基于高效液相色譜法對(duì)不同提取條件下竹葉黃酮中牡荊苷含量的分析

華　梅　譚　芮　王　毅　繆?？　￡悺Α●R惠芬　楊宇明　王　娟

(云南省林業(yè)科學(xué)院，云南省森林植物培育與開(kāi)發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家林業(yè)局云南珍稀瀕特森林植物保護(hù)和繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650201)

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基于高效液相色譜法對(duì)不同提取條件下竹葉黃酮中牡荊苷含量的分析

華梅譚芮王毅繆?？￡悇︸R惠芬楊宇明王娟

(云南省林業(yè)科學(xué)院，云南省森林植物培育與開(kāi)發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家林業(yè)局云南珍稀瀕特森林植物保護(hù)和繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650201)

用高效液相色譜對(duì)竹葉黃酮中牡荊素進(jìn)行分析，并對(duì)其含量進(jìn)行了測(cè)定，同時(shí)研究了提取溶劑比、料液比和提取時(shí)間對(duì)牡荊素含量的影響。結(jié)果表明：最佳的提取條件為，提取溶劑比為70%乙醇水，料液比為1∶20，提取時(shí)間為2.0 h。采用牡荊苷作為外標(biāo)物，建立牡荊苷標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：m=4.725 × 10-7A+ 0.042 5 (R2=0.999)。在最佳的提取條件下，采用大孔樹(shù)脂對(duì)提取物進(jìn)行純化，對(duì)竹葉黃酮中牡荊素的含量進(jìn)行測(cè)定，灰金竹中牡荊素的含量為 (1.01% ± 0.07%)。

竹葉黃酮；牡荊素；提取條件；外標(biāo)法；高效液相色譜

竹葉的醫(yī)療保健作用早已為中國(guó)人所認(rèn)識(shí)， 《本草綱目》 記載：苦竹 (Pleioblastusamarus)葉具有明目利九竅、治不睡、止消渴、解酒毒等作用；淡竹 (Phyllostachysnigravar.henon) 葉具有鎮(zhèn)靜、解熱、止咳和止血的功效[1]。 《中藥大辭典》 記載：淡竹葉有清熱解煩，生津利尿；治熱病煩渴，小兒驚癇，咳喘吐血，面赤，小便短赤，口糜舌瘡等功用[2]。近年研究表明，竹葉提取物具有優(yōu)良的抗自由基、抗氧化、抗衰老、抗菌、殺蟲(chóng)、調(diào)節(jié)血脂以及保護(hù)心腦血管等生物活性和藥理功效[3-6]。 竹提取物的毒理學(xué)安全性評(píng)價(jià)結(jié)果表明：小鼠經(jīng)口致死中量 (LD50) 大于10 g/kg。根據(jù)LD50的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，竹提取物為實(shí)際無(wú)毒[7]。竹子的生長(zhǎng)周期短，在中國(guó)絕大多數(shù)地區(qū)都能種植，生物資源量非常豐富。但目前竹子的大量利用僅限于竹筍、竹屋、竹裝飾品等竹原料產(chǎn)品，對(duì)竹子的副產(chǎn)品竹葉的開(kāi)發(fā)利用較少。

竹葉具有非常高的藥用價(jià)值，竹葉中主要的活性物質(zhì)為黃酮，將竹子中竹葉黃酮進(jìn)行深入的開(kāi)發(fā)利用，將對(duì)人類的健康具有重大意義。目前已報(bào)道的竹提取物的化學(xué)成分包括黃酮、苷類、活性多糖類、特種氨基酸、肽類、芳香成分以及錳、鋅、硒等多種微量元素[8-9]。黃酮具有2-苯基色原酮結(jié)構(gòu)化合物的總稱，在植物中普遍存在。竹提取物中發(fā)現(xiàn)的黃酮類化合物主要是黃酮苷， 以在6、8位的碳苷黃酮為主， 如葒草苷、異葒草苷、牡荊苷和異牡荊苷等[10]。

