989-），男，山東濟(jì)寧人，碩士生，主要研究方向為功能化聚肽材料的合成及其性能研究。E-mail：ychen_ecust@163.com

肖 艷，E-mail：yxiao@ecust.edu.cn