牡荊素 (牡荊苷) 主要用于治療心血管疾病，已有成藥注射用牡荊素用于臨床醫(yī)療。牡荊素主要功能是活血化瘀，理氣通脈。用于瘀血阻脈所致的胸痹，癥見(jiàn)胸悶憋氣，心前區(qū)刺痛、心悸健忘、眩暈耳鳴。冠心病心絞痛、高脂血癥、心動(dòng)脈供血不足等癥候者[11-12]。目前牡荊素主要來(lái)源于薔薇科植物山楂 (Crateaguspinnatifida) 干燥成熟的果實(shí)中，而山楂果實(shí)的資源量有限，從資源量大的其他植物中開(kāi)發(fā)牡荊素具有非常重要的意義。竹子種植面積大，而且能在條件苛刻的地區(qū)生長(zhǎng)，資源豐富，因此從竹葉中開(kāi)發(fā)牡荊素，建立牡荊素的分析檢測(cè)方法，對(duì)竹葉產(chǎn)品及牡荊素的開(kāi)發(fā)利用具有非常重要的意義。

基于竹葉黃酮中牡荊素具有較高的藥用價(jià)值，因此，研究竹葉黃酮中牡荊素含量的測(cè)定對(duì)產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)非常重要。本研究采用高效液相色譜法對(duì)竹葉黃酮提取物中牡荊素的含量進(jìn)行分析測(cè)定，直接采用牡荊苷作為外標(biāo)法的標(biāo)準(zhǔn)品，使得測(cè)量結(jié)果更為準(zhǔn)確。同時(shí)考察了不同提取條件 (料液比、提取溶劑比、提取時(shí)間) 對(duì)竹葉黃酮提取物中牡荊苷含量的影響，采用大孔樹(shù)脂對(duì)提取物進(jìn)行純化，為竹葉黃酮中牡荊素產(chǎn)品開(kāi)發(fā)及利用提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1竹葉樣品預(yù)處理

將新鮮竹葉先以清水漂洗，再以蒸餾水沖洗，自然晾干后，用微型植物粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，過(guò)60目篩備用。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1竹葉黃酮中牡荊素提取條件的優(yōu)化

精確稱取干燥粉碎的竹葉 2 g (5份)，置于250 mL圓底燒瓶中，加入乙醚50 mL，過(guò)夜萃取以除去脂溶性成分，過(guò)濾，棄去乙醚部分溶液。再分別加入 0%、30%、60%、70%、95% (v/v) 乙醇水溶液，料液比分別設(shè)為1∶1、1∶5、1∶10、1∶20、1∶30、1∶50。加熱回流，70 ℃回流3次。提取時(shí)間設(shè)置為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h?；亓骱?，合并3次回流液，過(guò)濾，取上述各乙醇回流后的提取液，分別用3倍石油醚萃取3次，留取下層溶液，濃縮待用。通過(guò)提取試驗(yàn)，分別考察提取時(shí)間、溶劑比和料液比對(duì)竹葉黃酮中牡荊素含量的影響，確定最佳的提取條件。

1.2.2大孔樹(shù)脂的預(yù)處理

大孔樹(shù)脂參照文獻(xiàn) [1,3] D101 (非極性樹(shù)脂) 的方法處理，先用95%的乙醇溶液充分浸泡，然后用乙醇漂洗，當(dāng)洗出液加適量水后無(wú)白色渾濁，再用去離子水洗盡乙醇，轉(zhuǎn)入酸堿處理。用 5% HCl 溶液浸泡3 h，然后用去離子水洗至pH為中性；接著用質(zhì)量濃度50 g/L NaOH溶液浸泡3 h；最后用去離子水洗至pH為中性。

1.2.3樣品純化

將處理好的大孔樹(shù)脂裝柱，做好標(biāo)記。將不同溶劑比的提取液濃縮后分別直接上柱，收集直接流下來(lái)的溶液做好標(biāo)記。接著用水沖洗，收集流下的溶液。再用70%乙醇-水沖洗，當(dāng)洗脫液無(wú)黃酮顯色反應(yīng)后濃縮，得到較純的總黃酮提取液。

1.3高效液相色譜法測(cè)定竹葉黃酮中牡荊苷的含量

1.3.1樣品溶液的準(zhǔn)備

將上述經(jīng)過(guò)大孔樹(shù)脂純化的各提取液用含量70%乙醇定容至250 mL，以測(cè)定竹葉黃酮中牡荊苷的含量。將上述提取液分別過(guò)0.45 μm濾膜，用于HPLC分析。

1.3.2標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的準(zhǔn)備

準(zhǔn)確稱取25 mg牡荊素標(biāo)準(zhǔn)樣品，用無(wú)水乙醇溶解定容至25 mL，配成100 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液備用。將標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液分別過(guò)0.45 μm濾膜，用于HPLC分析。

1.3.3高效液相色譜條件

色譜儀： Agilent 1260型高效液相色譜儀，Ecli-

pse plus C18色譜柱 (4.6 × 150 mm, 5 μm)。

流動(dòng)相：A為水 (1%乙酸)，B為甲醇，流速為1.0 mL/min，溫度為30 ℃

洗脫條件 (梯度洗脫)：平衡20% B，20%～60% B (15 min)，60%～80% B (10 min)

檢測(cè)波長(zhǎng)：330 nm

1.3.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

將上述配好的100 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液以0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 μL的濃度梯度進(jìn)樣，在上述色譜條件下檢測(cè)，測(cè)定結(jié)果用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.5竹葉黃酮中牡荊素提取液含量的測(cè)定

在上述色譜條件下，分別取5.0 μL定容好的提取液進(jìn)樣，采用外標(biāo)法測(cè)定各提取液中牡荊苷的含量。

1.4數(shù)據(jù)處理

采用高效液相色譜面積歸一化法及外標(biāo)法，測(cè)定最佳提取方法下不同竹子中牡荊素的含量。

2　結(jié)果與分析

2.1標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖及曲線

牡荊苷的HPLC色譜圖見(jiàn)圖1。從圖1可以看出，牡荊苷的保留時(shí)間Rt為10.522。牡荊苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖2，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：m=4.725 × 10-7A+ 0.042 5 (R2=0.999)。

圖1牡荊苷色譜圖

Fig.1Chromatogram of Vitexin

圖2牡荊苷標(biāo)準(zhǔn)曲線

Fig.2Calibration curve of Vitexin

2.2灰金竹樣品色譜圖

灰金竹樣品的色譜圖見(jiàn)圖3。從圖3可以看出，灰金竹黃酮提取液中存在的成分較多。但是在大孔樹(shù)脂純化下，根據(jù)高效液相色譜面積歸一化可知，雖然雜峰比較多，但是樣品中40%的物質(zhì)主要為牡荊苷。

2.3提取溶劑比例對(duì)牡荊苷含量的影響

通過(guò)高效液相色譜外標(biāo)法，對(duì)不同溶劑比提取下灰金竹中牡荊素含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1。從表1可知，灰金竹在70%的提取溶劑比下牡荊素的含量更高一些，后續(xù)條件的優(yōu)化在70%的提取溶劑比下進(jìn)行。

圖3灰金竹樣品的色譜圖

Fig.3　Chromatogram of Phyllostachys nigra var. henonis Stapf ex Rendleis

2.4料液比對(duì)竹葉黃酮含量的影響

在最佳的提取溶劑比下，分別考察了料液比對(duì)竹葉黃酮中牡荊苷含量的影響。料液比分別為1∶1、1∶5、1∶10、1∶20、1∶30、1∶50，不同料液比竹葉黃酮中牡荊苷含量見(jiàn)圖4。當(dāng)料液比達(dá)到1∶20以后，竹葉黃酮中牡荊素的含量變化幅度減小，增加提取溶劑對(duì)牡荊素的得率沒(méi)有多大影響。考慮到實(shí)驗(yàn)及生產(chǎn)成本，特選取1∶20的料液比為最佳的提取條件。

圖4料液比對(duì)牡荊苷含量的影響

Fig.4Influence of solid-liquid ratio on Vitexin content

2.5提取時(shí)間對(duì)竹葉黃酮中牡荊苷含量的影響

在最佳的提取溶劑及料液比下，分別考察了提取時(shí)間對(duì)竹葉黃酮中牡荊苷含量的影響，提取時(shí)間比分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h。由圖5可知，當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到2.0 h后，再增加提取時(shí)間，牡荊苷的含量增加不大?？紤]到實(shí)驗(yàn)和實(shí)際生產(chǎn)成本，選取2.0 h作為竹葉黃酮中牡荊苷最佳的提取時(shí)間。

圖5提取時(shí)間對(duì)牡荊苷含量的影響

Fig.5 Influence of extraction time on Vitexin content

2.6HPLC對(duì)竹葉黃酮提取物中牡荊苷含量的測(cè)定

在最佳的提取條件下，即提取溶劑比為70%乙醇水，料液比為1∶20，提取時(shí)間為2.0 h。在大孔樹(shù)脂純化后，通過(guò)HPLC對(duì)灰金竹黃酮提取物中牡荊苷的含量進(jìn)行5次測(cè)定 (n=5)，牡荊苷含量測(cè)定結(jié)果分別1.08%、1.03%、0.89%、1.02%、1.04%，平均值為1.01%。從分析結(jié)果可知，灰金竹中牡荊苷的含量為1.01% ± 0.07%，與文獻(xiàn) [14] 報(bào)道的相近。因此，灰金竹可作為牡荊苷產(chǎn)品開(kāi)發(fā)的又一新資源。

3　結(jié)論與討論

本研究通過(guò)高效液相色譜外標(biāo)法對(duì)竹葉黃酮提取物中牡荊苷進(jìn)行了分析并對(duì)含量進(jìn)行了測(cè)定，研究直接采用牡荊苷作為外標(biāo)法的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品，使得竹葉黃酮提取物中牡荊苷的含量測(cè)量結(jié)果更為準(zhǔn)確。研究同時(shí)考察了牡荊苷提取所需溶劑比、料液比和提取時(shí)間對(duì)竹葉黃酮中牡荊苷含量的影響，結(jié)果表明，最佳的提取條件為：提取溶劑比為70%乙醇-水，料液比為1∶20 (g/V)，提取時(shí)間為2.0 h。采用大孔樹(shù)脂對(duì)提取物進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化的目的是除去提取液中的多糖，使測(cè)試結(jié)果更為準(zhǔn)確。在最佳的提取條件下，對(duì)竹葉黃酮中牡荊苷的含量進(jìn)行了測(cè)定，灰金竹中牡荊素的含量為1.01% ± 0.07%。竹葉黃酮提取物中牡荊素含量測(cè)定方法的考察，為竹葉成為牡荊苷開(kāi)發(fā)的新資源提供參考依據(jù)。

[1]錢(qián)超塵.《本草綱目》 詳譯[M]. 太原: 山西科學(xué)技術(shù)出版社, 1999.

[2]南京中醫(yī)藥大學(xué). 中藥大辭典[M]. 上海: 上?？茖W(xué)技術(shù)出版社, 2006.

[3]梁倩, 鄭艷玲, 劉云, 等. 野龍竹竹葉黃酮含量及其抗氧化活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)[J]. 西部林業(yè)科學(xué), 2013, 42(2): 110-112.

[4]方菊. 竹葉黃酮的提取分離及抑菌效果研究[D]. 合肥: 合肥工業(yè)大學(xué), 2012.

[5]Hu C, Zhang Y, David D K. Evaluation of antioxidant and prooxidantactivities of Bamboo Phyllostachy snigravar. Henonis leaf extractinvitro[J]. Jagric Food Chem, 2000, 48(8): 3170-3176.

[6]戴承恩. 楊梅黃酮降血糖和竹葉黃酮降血脂的分子作用機(jī)制初探[D]. 杭州: 浙江工業(yè)大學(xué), 2014.

[7]沈健, 馮磊. 竹葉提取物降低小鼠脂質(zhì)過(guò)氧化、升高GSH-Px和SOD活力的作用研究[J]. 現(xiàn)代康復(fù), 1999, 3(3): 334-336.

[8]童曉濱, 謝妤, 宋衛(wèi)軍. 原子吸收光度法測(cè)定雷竹葉中部分微量元素[J]. 石家莊學(xué)院學(xué)報(bào), 2010, 12(6): 25-28.

[9]賴炘, 陳其兵. 竹葉提取物的化學(xué)成分及其生理功能研究進(jìn)展[J]. 福建林業(yè)科技, 2013, 39(1): 214-220, 226.

[10]張英. 天然功能性添加劑—竹葉提取物[J]. 精細(xì)與專用化學(xué)品, 2002, 10(7): 20-22.

[11]張雪, 徐道華. 牡荊苷的藥理作用研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào), 2013, 34(35): 35-38, 42.

[12]顧成波, 蔡曼, 袁肖寒, 等. 牡荊苷的植物資源及藥理作用研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)中藥雜志, 2015, 60(3): 382-389.

[13]陸志科, 謝碧霞. 大孔樹(shù)脂對(duì)竹葉黃酮的吸附分離特性研究[J]. 經(jīng)濟(jì)林研究, 2003, 21(3): 1-4.

[14]王暉, 陳梅榮, 劉良玉. HPLC法測(cè)定竹葉提取物中葒草苷、異葒草素、牡荊素和異牡荊素的含量[J]. 江西中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào), 2014, 26(2): 58-60.

(責(zé)任編輯韓明躍)

Analysis for Vitexin Content of Bamboo Leaves Flavonoids in Different Extraction Condition with High Performance Liquid Chromatography (HPLC)

Hua Mei, Tan Rui, Wang Yi, Miao Fujun, Chen Jian, Ma Huifen, Yang Yuming, Wang Juan

(Key Laboratory of Forest Plants Cultivation & Development and Utilization of Yunnan Province/Key Laboratory of Conservation and Breeding of Rare and Endangered Forest Plants in Yunnan Province of State Forestry Administration, Yunnan Academy of Forestry, Kunming Yunnan 650201, China)

We studied the Vitexin in flavonoids of bamboo leaves and measured the content with HPLC external standard method, simultaneously investigated the influences of extraction solvent ratio, solid to liquid ratio, and extraction time on the content of Vitexin in flavonoids of bamboo leaves. The results showed that the optimum extraction conditions were: extraction solvent ratio was 70% ethanol-water, solid-liquid ratio was 1∶20, extraction time was 2.0 h. We established the standard curve equationm=4.725 × 10-7A+ 0.042 5 (R2=0.999), using Vitexin as external standard substance and purifying extract with Macroporous resin. Under the optimum extraction conditions, the Vitexin content inPhyllostachysnigravar.henonisStapf ex Rendle was (1.01% ± 0.07%).

bamboo leaves flavonoids, Vitexin, extraction condition, external standard method, high performance liquid chromatography (HPLC)

10. 11929/j. issn. 2095-1914. 2016. 05. 027

2015-10-18

云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究重點(diǎn)項(xiàng)目 (2013FA054)；云南省科技計(jì)劃 (對(duì)外科技合作計(jì)劃) (2014IA013)；云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究計(jì)劃青年項(xiàng)目 (2014FD069)；國(guó)家林業(yè)公益性行業(yè)科研專項(xiàng)項(xiàng)目 (201204110)；云南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金；云南省科技計(jì)劃 (對(duì)外科技合作計(jì)劃-國(guó)際科技合作) (2015IA005)；亞太森林網(wǎng)絡(luò) (APFNet)-聯(lián)合國(guó)大學(xué) (UNU) 跨國(guó)森林植被恢復(fù)項(xiàng)目 (600UU-1123)。

王娟 (1966—)，女，教授。研究方向：分子生物學(xué)與植物化學(xué)研究。Email: schima@163.com。

S795; Q946.8

A

2095-1914(2016)05-0164-05

第1作者：華梅 (1986—)，女，助理研究員。研究方向：森林植物有用成分研究。Email: huamm2005@163.com。